微电极镀膜法记录从可吸入性中脑动脉的膜电位

Summary

本文的主要目的是提供如何使用微电极浸渍法记录中脑动脉膜电位(Vm)的详细信息。可加法的中脑动脉得到平衡,以获得造血性音,使用高电阻微电极刺穿血管壁。

Abstract

血管平滑肌细胞的膜电位 (V_m) 决定血管张力,从而决定血液流向器官。在疾病条件下调节V_m的电通道和电源泵的表达和功能的变化可能会改变V m、血管张力和血流。因此,对电生理学的基本理解和准确记录V_m在健康和疾病状态的必要方法是必不可少的。这种方法将允许使用不同的药理剂调制V_m以恢复V m。虽然有几种方法,各有其优缺点,本文提供了使用微电极浸渍法记录从罐化阻力血管(如中脑动脉)的V_m的协议。中脑动脉在造血室中获得造血性,血管壁使用高电阻微电极。V_m信号通过静电计进行收集、数字化和分析。该方法提供血管壁V_m的精确读数,不损坏细胞,也无需改变膜电阻。

Introduction

细胞的膜电位(V_m)是指等离子膜中离子电荷的相对差异以及膜对这些离子的相对渗透性。V_m由离子差分分布生成,并由离子通道和泵维护。Ion通道,如K+,Na+和Cl⁺对休息的V_m贡献很大。血管平滑肌细胞 (VSMC) 表示四种以上不同类型的 K⁺通道^1,两种类型的电压门控 Ca²⁺通道 (VGCC)^2,两种以上的 Cl⁺通道^3,4,5、储存操作的 Ca²⁺通道 6、拉伸激活的阳离子通道7、8 和电原钠-钾 ATPase 泵⁹在其等离子膜中,所有这些都可能是参与V_m的管制。

VSMC 的 V_m取决于流明压力。在非加压容器中,V

Protocol

雄性大鼠被安置在UMMC的动物护理设施中,该设施得到实验室动物护理评估和认证协会(AAALAC)的批准。在整个研究中,动物可以免费获得食物和水。动物在受控环境中保持温度为24~2°C,湿度水平为60~80%,光/暗循环为12小时。所有协议均获得UMMC动物护理和使用委员会的批准。

1. 设备准备

1. 将双通道差分仪电表放大器(参见材料表)靠近容器室和所需位置。
2. 使用 BNC-BNC 电缆将放大器通道 A 或 B 的输出连接到数字化器的通道输入。
3. 将探头安装在微操作器中,并将其放在显微镜和近影机附近。记录设置必须安装在无振动表上。
4. 如手册中所述,将旋钮和开关放在放大器前部的位置,以配置该按钮以进行此实验。
5. 使用适当的电极将浴场连接到放大器的电路接地。同样,确保保持架接地到放大器的机箱上。

2. 微电极和装配的制备

1. 使用硼硅酸盐玻璃微电极(参见材料表),并拉取玻璃尖,使其具有 8~10 mm 的色粒,直径为 <1 μm,当填充 3 M KCl 时电阻为 80–120 MΩ。
   1. 使用标准拉拔器使用以下设置实现短的渐进分差:热 = 650;速度 = 20;拉力 = 25;时间 = 250,循环两次,产生更高的电阻和更....

Results

该方法可以可靠地用于在罐式容器中记录V_m。图1A中介绍了一个描述如何从大脑中分离MCA的简要过程。将大脑与头骨分离后,MCA被解剖出来,并放置在含有低钙PSS的培养皿中。附加的部分结缔组织也使用弹簧剪刀和钳子与 MCA 一起解剖,以防止在隔离过程中对 MCA 造成损伤。仔细,结缔组织也被移除,解剖的MCA准备转移到近影。MCA 安装在导管上,在表形图的导管两端使用缝合结进行绑。图1B显示了典型微电极防浸方法设置的示意图。装有 3 M KCl 的微电极通过探头中的支架连接到静电计。使用 BNC-BNC 电缆将静电计的通道输出连接到数字化仪的模拟输入通道。数字化器输出进一步连接到示波器,以在记录软件中可视化信号。地面使用 AgCl 颗粒线建立,该导线从静电计的机箱扩展到肌图中的沐浴解决方案。最后,在计算机显示器上的记录软件中可视化了数字轨迹。

Discussion

本文提供了如何使用锋利的微电极浸渍法从罐化容器制备中记录V_m的必要步骤。该方法被广泛使用,并提供高质量、一致的V_m记录,回答广泛的实验问题。

此处介绍了一些关键注意事项和故障排除步骤,以确保该方法成功。微电极的质量(其锐度和电阻)及其穿透的细胞过程影响V_m的稳定性和精度。如果信号持续漂移或高于或低于放大器的录制范围,则极有可能电极被阻塞或尖端损坏。如果浸渍只是部分、不足或损坏细胞,则记录的潜在信号爬回 0 mV,导致信号不稳定或没有信号。在某些情况下,电池的内容物也可以阻止非常高的电阻电极。所有这些问题只需用新电极替换即可。

要成功进行防腐,必须确保细胞膜的总电阻不变,且测得的膜电位稳定,电极和膜之间没有泄漏。稳定的微操作器将电极推进到电池上,这一点至关重要。当推进到电池几微米以内时,尖端电位将发生变化,导致检测到的电压略有偏转。为了避免损坏电极尖端或细胞膜拉伸,需要快速推进电极。成功的防浸的特点是膜电位迅速下降,然后围绕膜的静息电位保持稳定。如果电位读数波动,.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
解剖仪器
Aneshetic Vaporiser	Parkland 科学	V3000PK
解剖显微镜	Nikon Instruments Inc.， NY	Eclipse Ti-S
Kleine 断头台 7575 型	哈佛仪器，MA	73-198
Littauer 骨切割器	精细科学工具	16152-15
Moria MC40 超细镊子	精细科学工具	11370-40
手术剪刀 锐钝	精细科学工具	14008-14
缝合	哈佛仪器	72-3287
Vannas 弹簧剪刀	精细科学工具	15018-10
电生理仪器
电荷耦合器件相机	Qimaging， ， BC	Retiga 2000R
差分静电计放大器	WPI	FD223A
在线压力传感器	哈佛仪器，MA	MA1 72-4496
显微作器	Thor labs	PCS-5400
微电极	Warner Instruments LLC， CT	G200-6，
微纤维注射器	WPI	MF28G67-5
微电极支架	WPI	MEH1SF
肌电图	生活系统仪器，VT	CH-1-SH
拉拔器	萨特仪器，圣拉斐尔，CA	P-97
无振动台	TMC	3435-14
软件
Clampex 10	分子器件
p Clamp 10	分子器件
成像软件	尼康，纽约	NIS-elements
Chemicals
NaCl	Sigma	S7653
KCl	Sigma	P4504
MgSO4	Sigma	M7506
CaCl2	Sigma	C3881
HEPES	Sigma	H7006
葡萄糖		Sigma G7021
NaH2PO4	Sigma	S0751
NaHCO3	Sigma	S5761