酵母作为研究人类P53功能检测方法开发的底盘系统

摘要

本文介绍了四种构建和利用酵母Saccharomyces cerevisiae报告菌株的实验方案，用于研究人类P53的转录激活潜能、其多种癌症相关突变的影响、共表达的相互作用蛋白，以及特定小分子的作用效果。

摘要

已知哺乳动物P53蛋白可在酵母S. cerevisiae中作为转录因子（TF）发挥作用，这一发现促进了多种功能检测方法的发展，用于研究：1）结合位点（即反应元件，RE）序列变异对P53转录激活特异性的影响，或2）TP53突变、共表达的辅助因子或小分子对P53转录激活活性的影响。目前已开发出多种基础与转化研究应用。实验上，这些方法利用了酵母模型的两大优势：一方面，基因组编辑操作简便，可通过利用仅在特定P53-RE位点存在差异的同源酵母菌株，快速构建定性或定量的报告系统，以研究P53依赖性转录激活的序列特异性；另一方面，外源性P53表达的可调控系统使得能够在广泛的蛋白表达水平下评估转录激活活性。本报告综述了广泛使用的基于显色报告基因、荧光素酶以及酵母生长的检测系统，阐述其主要方法学步骤，并对其预测能力进行批判性评估。此外，这些方法具有极高的灵活性，可轻松拓展用于研究其他转录因子，如P63和P73，它们同属TP53基因家族成员。

引言

转录是一个极为复杂的过程，涉及转录因子（TFs）和共调节因子在空间、时间和动态上的组织，以响应特定刺激，在染色质区域招募并调控RNA聚合酶¹。大多数转录因子（包括人类P53肿瘤抑制蛋白）可识别特定的顺式作用元件，即称为应答元件（REs）的DNA序列，这些元件通常由单个（或多个）长度约为6-10个核苷酸的独特基序组成。在这些基序中，各个位置可能表现出不同程度的可变性²，通常通过位置权重矩阵（PWM）或序列标志图（logos）进行总结^3,4。

酵母S. cerevisiae 是研究人类蛋白质多个方面的理想模型系统，可通过互补实验、异位表达和功能分析进行研究，即使在缺乏同源酵母基因的情况下亦可实现^5,6,7。由于转录系统基本组分在进化上的保守性⁸，许多人类转录因子（在酵母细胞中异位表达时）能够通过作用于含有特定调控元件（RE）的工程化启动子，调控报告基因的表达。本文中用于研究人类P53的转录模型系统具有三个可调控的主要变量....

方案

1. 构建含有特定RE（yAFM-RE或yLFM-RE）的ADE2或LUC1报告酵母菌株

1. 从保存在 -80 °C 的 15% 甘油菌种（yAFM-ICORE 或 yLFM-ICORE 菌株^12,14；ICORE = 在 GAL1 启动子控制下的 ISce-I 内切酶；CO = 可反向筛选的 URA3；RE = 报告基因 KanMX4，赋予卡那霉素抗性；表 1）中，在 YPDA 琼脂平板上划线（表 2），于 30 °C 培养 2–3 天。
2. 取新鲜平板上的一个酵母菌落（不超过 3 周龄），接种至含有 5 mL YPDA 培养基的小三角瓶中（表 2），于 30 °C 振荡培养过夜，转速为 150–200 rpm。
3. 次日，为彻底去除葡萄糖残留，以 3,000 x g 离心 2 分钟收集细胞，通过倒置离心管弃去上清液。
   注意：本实验方案中所有离心步骤均在室温（RT）下进行。
4. 将细胞沉淀重悬于 30–50 mL 预热的含半乳糖的 CM 培养基（完全培养基）中（表 2），于 30 °C 振荡培....

结果

构建 ADE2 或 LUC1 报告基因酵母菌株

已对delitto perfetto方法^12,14,15,16进行改进，以构建P53报告基因酵母菌株（图1B）。该方法采用单链或双链寡核苷酸，其两端均含有至少30个核苷酸，与选定的整合位点具有同源性。具体而言，该同源序列对应于双标记盒ICORE整合位点两侧的序列，该标记盒包.......

讨论

基于酵母的检测方法已被证明在研究P53蛋白功能的多个方面具有重要价值。这些检测方法对评估P53对RE靶位点变体的转录激活潜能特别敏感，包括对功能性多态性的评价。利用显色报告基因以及微型化的荧光素酶检测，可实现成本较低且相对易于放大的检测体系。此外，生长抑制试验有望用于化合物文库筛选，通过测定吸光度实现对酵母细胞活力的自动化定量。尽管由于细胞壁的通透性限制以及ABC转运蛋白的作用，酵母在药物筛选中的应用曾被认为存在局限性，但目前已成功开发出通过遗传改造提高化合物摄取效率的方法^22,65。

与基于哺乳动物细胞的检测方法相比，基于酵母的P53检测可能更有利于识别直接作用的候选分子，因为P53在酵母系统中脱离了在高等真核生物中调控其功能的复杂辅助因子网络和信号级联通路。基于酵母的功能性检测方法在监测P53与蛋白辅助因子（如MDM2和MDMX^22,32

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
L-天冬氨酸	SIGMA	11189
QIAquick PCR 纯化试剂盒	QIAGEN	28104
L-苯丙氨酸	SIGMA	78019
蛋白胨	BD Bacto	211677
酵母提取物	BD Bacto	212750
Difco 酵母氮源基础（不含氨基酸和硫酸铵）	BDTM	233520
二水合乙酸锂	SIGMA	517992
细菌学琼脂 A 型	Biokar Diagnostics	A1010 HA
G418 硫酸二盐	SIGMA	A1720
硫酸铵	SIGMA	A2939
L-精氨酸单盐酸盐	SIGMA	A5131
腺嘌呤半硫酸盐	SIGMA	A9126
5× 被动裂解缓冲液	PROMEGA	E1941
Bright-Glo 荧光素酶检测试剂系统	PROMEGA	E2620
5-FOA	Zymo Research	F9001
D-(+)-半乳糖	SIGMA	G0750
L-谷氨酸	SIGMA	G1251
葡萄糖	SIGMA	G7021
L-组氨酸	SIGMA	H8125
L-异亮氨酸	SIGMA	I2752
L-赖氨酸	SIGMA	L1262
L-亮氨酸	SIGMA	L8000
L-甲硫氨酸	SIGMA	M2893
PEG	SIGMA	P3640
D-(+)-棉子糖五水合物	SIGMA	R0250
L-丝氨酸	SIGMA	S4500
L-色氨酸	SIGMA	T0271
L-苏氨酸	SIGMA	T8625
尿嘧啶	SIGMA	U0750
L-缬氨酸	SIGMA	V0500