使用异硫氰酸荧光素-多聚蔗糖70对小鼠肾小球通透性进行高灵敏度测量

摘要

本文介绍了一种使用高灵敏度、非放射性示踪剂检测小鼠肾小球通透性的实验方案。该方法可利用少量尿液样本进行多次重复的尿液分析。

摘要

尿液中白蛋白的丢失（即白蛋白尿）可预测心血管疾病预后。在生理条件下，少量白蛋白经肾小球滤过，并在肾小管系统中被重吸收，直至达到重吸收极限。因此，当病理性白蛋白滤过早期轻度增加时，仅通过分析白蛋白尿可能无法检出。故而，采用示踪剂检测肾小球通透选择性具有优势。可使用荧光素异硫氰酸盐（FITC）标记的多聚蔗糖（即FITC-菊粉）作为示踪剂来研究肾小球通透选择性。FITC-多聚蔗糖分子可自由通过肾小球滤过膜，但在肾小管系统中不被重吸收。在小鼠和大鼠中，已有研究采用技术上较复杂的方法（如放射性测定、高效液相色谱法[HPLC]、凝胶过滤）检测FITC-多聚蔗糖以评估肾小球通透性。我们对基于FITC-多聚蔗糖示踪剂的实验方案进行了改进和简化，用于检测小鼠肾小球对FITC-多聚蔗糖70（大小与白蛋白相近）通透性的早期及轻微升高。该方法允许使用少量尿液（5 µL）进行重复尿液分析。本方案包含FITC-多聚蔗糖70示踪剂静脉注射操作，以及通过简易尿道导管收集尿液的方法。尿液样本通过荧光酶标仪进行检测，并以尿液浓度标志物（肌酐）进行标准化校正，从而避免了技术复杂的检测流程。

引言

肾小球滤过屏障的功能或结构缺陷会增加其对白蛋白的通透性，导致尿液中可检测到白蛋白（白蛋白尿）。白蛋白尿可预测心血管疾病预后，是肾小球损伤的重要标志物¹。即使白蛋白尿水平处于正常范围内，也与心血管风险增加相关¹。

在生理条件下，白蛋白可经肾小球滤过，并在肾小管系统中几乎被完全重吸收^2,3。在小鼠中，通常通过收集24小时尿液，采用白蛋白酶联免疫吸附测定法（ELISA）来检测尿液中的白蛋白。若使用24小时尿液收集样本或随机尿样，由于检测方法的灵敏度问题，可能无法发现白蛋白浓度的微小差异。因此，大多数研究人员采用通过毒素、药物或肾脏手术引起明显肾损伤的动物模型，以诱导产生白蛋白尿。

因此，发现一种能够检测肾小球通透性微小且短暂变化的灵敏方法，对该领域具有重要意义。Rippe 等人提出了一种通过应用荧光标记示踪剂（即与荧光素异硫氰酸盐标记的70 kDa多蔗糖，亦称FITC-Ficoll 70）来检测大鼠肾小球通透性的模型，该示踪剂大小与白蛋白相当⁴。该示踪剂方法可用于检测肾小球通透性的短期变化（数分钟内），且具有很高的灵敏度⁴。已有两项研究在小鼠中应用了该示踪剂方法^5,6。尽管该方法具有诸多优势，但也不幸存在一些缺点：技术操作极为复杂，涉及放射性物质，且具有侵入性。此外，尿液的进一步分析必须依赖凝胶过滤或尺寸排阻高效液相色谱法才能完成^5,6。

本文中，我们介绍了一种替代性的、灵敏的、非放射性的快速方法，用于通过荧光标记的FITC-多聚蔗糖70测定小鼠肾小球通透性。通过经尿道插入导管，尿液采集比膀胱穿刺、尿道切开术和经皮膀胱造瘘导管置入更为微创，并可实现至少每30分钟一次的尿液收集。使用荧光酶标仪，仅需少量尿液（5 µL）即可完成尿液分析。利用酶法肌酐检测试剂盒，将尿液中示踪剂的浓度归一化为尿液中的肌酐浓度。

因此，这种新方法提供了一种敏感的工具，可用于研究伴有肾小球通透性增加的早期肾小球损伤。

方案

研究按照《实验动物护理和使用指南》（美国国立卫生研究院出版物第85-23号，1996年修订版）中规定的指南进行。所有动物实验均依照相关机构的批准（德国州政府自然、环境与消费者保护局 [LANUV] 批准编号84-02.04.2012.A397）执行。

1. 仪器、溶液和设备的准备

1. 用0.9%无菌氯化钠（NaCl）溶液重悬FITC-聚蔗糖70，配制成终浓度为10 mg/mL的溶液（例如，将100 mg FITC-聚蔗糖70溶于10 mL NaCl溶液中）。
2. 将FITC-聚蔗糖70溶液在4 °C条件下透析过夜，以去除游离的FITC分子（截留分子量[MWCO]为10,000）。每10 mL FITC-聚蔗糖70溶液使用1 L 0.9%无菌NaCl溶液，并持续搅拌。避光操作。将透析后的FITC-聚蔗糖70分装后于-20 °C保存。
3. 配制FITC-聚蔗糖70团注溶液：取4 µL 10 mg/mL的FITC-聚蔗糖70溶液加入996 µL 0.9% NaCl溶液中（FITC-聚蔗糖70的终浓度为40 µg/mL）。
4. 配制平衡输注液：取20 µL 10 mg/mL的FITC-聚蔗糖70溶液加入9.98 mL 0.9%无菌NaCl溶液中，得到终浓度为20 µg/mL的溶液。
5. 配制实验用输注液：将药物或待测物质加入输注液中（例如，对一只25 g小鼠给予血管紧张素II [Ang II] [100 ng/kg/min]，需加入3 µL 1 mM的Ang II溶液）。
6. 手术准备：准备一把剃毛刀、两个手术钳、一把手术剪、两把镊子、两把精细镊子、一把精细剪以及棉签。另备两根10 cm长的丝线（4-0至6-0）用于结扎操作。
7. 中心静脉导管置入准备：准备一支10 mL注射器和21 G针头。将针头尖端插入一根30 cm长的导管中（内径[ID]为0.58 mm）。将0.58 mm导管连接至一根10 cm长的导管（内径为0.28 mm）。将较细导管的尖端斜向剪裁，形成锐利尖端，以便插入颈静脉。
8. 准备麻醉剂（例如，腹腔注射麻醉剂：按体重给予氯胺酮100 mg/kg和赛拉嗪5 mg/kg）。
9. 准备22 G套管针：弃去针芯，并在导管距尖端1 cm处做标记。将加热垫预热至37 °C。
10. 准备血压测量装置，并在必要时更换血压传感器膜。

2. 准备阶段

1. 导尿管
   注意：第2.1节遵循Reis等人⁷所描述的实验方案。图1和补充图1展示了在雌性小鼠中放置导尿管的位置。
   1. 使用氯胺酮/赛拉嗪对小鼠进行麻醉（见步骤1.8）。通过脚趾夹捏试验确认麻醉效果。为维持麻醉状态，每60分钟重复给予一次麻醉剂（例如，剂量减半）。 若脚趾夹捏试验未引起反射性回缩，则表明麻醉充分。
      注意：本实验方案使用雌性FVB小鼠。
   2. 将小鼠仰卧位固定于37 °C加热垫上。拉紧下腹部，并找到尿道口（例如，在显微镜下观察）。
   3. 使用22 G套管针的塑料导管部分，并以利多卡因凝胶润滑。沿远端尿道轴线方向，小心地将导管插入尿道口内3 mm（图1A）。
   4. 保持导管尖端位于尿道口内，同时维持尿道轴线方向，将套管针顶端旋转180°（图1B）。
   5. 继续将导管向小鼠体内推进7 mm，使其进入膀胱内（图1C）。遇到阻力时切勿强行推进。若感到阻力，应从初始位置重新调整导管方向。请注意，若导尿管位置正确，尿液可能已开始流入导管中。
   6. 将一个1.5 mL棕色离心管套在套管针顶端以收集尿液。皮下注射1 mL 0.9% NaCl以促进尿液生成。
2. 中心静脉导管
   1. 剃除小鼠颈部毛发，将其仰卧放置，头部朝向手术者。用胶带固定并过度伸展小鼠头部。
   2. 用70%异丙醇对颈部进行消毒。使用镊子和剪刀在下颌线下方做一个小皮肤切口（5 mm），然后沿胸骨方向继续切开皮肤约1 cm，直至胸骨中段。
   3. 使用剪刀小心分离颈部右侧皮下组织。在小鼠右侧做一个矩形皮肤切口，暴露颈部软组织。使用剪刀和镊子操作，并用两个夹子固定皮瓣。
      注意：颈静脉沿甲状腺左侧走行，或被甲状腺右叶轻微覆盖。完成此步骤后，后续手术应在显微镜下进行。
   4. 使用精细镊子的尖端钝性分离，小心暴露颈静脉。避免损伤静脉分支。
      注意：可能需要使用精细剪刀去除部分组织。使用剪刀去除组织时需格外小心，以免增加出血风险。
   5. 在可见的颈静脉远端（靠近小鼠头部一侧）用丝线（4-0至6-0）结扎并打结。通过胶带固定丝线，使结扎线保持轻微张力，从而牵拉颈静脉。同时在颈静脉近端预备另一根结扎线。
   6. 用平衡输注液（见步骤1.4）充满导管，并用胶带固定导管，使其与颈静脉走行方向一致。检查是否存在气泡，以防止空气栓塞。
   7. 用精细镊子在预定穿刺部位提起颈静脉（穿刺点位于结扎线近端1–2 mm处）。使导管与颈静脉平行，穿刺静脉并进入管腔，插入深度约为2–4 mm，沿颈静脉轴线方向推进。避免任何快速或剧烈动作。
   8. 收紧结扎线以固定导管。在显微镜下仔细观察结扎线的紧密程度。手术部位覆盖湿润棉签。
3. 血压测量
   1. 当小鼠处于仰卧位时，将尾套放置于尾部底部。开始测量，每个时间点重复测量10次。取测量值的平均值作为结果。
   2. 若血压测量结果异常或出现错误数据，应调整尾套位置。

3. 平衡阶段

1. 在平衡阶段开始前更换尿液收集管，并将其置于冰上。
2. 将装有FITC平衡液（见步骤1.4）的10 mL注射器连接21 G针头和较粗的导管（内径0.58 mm），并将其放入注射泵中。
3. 将棉拭子折叠后包裹在已插入颈静脉的细导管（内径0.28 mm）周围，使导管位于棉拭子内部。在棉拭子上方放置夹钳，以防止血液逆流或空气栓塞。将装有FITC团注液的1 mL注射器连接27 G针头，并与细导管末端连接。
4. 打开夹钳，注入FITC团注液（100 µL）。随后关闭夹钳，将较粗导管与较细导管连接。启动注射泵，流速设为0.008 mL/min（0.480 mL/h），持续输注60分钟。

4. 实验阶段

注意：在此阶段，可研究药物对肾小球通透选择性的影响。

1. 更换尿管（时间点 0 分钟）至另一支 1.5 mL 棕色管中。用棉签环绕小血管导管并按步骤 3.3 所示关闭夹子。
2. 将大导管从小血管导管上断开。更换注射器中的溶液为实验阶段溶液（见步骤 1.5）。启动输注泵，使大导管内充满平衡溶液。
3. 重新连接导管，避免空气栓塞，并重新打开夹子。以 0.008 mL/min 的速度启动注射泵。
4. 继续运行注射泵 60 分钟，并在此之后收集尿管中的尿液（尿液 60 分钟）。将尿液收集管置于冰上。
5. 在麻醉状态下通过颈椎脱位处死小鼠。在处理前观察小鼠 5 分钟，以确认其已死亡。

5. 尿液分析

1. 荧光测定
   1. 解冻尿液混合样本，并用磷酸盐缓冲液（PBS）将其稀释1:10。
      注意：尿液混合样本是指从健康小鼠在代谢笼中收集12–24小时所得的尿液混合而成。
   2. 准备荧光测定用的标准品。取10个棕色1.5 mL离心管，分别标记为空白对照（1:10稀释的尿液混合样本）以及以下FITC-多聚蔗糖70浓度（0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80和160 µg/mL）。
   3. 向一个1.5 mL棕色离心管中加入246 µL稀释后的尿液混合样本，再加入4 µL FITC-多聚蔗糖70储备液（见步骤1.1），得到终浓度为160 µg/mL的FITC-多聚蔗糖70溶液。向其余各管中各加入100 µL稀释后的尿液混合样本。
   4. 通过将160 µg/mL管中的溶液吸取100 µL加入80 µg/mL管中进行1:2稀释，并依次类推完成其余浓度的稀释。确保每次稀释后充分混匀（例如，可通过涡旋振荡离心管以保证混合均匀）。
   5. 将小鼠尿液样本（0分钟和60分钟）用稀释后的尿液混合样本按1:10比例稀释。
   6. 在黑色384孔板中，每种标准品浓度及小鼠尿液样本均取5 µL，设三个复孔。将384孔板在1,000 × g 条件下离心15秒，以避免产生气泡。
   7. 使用酶标仪分析384孔板。激发波长设为496 nm，发射波长设为525 nm进行荧光检测。
2. 肌酐测定
   1. 按照试剂盒说明书操作。简要而言，取10 µL 100 mM肌酐标准品溶液加入990 µL肌酐检测缓冲液中，配制1 mM的标准溶液。
   2. 在96孔板中分别加入0、2、4、6、8和10 µL的1 mM肌酐标准溶液，以获得每孔分别为0、2、4、6、8和10 nmol的标准品。向每孔中补加肌酐检测缓冲液至总体积为50 µL。
   3. 配制反应混合液：每份加入42–44 µL肌酐检测缓冲液、2 µL肌酸酶（creatinase）、2 µL肌酐酶（creatininase）、2 µL肌酐酶混合液（creatinine enzyme mix）和2 µL肌酐探针（creatinine probe）。对于空白对照，使用44 µL肌酐检测缓冲液、2 µL肌酸酶、2 µL肌酐酶混合液以及1–2 µL肌酐探针。
   4. 向96孔板各孔中加入50 µL相应的反应混合液，在37 °C水平摇床上孵育60分钟。孵育过程中需避光。使用酶标仪在570 nm波长处测定吸光度。
   5. 通过从所有读数中减去空白值来计算肌酐浓度。结果单位为纳摩尔/微升（nmol/µL）。将肌酐浓度乘以肌酐的分子量（113.12 ng/nmol），换算为纳克/微升（ng/µL）。

6. 数据分析

1. 根据标准曲线计算尿液中FITC-多聚蔗糖70的浓度。
2. 将代表性尿液样本中FITC-多聚蔗糖70的浓度与肌酐浓度进行比对。
3. 将处理组和对照组小鼠的60分钟尿液样本与0分钟尿液样本进行比较。

结果

如图2所示，小鼠肾小球通透性检测方法分为三个阶段。第一阶段称为准备阶段，此阶段置入尿道导管和中心静脉导管。第二阶段称为平衡阶段，首先静脉注射FITC-多聚蔗糖70，随后持续输注FITC-多聚蔗糖70达60分钟。最后一个阶段称为实验阶段，在此阶段继续输注FITC-多聚蔗糖70，同时可测试药物或其他物质对肾小球通透性的影响。每个阶段结束时收集尿液。

为了在该示踪模型中研究肾小球通透性，必须正确放置导尿管且不损伤黏膜。本文演示了将导尿管插入雌性小鼠膀胱的操作过程。 图1导管插入尿道口内3 mm，与尿道头尾轴平行（图1A）。将导管朝向小鼠尾部旋转180°（图1B）并沿小鼠脊柱方向再深入膀胱7 mm（

讨论

本方法使研究者能够利用示踪剂以高度敏感的方式检测小鼠肾小球的通透性。通过该方法，仅需少量尿液即可诊断肾小球通透性的短期升高。成功掌握该技术最关键的步骤包括：1）熟练掌握小鼠手术操作技术，尤其是中心静脉插管技术；2）在不损伤黏膜的前提下正确放置尿道导管；3）熟练掌握对含有少量样本的384孔板的手动操作技术。

放置中心静脉导管时，必须确保导管不穿透颈静脉。为避免穿透，建议使用远端结扎牵拉颈静脉（见步骤2.2.7），并用精细镊子提起颈静脉以扩大其管腔。为保持插入部位尽可能小，在插入导管时应尽量避免大幅度动作，并通过清除多余组织始终确保手术视野清晰。放置导尿管最关键的步骤是将其最终插入膀胱。若遇到阻力，建议从头开始重新操作，以避免形成假道并损伤黏膜。在困难情况下，导管旋转、润滑、轻柔操作以及操作者的经验均有助于顺利完成插管⁷。

FITC-聚蔗糖70是一种荧光标记的、支化且交联的蔗糖与环氧氯丙烷聚合物⁹。其在溶液中表现为球形分子，呈类球状结构...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Motic SMZ168 BL	Motic	SMZ168BL	小鼠手术显微镜
KL1500LCD	Pulch and Lorenz microscopy	150500	小鼠手术光源
Microfederschere	Braun, Aesculap	FD100R	精细剪刀
Durotip Feine Scheren	Braun, Aesculap	BC210R	用于颈部切断
Anatomische Pinzette	Braun, Aesculap	BD215R	用于手术
Präparierklemme	Aesculap	BJ008R	用于手术
Seraflex	Serag Wiessner	IC108000	丝线
氯胺酮 10%	Medistar		麻醉剂
隆朋（赛拉嗪）2%	Bayer		麻醉剂
细内径聚乙烯管 内径0.28mm 外径0.61mm	Portex	800/100/100	导管
细内径聚乙烯管 内径0.58mm 外径0.96mm	Portex	800/100/200	导管
Harvard apparatus 11 Plus	Harvard Apparatus	70-2209	注射泵
BD Insyte Autoguard	BD	381823	尿道导管
多功能检测仪 DTX 880	Beckman Coulter		酶标仪
384孔微孔板	Nunc	262260	384孔板
肌酐检测试剂盒	Sigma-Aldrich	MAK080	用于测定肌酐浓度
96孔板	Nunc	260836	用于肌酐检测
FITC标记的多聚蔗糖70	TBD Consultancy	FP70	FITC-菊粉
血管紧张素II	Sigma-Aldrich	A9525	用于检测肾小球通透性
BP-98A	Softron		用于血压测量
OTS 40.3040	Medite	01-4005-00	小鼠手术加热板
Instillagel 6mL	Farco-Pharma GmbH		用于尿道导管
Exacta	Aesculap	GT415	剃毛器