方法文章

酵母作为研究人类P53功能检测方法开发的底盘系统

DOI：

10.3791/59071

⸱

2019年8月4日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Mutagenesis and Cancer Prevention Unit, Ospedale Policlinico San Martino, 2Department CIBIO, University of Trento, 3LAQV/REQUIMTE, Laboratory of Microbiology, Faculty of Pharmacy, University of Porto

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了四种构建和利用酵母Saccharomyces cerevisiae报告菌株的实验方案，用于研究人类P53的转录激活潜能、其多种癌症相关突变的影响、共表达的相互作用蛋白，以及特定小分子的作用效果。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

已知哺乳动物P53蛋白可在酵母S. cerevisiae中作为转录因子（TF）发挥作用，这一发现促进了多种功能检测方法的发展，用于研究：1）结合位点（即反应元件，RE）序列变异对P53转录激活特异性的影响，或2）TP53突变、共表达的辅助因子或小分子对P53转录激活活性的影响。目前已开发出多种基础与转化研究应用。实验上，这些方法利用了酵母模型的两大优势：一方面，基因组编辑操作简便，可通过利用仅在特定P53-RE位点存在差异的同源酵母菌株，快速构建定性或定量的报告系统，以研究P53依赖性转录激活的序列特异性；另一方面，外源性P53表达的可调控系统使得能够在广泛的蛋白表达水平下评估转录激活活性。本报告综述了广泛使用的基于显色报告基因、荧光素酶以及酵母生长的检测系统，阐述其主要方法学步骤，并对其预测能力进行批判性评估。此外，这些方法具有极高的灵活性，可轻松拓展用于研究其他转录因子，如P63和P73，它们同属TP53基因家族成员。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

转录是一个极为复杂的过程，涉及转录因子（TFs）和共调节因子在空间、时间和动态上的组织，以响应特定刺激，在染色质区域招募并调控RNA聚合酶1。大多数转录因子（包括人类P53肿瘤抑制蛋白）可识别特定的顺式作用元件，即称为应答元件（REs）的DNA序列，这些元件通常由单个（或多个）长度约为6-10个核苷酸的独特基序组成。在这些基序中，各个位置可能表现出不同程度的可变性2，通常通过位置权重矩阵（PWM）或序列标志图（logos）进行总结3,4。

酵母S. cerevisiae 是研究人类蛋白质多个方面的理想模型系统，可通过互补实验、异位表达和功能分析进行研究，即使在缺乏同源酵母基因的情况下亦可实现5,6,7。由于转录系统基本组分在进化上的保守性8，许多人类转录因子（在酵母细胞中异位表达时）能够通过作用于含有特定调控元件（RE）的工程化启动子，调控报告基因的表达。本文中用于研究人类P53的转录模型系统具有三个可调控的主要变量：1）P53的表达方式和P53的类型；2）控制P53依赖性转录的RE序列；以及3）报告基因的类型（图1A）。

关于P53表达的方式，S. cerevisiae 可选择诱导型、可阻遏型或组成型启动子9,10,11。特别是诱导型GAL1启动子，可通过使用棉子糖作为碳源实现基础表达，或通过改变培养基中半乳糖的含量实现可变表达，从而在酵母中调控转录因子的表达。事实上，这种精细可调的表达系统对于研究P53本身以及其他P53家族蛋白均具有重要意义12,13。

关于调控P53依赖性表达的响应元件（RE）类型，S. cerevisiae 可用于构建不同的报告菌株，这些菌株在其他方面具有同源遗传背景，仅在目标RE上存在特异性差异。该目标可通过采用一种在S. cerevisiae中开发的、被称为delitto perfetto12,14,15,16的多功能基因组编辑方法的改良版本来实现。

此外，可使用不同的报告基因（如 URA3、HIS3 和 ADE2）对人类转录因子在 S. cerevisiae 中的转录活性进行定性和定量评估，每种报告基因均具有特定特性，可根据实验需求进行选择17,18,19,20,21。这些报告基因的表达分别赋予细胞尿嘧啶、组氨酸和腺嘌呤的原养型。其中，URA3 报告基因还可在含有5-FOA的培养基中实现反向筛选，抑制细胞生长。ADE2 报告系统的优势在于，除了营养筛选外，还可通过菌落颜色区分表达野生型（即在 ADE2 表达下具有功能）或突变型（即在 ADE2 表达下无功能）P53的酵母细胞。

例如，在含有限量腺嘌呤（2.5–5.0 mg/L）的培养板上，表达ADE2基因的酵母细胞会形成正常大小的白色菌落，而转录该基因能力较弱或完全不转录的细胞则在同一培养板上形成较小的红色（或粉红色）菌落。这是由于腺嘌呤生物合成途径中的中间产物（即磷酸核糖氨基咪唑，此前称为氨基咪唑核苷酸或AIR）积累，并进一步转化为红色色素所致。基于颜色定性分析的ADE2报告基因随后已被定量的萤火虫Photinus pyralis（LUC1）报告基因所取代12,22。近年来，ADE2报告基因已与lacZ报告基因结合，构建出一种易于评分的半定量双报告基因检测系统，可用于根据p53突变体残余功能水平对其进行亚分类23。

荧光报告基因（如EGFP（增强型绿色荧光蛋白）或DsRed（Discosoma sp. 红色荧光蛋白））也已被用于对TP53编码序列中所有可能的错义突变相关的转激活活性进行定量评估24。最后，通过将可调节的启动子用于P53等位基因表达，并结合在应答元件（RE）和/或报告基因上存在差异的同基因型酵母菌株，使得构建出一个数据矩阵，从而实现了对与癌症相关及种系突变的P53等位基因进行更精细的分类25,26,27。

上述方法用于检测P53蛋白的转录活性。然而，野生型P53在酵母中的表达 S. cerevisiae28 和 裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）29 可导致生长迟缓，这与细胞周期阻滞相关28,30 或细胞死亡31在这两种情况下，酵母生长抑制均由高水平的P53表达引发，并与内源性酵母生长相关基因潜在的转录调控相关。支持这一假设的是，当P53 R273H功能缺失突变体以与野生型P53相似的水平表达时，并未干扰酵母细胞的生长。32相反，表达毒性突变型P53 V122A（其转录活性高于野生型P53）的酵母菌株比表达野生型P53的菌株表现出更强的生长抑制效应32.

此外，研究证明人源MDM2能够在酵母中抑制人源P53的转录活性，促进其泛素化及随后的降解33。相应地，人源MDM2和MDMX抑制P53诱导的酵母生长抑制的能力也得到了证实32,34。在另一项研究中，建立了P53转录活性与肌动蛋白表达水平之间的相关性，并在酵母ACT1基因上游鉴定出一个假定的P53反应元件（RE）32。一致地，野生型P53可增强肌动蛋白的表达，而P53 V122A突变体的作用更为显著，但P53 R273H突变体则无此效应。相反，在共表达P53抑制因子MDM2、MDMX或pifithrin-α（一种抑制P53转录活性的小分子抑制剂）的情况下，P53介导的肌动蛋白表达下降，该结果与酵母生长实验的结果一致。重要的是，这些结果建立了P53诱导的生长抑制与其在酵母中活性程度之间的相关性，这一特性已被用于鉴定和研究调控P53功能的小分子化合物28,34,35。

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方案

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1. 构建含有特定RE（yAFM-RE或yLFM-RE）的ADE2或LUC1报告酵母菌株

  1. 从保存在 -80 °C 的 15% 甘油菌种（yAFM-ICORE 或 yLFM-ICORE 菌株12,14；ICORE = 在 GAL1 启动子控制下的 ISce-I 内切酶；CO = 可反向筛选的 URA3；RE = 报告基因 KanMX4，赋予卡那霉素抗性；表 1）中，在 YPDA 琼脂平板上划线（表 2），于 30 °C 培养 2–3 天。
  2. 取新鲜平板上的一个酵母菌落（不超过 3 周龄），接种至含有 5 mL YPDA 培养基的小三角瓶中（表 2），于 30 °C 振荡培养过夜，转速为 150–200 rpm。
  3. 次日，为彻底去除葡萄糖残留，以 3,000 x g 离心 2 分钟收集细胞，通过倒置离心管弃去上清液。
    注意：本实验方案中所有离心步骤均在室温（RT）下进行。
  4. 将细胞沉淀重悬于 30–50 mL 预热的含半乳糖的 CM 培养基（完全培养基）中（表 2），于 30 °C 振荡培养 4 小时（转速 150–200 rpm），以诱导 I-SceI 表达。
  5. 以 3,000 x g 离心 2 分钟收集细胞，倒置离心管弃去上清液。
  6. 将细胞沉淀重悬于 30–50 mL 无菌水中。重复步骤 1.5。
  7. 将细胞沉淀重悬于 10 mL 无菌水中。重复步骤 1.5。
  8. 将细胞沉淀重悬于 5 mL 无菌 LiAcTE 溶液中（表 3），该离子溶液有利于 DNA 摄取。重复步骤 1.5。
  9. 将细胞沉淀重悬于 250 µL 无菌 LiAcTE 溶液中，转移至 1.5 mL 离心管。重复步骤 1.5，再将细胞沉淀重悬于 300–500 µL 无菌 LiAcTE 溶液中。
  10. 在洗涤过程中，将 10 mg/mL 的鲑鱼精子 DNA 载体溶液于 100 °C 变性 10 分钟，立即冰浴冷却，以维持其单链 DNA 状态。
  11. 在另一支 1.5 mL 离心管中，加入 500 皮摩尔目标寡核苷酸（表 3）、5 µL 煮沸处理的鲑鱼精子载体 DNA、300 µL 无菌 LiAcTE-PEG 溶液（表 3）以及 50 µL 酵母细胞悬液（来自步骤 1.9）。
  12. 涡旋振荡 10 秒混匀，于 30 °C 振荡孵育 30 分钟（转速 150–200 rpm）。将 1.5 mL 离心管侧放以利于振荡。
  13. 将酵母细胞在 42 °C 水浴中热激 15 分钟，随后以 10,000 x g 离心 20 秒。弃去上清液，将细胞重悬于 1 mL 无菌水中。
  14. 取 100 µL 细胞悬液涂布于 YPDA 琼脂平板，于 30 °C 倒置培养 1 天。为确保获得分散良好的单菌落，同时涂布 100 µL 1:10 稀释液。
  15. 次日，使用无菌绒布将菌落影印至含葡萄糖和 5-FOA 的 CM 琼脂平板（表 2）。若转移细胞过多（例如 URA3 细胞出现生长），可考虑在新平板上进行第二次影印。
  16. 三天后，将菌落影印至非选择性 YPDA 平板以及含 G418（一种与卡那霉素类似的氨基糖苷类抗生素）的 YPDA 琼脂平板（表 2），标记各平板以便后续比对。于 30 °C 培养过夜。
  17. 次日，筛选在 G418 平板上不生长但在 YPDA 平板上生长的菌落（即 G418 敏感但能在 YPDA 上生长的菌落），作为候选报告菌株（例如 yLFM- 或 yAFM-RE 菌落）。挑取 3–6 个阳性菌落，在新的 YPDA 平板上划线以获得单菌落纯培养，于 30 °C 培养 2 天。
  18. 将单个酵母菌落点种于 YPDA 平板，用于分离菌株以进行后续分析。于 30 °C 培养 24 小时后，通过影印至 YPGA 琼脂平板（表 2）检测其生长情况，该培养基可抑制“petite”突变体（即呼吸缺陷型突变体）的生长。同时，影印至新的 YPDA 琼脂平板作为对照。
  19. 从步骤 1.18 中筛选出正确生长的菌落（即在 YPDA 和 YPGA 琼脂平板上均生长的菌落，共 1–3 个），通过菌落 PCR 检测目标寡核苷酸是否正确整合。配制 PCR 反应体系：加入 5 μL 10x PCR 缓冲液（含 1.5 mM MgCl2）、2 μL 10 皮摩尔/μL 的引物（表 3）、4 μL 2.5 mM dNTPs、0.25 µL 5 U/μL Taq 聚合酶，加水至终体积 50 μL。根据待检测酵母菌落数量倍增反应体系总量，分装 50 μL 至各 PCR 管。使用移液器吸取 YPDA 琼脂平板上的少量酵母细胞，加入单个 PCR 反应体系中。
  20. 进行 PCR 扩增，程序如下：94 °C 预变性 8 分钟，随后进行 35 个循环（每个循环包括：94 °C 变性 1 分钟，55 °C 退火 1 分钟，72 °C 延伸 2 分钟）。
  21. PCR 结束后，取约十分之一反应产物上样于琼脂糖凝胶，检测扩增片段大小是否正确（约 500 bp）。
  22. 使用商业化试剂盒纯化 PCR 产物后进行测序，利用步骤 1.19 中相同的引物确认目标 RE 序列的正确整合。
  23. 在确认序列正确后，将 yAFM-RE 或 yLFM-RE 菌株（在 YPDA 培养基中培养）制备成 15% 甘油菌种，于 -80 °C 保存。

2. 利用基于颜色的定性ADE2酵母检测法评估P53蛋白的转录激活能力

  1. 使用 yAFM-RE 菌株（表 1）重复步骤 1.1 和 1.2。
  2. 次日，将细胞培养物以 1:10 的比例稀释至 30–50 mL 预热的 YPDA 培养基中，继续在 30 °C 下振荡培养，直至 OD600nm 达到 0.8–1.0（约 2 小时）。
  3. 重复步骤 1.5–1.10。
  4. 在另一个 1.5 mL 离心管中，加入 300–500 ng 酵母 P53（或对照）表达载体（表 4）、5 µL 煮沸的鲑精 DNA 载体、300 µL 无菌 LiAcTE PEG 溶液和 50 µL 酵母细胞悬液。
  5. 重复步骤 1.12 和 1.13，但将细胞沉淀重悬于 300 µL 无菌水中。
  6. 取 100 µL 细胞悬液涂布于含有葡萄糖作为碳源且富含腺嘌呤的合成选择性平板（用于筛选 P53 表达或对照载体）上（表 2），然后将平板倒置，于 30 °C 培养 2–3 天。
  7. 将单个酵母转化子菌落（每板 2–6 条划线）划线接种至新的选择性平板上，在 30 °C 下过夜培养。
  8. 次日，使用无菌绒布将菌落复制到新的选择性平板上，以评估颜色表型（即含葡萄糖作为碳源但限制腺嘌呤含量的平板；表 2），将平板倒置于 30 °C 培养 3 天。可选：为评估 P53 蛋白的温度敏感性，分别在 24 °C、30 °C 和 37 °C 下培养 3 天。
    注意：同一划线菌落可多次进行复制平板操作。
  9. 为评估 P53 蛋白的转录激活能力，观察酵母菌落的颜色表型，并将 P53 蛋白的表型与 P53 野生型及空载体的表型进行比较。

3. 使用基于定量发光的LUC1酵母检测法评估P53蛋白的转录激活能力

  1. 使用第2个方案中所述的基于LiAc的方法，将P53（或对照）表达载体（表4）转化至酵母细胞中。使用yLFM-RE菌株（表1）。
  2. 将单个转化子接种到新的选择性平板上，使用含高浓度腺嘌呤并以葡萄糖作为碳源的培养基，于30 °C过夜培养。每种转化类型制备5–7个不同的菌斑。
  3. 过夜培养后，用无菌牙签或移液器吸头从平板上取少量酵母细胞，重悬于合成选择性培养基中，培养基中以葡萄糖或棉子糖作为碳源（最终体积200 µL），置于透明的96孔板（圆底或平底）中。若实验需要诱导P53表达，则在棉子糖培养基中加入半乳糖以调节诱导水平（表2）。
    注意：细胞悬液的OD600nm应约为0.4，且不超过1。
  4. 在诱导P53表达后（30 °C、150–200 rpm振荡培养4–8小时），使用多功能酶标仪测定各孔在OD600nm处的吸光度。使用多通道移液器混匀各孔，确保细胞悬液均匀。
  5. 从透明96孔板中转移10–20 µL细胞悬液至白色384孔（或96孔）板中，加入等体积（10–20 µL）的裂解缓冲液并混匀。在室温下振荡孵育10–15分钟（150–200 rpm），以实现细胞膜对荧光素酶底物的通透。
  6. 加入10–20 µL萤火虫荧光素酶底物，并使用多功能酶标仪测定发光单位（LU）。
  7. 为确定P53蛋白的转录激活能力，将每孔的发光单位（LU）归一化至对应的OD600nm值（即相对发光单位，RLU）。根据3–4个酵母转化子菌斑的数据计算平均RLU及其标准偏差。
  8. 将P53蛋白的转录激活数据与P53野生型及空载体对照进行比较，可通过减去空载体所得数值，或除以空载体所得数值（即计算诱导倍数）进行分析。
    注意：也可在相同实验体系中，通过引入P53相互作用蛋白（如MDM2和MDMX）和/或药物处理，进一步评估P53的转录激活活性。

4. 利用酵母表型实验评估P53蛋白的生长抑制作用

  1. 使用第2节中所述的基于LiAc的方法，将P53/MDM2/MDMX（或对照）表达载体（表4）转化至酵母细胞中。采用CG379菌株（表1），并将转化后的酵母涂布于最小选择性平板（表2）上。
  2. 将转化后的细胞在最小选择性培养基（表2）中培养至OD600nm约1.0。
  3. 将酵母细胞用选择性诱导培养基（表2）稀释至OD600nm为0.05，并可选地加入选定小分子至适当浓度（或仅加溶剂），以检测其在重新激活突变型P53或抑制MDM2/MDMX与P53相互作用方面的功效。
  4. 将细胞在30 °C下以200 rpm连续振荡培养约42小时（阴性对照酵母达到对数中期所需时间，OD600nm约0.45）。
  5. 将100 µL酵母培养液点样于最小选择性平板（表2）上。
  6. 在30 °C下培养2天。
  7. 通过计数100 µL培养液滴中形成的菌落数量（菌落形成单位，CFU计数）来测定酵母生长情况。例如，在评估化合物对突变型P53的再激活效应时，以表达野生型P53的酵母生长作为最大可能效应（设为100%），而表达突变型P53但仅暴露于溶剂对照的细胞生长则代表再激活的零水平。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

构建 ADE2 或 LUC1 报告基因酵母菌株

已对delitto perfetto方法12,14,15,16进行改进，以构建P53报告基因酵母菌株（图1B）。该方法采用单链或双链寡核苷酸，其两端均含有至少30个核苷酸，与选定的整合位点具有同源性。具体而言，该同源序列对应于双标记盒ICORE整合位点两侧的序列，该标记盒包...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

基于酵母的检测方法已被证明在研究P53蛋白功能的多个方面具有重要价值。这些检测方法对评估P53对RE靶位点变体的转录激活潜能特别敏感，包括对功能性多态性的评价。利用显色报告基因以及微型化的荧光素酶检测，可实现成本较低且相对易于放大的检测体系。此外，生长抑制试验有望用于化合物文库筛选，通过测定吸光度实现对酵母细胞活力的自动化定量。尽管由于细胞壁的通透性限制以及ABC转运蛋白的作用，酵母在药物筛选中的应用曾被认为存在局限性，但目前已成功开发出通过遗传改造提高化合物摄取效率的方法22,65。

与基于哺乳动物细胞的检测方法相比，基于酵母的P53检测可能更有利于识别直接作用的候选分子，因为P53在酵母系统中脱离了在高等真核生物中调控其功能的复杂辅助因子网络和信号级联通路。基于酵母的功能性检测方法在监测P53与蛋白辅助因子（如MDM2和MDMX22,32

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明无利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

感谢欧盟（通过竞争力运营计划—COMPETE项目获得的欧洲区域发展基金FEDER资金，编号POCI/01/0145/FEDER/007728）以及国家资金（FCT/MEC，科学技术基金会及教育部与科学部）在2020年合作协议下提供的资助（项目编号：UID/QUI/50006/2019 ）和项目（3599-PPCDT）PTDC/DTP-FTO/1981/2014 - POCI-01-0145-FEDER-016581。FCT博士奖学金：SFRH/BD/96189/2013（S. Gomes）。本研究还得到意大利都灵圣保罗基金会（Compagnia S. Paolo，项目编号2017.0526）和意大利卫生部（5x1000项目，2015年和2016年；当前研究2016年）的支持。我们衷心感谢特伦托大学实验科学教学实验室的Teresa López-Arias Montenegro博士在视频录制方面提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
L-天冬氨酸SIGMA11189
QIAquick PCR 纯化试剂盒QIAGEN28104
L-苯丙氨酸SIGMA78019
蛋白胨BD Bacto211677
酵母提取物BD Bacto212750
Difco 酵母氮源基础（不含氨基酸和硫酸铵）BDTM233520
二水合乙酸锂SIGMA517992
细菌学琼脂 A 型Biokar DiagnosticsA1010 HA
G418 硫酸二盐SIGMAA1720
硫酸铵SIGMAA2939
L-精氨酸单盐酸盐SIGMAA5131
腺嘌呤半硫酸盐SIGMAA9126
5× 被动裂解缓冲液PROMEGAE1941
Bright-Glo 荧光素酶检测试剂系统 PROMEGAE2620
5-FOAZymo ResearchF9001
D-(+)-半乳糖SIGMAG0750
L-谷氨酸SIGMAG1251
葡萄糖 SIGMAG7021
L-组氨酸SIGMAH8125
L-异亮氨酸SIGMAI2752
L-赖氨酸SIGMAL1262
L-亮氨酸SIGMAL8000
L-甲硫氨酸SIGMAM2893
PEGSIGMAP3640
D-(+)-棉子糖五水合物SIGMAR0250
L-丝氨酸SIGMAS4500
L-色氨酸SIGMAT0271
L-苏氨酸SIGMAT8625
尿嘧啶SIGMAU0750
L-缬氨酸SIGMAV0500

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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