使用异硫氰酸荧光素-多聚蔗糖70对小鼠肾小球通透性进行高灵敏度测量

摘要

本文介绍了一种使用高灵敏度、非放射性示踪剂检测小鼠肾小球通透性的实验方案。该方法可利用少量尿液样本进行多次重复的尿液分析。

摘要

尿液中白蛋白的丢失（即白蛋白尿）可预测心血管疾病预后。在生理条件下，少量白蛋白经肾小球滤过，并在肾小管系统中被重吸收，直至达到重吸收极限。因此，当病理性白蛋白滤过早期轻度增加时，仅通过分析白蛋白尿可能无法检出。故而，采用示踪剂检测肾小球通透选择性具有优势。可使用荧光素异硫氰酸盐（FITC）标记的多聚蔗糖（即FITC-菊粉）作为示踪剂来研究肾小球通透选择性。FITC-多聚蔗糖分子可自由通过肾小球滤过膜，但在肾小管系统中不被重吸收。在小鼠和大鼠中，已有研究采用技术上较复杂的方法（如放射性测定、高效液相色谱法[HPLC]、凝胶过滤）检测FITC-多聚蔗糖以评估肾小球通透性。我们对基于FITC-多聚蔗糖示踪剂的实验方案进行了改进和简化，用于检测小鼠肾小球对FITC-多聚蔗糖70（大小与白蛋白相近）通透性的早期及轻微升高。该方法允许使用少量尿液（5 µL）进行重复尿液分析。本方案包含FITC-多聚蔗糖70示踪剂静脉注射操作，以及通过简易尿道导管收集尿液的方法。尿液样本通过荧光酶标仪进行检测，并以尿液浓度标志物（肌酐）进行标准化校正，从而避免了技术复杂的检测流程。

引言

肾小球滤过屏障的功能或结构缺陷会增加其对白蛋白的通透性，导致尿液中可检测到白蛋白（白蛋白尿）。白蛋白尿可预测心血管疾病预后，是肾小球损伤的重要标志物¹。即使白蛋白尿水平处于正常范围内，也与心血管风险增加相关¹。

在生理条件下，白蛋白可经肾小球滤过，并在肾小管系统中几乎被完全重吸收^2,3。在小鼠中，通常通过收集24小时尿液，采用白蛋白酶联免疫吸附测定法（ELISA）来检测尿液中的白蛋白。若使用24小时尿液收集样本或随机尿样，由于检测方法的灵敏度问题，可能无法发现白蛋白浓度的微小差异。因此，大多数研究人员采用通过毒素、药物或肾脏手术引起明显肾损伤的动物模型，以诱导产生白蛋白尿。

因此，发现一种能够检测肾小球通透性微小且短暂变化的灵敏方法，对该领域具有重要意义。Rippe 等人提出了一种通过应用荧光标记示踪剂（即与荧光素异硫氰酸盐标记的70 kDa多蔗糖，亦称FITC-Ficoll 70）来检测大鼠肾小球通透性的模型，该示踪剂大小与白蛋白相当⁴。该示踪剂方法可用于检测肾小球通透性的短期变化（数分钟内），且具有很高的灵敏度⁴....

方案

研究按照《实验动物护理和使用指南》（美国国立卫生研究院出版物第85-23号，1996年修订版）中规定的指南进行。所有动物实验均依照相关机构的批准（德国州政府自然、环境与消费者保护局 [LANUV] 批准编号84-02.04.2012.A397）执行。

1. 仪器、溶液和设备的准备

1. 用0.9%无菌氯化钠（NaCl）溶液重悬FITC-聚蔗糖70，配制成终浓度为10 mg/mL的溶液（例如，将100 mg FITC-聚蔗糖70溶于10 mL NaCl溶液中）。
2. 将FITC-聚蔗糖70溶液在4 °C条件下透析过夜，以去除游离的FITC分子（截留分子量[MWCO]为10,000）。每10 mL FITC-聚蔗糖70溶液使用1 L 0.9%无菌NaCl溶液，并持续搅拌。避光操作。将透析后的FITC-聚蔗糖70分装后于-20 °C保存。
3. 配制FITC-聚蔗糖70团注溶液：取4 µL 10 mg/mL的FITC-聚蔗糖70溶液加入996 µL 0.9% NaCl溶液中（FITC-聚蔗糖70的终浓度为40 µg/mL）。
4. 配制平衡输注液：取20 µL 10 mg/mL的FITC-聚蔗糖70溶液加入9.98 mL 0.9%无菌NaCl溶液中，得到终浓度为20 µg/mL的溶液。
5. 配制实验用输注液：将药物或待测物质加入输注液中（例如，对一只25 g小鼠给予血管紧张素II [Ang II] [10....

结果

如图2所示，小鼠肾小球通透性检测方法分为三个阶段进行。第一阶段为准备阶段，需置入尿道导管和中心静脉导管。第二阶段为平衡阶段，首先静脉注射FITC-葡聚糖70作为推注剂量，随后持续输注FITC-葡聚糖70达60分钟。最后一个阶段为实验阶段，在此期间继续输注FITC-葡聚糖70，并可加入药物或其他物质以检测其对肾小球通透性的影响。每个阶段结束时均收集尿液样本。

为了在该示踪模型中研究肾小球通透性，必须正确放置导尿管且不损伤黏膜。本文演示了将导尿管插入雌性小鼠膀胱的操作过程。 图1导管插入尿道口3 mm，与尿道头尾轴平行（图1A）。导管被旋转 180° 朝向小鼠尾部图1B）并沿小鼠脊柱方向再推进7 mm进入膀胱，（

讨论

本方法使研究者能够利用示踪剂以高度敏感的方式检测小鼠肾小球的通透性。通过该方法，仅需少量尿液即可诊断肾小球通透性的短期升高。成功掌握该技术最关键的步骤包括：1）熟练掌握小鼠手术操作技术，尤其是中心静脉插管技术；2）在不损伤黏膜的前提下正确放置尿道导管；3）熟练掌握对含有少量样本的384孔板的手动操作技术。

放置中心静脉导管时，必须确保导管不穿透颈静脉。为避免穿透，建议使用远端结扎牵拉颈静脉（见步骤2.2.7），并用精细镊子提起颈静脉以扩大其管腔。为保持插入部位尽可能小，在插入导管时应尽量避免大幅度动作，并通过清除多余组织始终确保手术视野清晰。放置导尿管最关键的步骤是将其最终插入膀胱。若遇到阻力，建议从头开始重新操作，以避免形成假道并损伤黏膜。在困难情况下，导管旋转、润滑、轻柔操作以及操作者的经验均有助于顺利完成插管⁷。

FITC-聚蔗糖70是一种荧光标记的、支化且交联的蔗糖与环氧氯丙烷聚合物⁹。其在溶液中表现为球形分子，呈类球状结构.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Motic SMZ168 BL	Motic	SMZ168BL	小鼠手术显微镜
KL1500LCD	Pulch and Lorenz microscopy	150500	小鼠手术光源
Microfederschere	Braun, Aesculap	FD100R	精细剪刀
Durotip Feine Scheren	Braun, Aesculap	BC210R	用于颈部切断
Anatomische Pinzette	Braun, Aesculap	BD215R	用于手术
Präparierklemme	Aesculap	BJ008R	用于手术
Seraflex	Serag Wiessner	IC108000	丝线
氯胺酮 10%	Medistar		麻醉剂
隆朋（赛拉嗪）2%	Bayer		麻醉剂
细内径聚乙烯管 内径0.28mm 外径0.61mm	Portex	800/100/100	导管
细内径聚乙烯管 内径0.58mm 外径0.96mm	Portex	800/100/200	导管
Harvard apparatus 11 Plus	Harvard Apparatus	70-2209	注射泵
BD Insyte Autoguard	BD	381823	尿道导管
多功能检测仪 DTX 880	Beckman Coulter		酶标仪
384孔微孔板	Nunc	262260	384孔板
肌酐检测试剂盒	Sigma-Aldrich	MAK080	用于测定肌酐浓度
96孔板	Nunc	260836	用于肌酐检测
FITC标记的多聚蔗糖70	TBD Consultancy	FP70	FITC-菊粉
血管紧张素II	Sigma-Aldrich	A9525	用于检测肾小球通透性
BP-98A	Softron		用于血压测量
OTS 40.3040	Medite	01-4005-00	小鼠手术加热板
Instillagel 6mL	Farco-Pharma GmbH		用于尿道导管
Exacta	Aesculap	GT415	剃毛器