微电极穿刺法记录灌流中脑动脉的膜电位

摘要

本文的主要目的是详细介绍如何使用微电极穿刺法记录大脑中动脉的膜电位（V_m）。将插管的大脑中动脉平衡以获得肌源性张力，并使用高阻抗微电极穿刺血管壁。

摘要

膜电位（V_m血管平滑肌细胞的膜电位决定了血管张力，从而调控器官的血流量。调控血管平滑肌细胞膜电位的离子通道和生电泵在表达和功能上的变化，会影响血管张力_m 在疾病状态下可能会改变 V_m，血管张力和血流。因此，对电生理学及其准确记录血管平滑肌细胞（VSMC）电活动所需方法的基本理解至关重要。_m 在健康与疾病状态下的研究至关重要。该方法将允许调节 V_m 使用不同的药理学试剂恢复 V_m. 尽管存在多种方法，且各有优缺点，本文提供了记录V的实验方案_m 从中脑动脉等插管阻力血管中，采用微电极穿刺法记录血管平滑肌细胞的膜电位。将中脑动脉置于肌动图装置腔室内，使其形成肌源性张力，随后使用高阻抗微电极穿刺血管壁。该V_m 信号通过静电计收集，经数字化处理后进行分析。该方法可对V提供准确读数。_m 在不损伤细胞且不改变膜电阻的情况下对血管壁进行操作。

引言

细胞的膜电位（V_m）是指细胞质膜两侧离子电荷的相对差异以及膜对这些离子的相对通透性。V_m由离子的不均等分布产生，并由离子通道和离子泵维持。钾离子（K⁺）、钠离子（Na⁺）和氯离子（Cl⁻）等离子通道对静息膜电位（V_m）有重要贡献。血管平滑肌细胞（VSMCs）的质膜上表达有四种以上的K⁺通道¹、两种电压门控Ca²⁺通道（VGCC）²、两种以上的Cl⁻通道^3,4,5、库容性Ca²⁺通道⁶、牵张激活的阳离子通道^7,8以及生电性钠-钾ATP酶泵⁹，这些通道和泵均可能参与V_m的调控。

血管平滑肌细胞（VSMC）的膜电位（V_m）依赖于管腔压力。在未加压的血管中，V_m 范围为 -50 至 -65 mV；然而，在加压的动脉节段中，V_m 范围为 -37 至 -47 mV¹⁰。血管内压力升高会导致血管平滑肌细胞去极化¹¹，降低电压门控钙通道（VGCC）开放的阈值，并增加钙离子内流，从而促进肌源性张力的形成¹²。相反，在被动状态或未加压的血管中，由于钾离子（K⁺）通道活性较高，细胞膜发生超极化，抑制 VGCC 的开放，导致钙离子进入受限，细胞内钙浓度降低，从而减少血管张力¹³。因此，由管腔压力变化引起的 V_m 改变在血管张力的形成中起着关键作用，而 VGCC 和 K⁺ 通道在 V_m 的调控中均发挥重要作用。

V_m 因血管类型和物种而异。V_m 在豚鼠肠系膜上动脉条中为 -54 ± 1.3 mV¹⁴，-45 ± 1 mV（在60 mmHg管腔压力下大鼠大脑中动脉）¹²，以及在40 mmHg管腔压力下大鼠实质动脉中的-35 ± 1 mV¹⁵静息电位_m 在未拉伸的大鼠淋巴管平滑肌中记录到的静息膜电位为 -48 ± 2 mV¹⁶. V_m 脑血管平滑肌细胞的电位比外周动脉更负。相比之下，据报道猫大脑中动脉具有一个V_m 约为 -70 mV，而肠系膜动脉和冠状动脉分别被报道为 -49 mV 和 -58 mV^17,18V 的差异_m 不同血管床之间的差异可能反映了离子通道和生电性钠钾泵在表达和功能上的不同。

膜电位（V_m）的升高和降低分别称为膜去极化和超极化。V_m 的这些变化在多种生理过程中起核心作用，包括离子通道门控、细胞信号传导、肌肉收缩以及动作电位的传播。在恒定压力下，许多内源性和合成的血管舒张化合物通过激活 K⁺ 通道引起膜超极化，从而导致血管舒张^1,13。相反，持续的膜去极化在激动剂诱导或受体介导的血管收缩中至关重要¹⁹。V_m 是一个关键变量，不仅通过电压门控钙通道（VGCC）调节 Ca²⁺ 内流¹³，还影响细胞内钙库中 Ca²⁺ 的释放^20,21 以及收缩装置对 Ca²⁺ 的敏感性²²。

尽管存在多种记录不同细胞类型膜电位（V_m）的方法，但从灌注血管的微电极穿刺法所获得的数据比从分离的血管平滑肌细胞（VSMC）获得的数据更具生理相关性。当使用电流钳技术记录分离的VSMC时，V_m表现为VSMC中自发的瞬时超极化²⁴。分离的VSMC不在合胞体环境中，串联电阻的变化可能引起V_m的振荡行为。相反，在完整血管中记录V_m时未观察到振荡现象，这可能是由于动脉中VSMC之间存在细胞间连接，形成合胞体结构，并在整个血管中产生电位总和，从而维持稳定的V_m²⁴。因此，采用标准微电极穿刺技术在加压血管上测量V_m更接近生理状态。

从套管插入的血管中记录V_m可提供重要信息，因为处于合胞体状态的血管平滑肌细胞（VSMCs）的V_m是血管张力和血流的主要决定因素之一，而对V_m的调控可能为血管的舒张或收缩提供途径。因此，理解记录V_m所涉及的方法学至关重要。本文描述了采用微电极穿刺法对套管插入的中脑动脉（MCAs）进行细胞内V_m记录的技术。本方案将详细介绍如何准备中脑动脉和微电极、设置电位计，并实施穿刺法以记录V_m。此外，还讨论了代表性数据、使用该方法时遇到的常见问题以及潜在问题。

方案

雄性大鼠饲养于经国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC）认证的密西西比大学医学中心（UMMC）动物护理设施中。实验期间，动物可自由获取食物和水。动物饲养环境条件受控，温度维持在 24 ± 2 °C，相对湿度为 60–80%，光照周期为 12 小时明/12 小时暗。所有实验方案均经 UMMC 动物护理与使用委员会批准。

1. 仪器设备的准备

1. 将双通道差分电位计放大器（参见材料表）放置在靠近浴槽室且符合实验需求的位置。
2. 使用 BNC-BNC 电缆将放大器 A 或 B 通道的输出端连接至数据采集器的通道输入端。
3. 将探针安装在显微操作器上，并将其置于显微镜和肌动描记器附近。记录装置必须安装在防震台上。
4. 根据说明书中的说明，将放大器前面板上的旋钮和开关调节至适合本实验的设置位置。
5. 通过适当的电极将浴槽接地端连接至放大器的电路接地端。同样，确保屏蔽笼已接地至放大器的机壳。

2. 微电极的制备与组装

1. 使用硼硅酸盐玻璃微电极（参见材料表），将玻璃尖端拉制成 8–10 mm 的锥形，充满 3 M KCl 后尖端直径小于<1 µm，电阻为 80–120 MΩ。
   1. 使用标准拉制仪，采用以下参数获得短而平缓的锥形：加热温度 = 650；拉速 = 20；拉力 = 25；时间 = 250，并重复循环两次以获得更高的电阻和更小的尖端。参见材料表，因参数设置与仪器型号相关。
      注意：尖端直径小于<1 µm 可在刺入细胞时造成最小损伤。
2. 使用微纤维注射器将 3 M KCl 溶液注入微电极中（参见材料表）。
   1. 将 3 M KCl 注入微电极时，缓慢上拉微纤维注射器的活塞，以便液体充分填充空间，并防止微电极内部产生气泡。
   2. 将微电极完全充满液体，并在插入微电极夹持器前确保无气泡存在。若存在气泡，可用手指轻轻敲击微电极以去除气泡。
3. 小心操作，将微电极杆牢固地通过夹持器的通孔推入。如有过多液体溢出，用纸巾擦除。
4. 将电极夹持组件连接至放大器探头。根据放大器说明书进行电极测试，调节输入偏移，验证零点设置，并检查探头输入漏电流。
5. 使用电极测试功能测量电极电阻，方法如表 1所示。
6. 注意，正常工作的电极在通道输出端会显示每兆欧 1 mV 的正向直流电压偏移。相反，若通道输出端和仪表上出现较大电压，则表明电极堵塞或断裂。
7. 打开记录软件，为文件命名，并将其保存至存储软件中以供后续分析。

3. 大脑中动脉的分离与插管

1. 准备试剂。
   1. 按照表2所述配制正常钙和低钙生理盐溶液（PSS）。
2. 准备肌动描记器。
   1. 用蒸馏水多次冲洗肌动描记器腔室（见材料表），以确保无残留物。向腔室内加入5 mL正常PSS。
   2. 使用5–10 mL注射器将过滤后的正常PSS注入两根玻璃套管中。小心地充满整个套管及其连接的管路，避免引入气泡。
   3. 使用钝头镊子制备两根单丝尼龙缝线（10-0，0.02 mm），每根打一个半结。
   4. 在解剖显微镜下，用解剖镊将部分闭合的缝线结轻轻放置在两根套管尖端稍后的位置。后续实验中，这些结将被滑下并仔细系在套管化的动脉末端，以固定血管。
3. 分离并套管大脑中动脉。
   1. 使用2–4%吸入式异氟烷诱导Sprague Dawley大鼠深度麻醉。
   2. 在深度麻醉状态下，使用断头器对大鼠进行断头。
   3. 使用骨剪和剪刀小心去除颅骨。
   4. 将脑组织从颅骨中取出，并置于盛有5 mL冰上预冷的低钙PSS的容器中。
   5. 使用弹簧剪和镊子从脑组织中识别并分离出一段无分支的大鼠大脑中动脉（MCA），其内径为100–200 μm。
   6. 使用精细镊子将MCA套入玻璃套管，并在含正常PSS的肌动描记器中通过收紧缝线固定血管。
   7. 封闭远端套管，使MCA内无液体流动。
   8. 将进液端导管连接至盛有PSS的储液器，以控制管腔内压力，并通过串联的压力传感器进行监测。
   9. 使用安装在倒置显微镜上的电荷耦合器件相机（见材料表）及成像软件观察套管化的MCA。
   10. 将MCA的轴向长度调节至适当长度，使其既不僵硬也不松弛。
   11. 用O₂（95%）和CO₂（5%）在37 °C条件下平衡浴液，以提供充分的氧合、维持恒定温度，并将pH值保持在7.4。
4. 穿刺（穿透细胞质膜）血管平滑肌细胞。
   1. 连接接地电极，并保持其浸没在肌动描记器的PSS中。
   2. 照亮血管腔室，通过显微镜观察微电极尖端在浴液中的位置。
      注意：也可通过配备成像软件的计算机观察MCA和微电极。
   3. 使用显微操作器的控制装置将微电极尖端移至血管外壁附近。显微操作器和微电极尖端相对于组织必须保持稳定。
      注意：实验开始前，确认膜电位已稳定。若测得的电压不稳定，则表明电极与细胞之间的连接未密封，可能存在泄漏。
   4. 开始记录。
   5. 缓慢移动微电极尖端朝向血管，利用显微操作器的粗调或微调功能，目标对准血管中心。
      注意：有时当微电极尖端接触肌纤维膜时，记录中可能出现轻微偏转。
   6. 当微电极尖端接近血管时，使用显微操作器快速向前推进电极，以穿刺肌细胞膜。
   7. 此时可开始观察所记录的V_m 变化。微电极穿刺细胞膜时，切勿触碰显微操作器。
      注意：记录电极与参考电极之间的电压差会从0 mV下降至-40 mV至-75 mV之间，具体数值取决于血管内压力水平或其他兴奋性或抑制性刺激。这些读数表征当前细胞的跨膜电位差。
   8. 在同一血管的不同区域进行多次穿刺，避免损伤血管平滑肌细胞（VSMCs），以获得准确测量结果。
   9. 记录完成后，使用操作器迅速将微电极撤出。
   10. 停止记录，并保存数据文件以供后续分析。

结果

该方法可稳定用于记录插管血管中的膜电位（V_m）。图1A简要描述了从脑组织中分离大脑中动脉（MCA）的操作流程。将脑组织从颅骨中分离后，解剖出MCA并置于含有低钙PSS的培养皿中。在分离过程中，使用弹簧剪和镊子将附着在MCA上的部分结缔组织一并解剖去除，以防止MCA受损。随后小心地进一步清除结缔组织，解剖完成的MCA即可转移至肌动描记器（myograph）中。将MCA固定在插管上，并在肌动描记器中用缝合结在插管两端扎紧。典型的微电极穿刺法实验装置示意图见图1B。充满3 M KCl溶液的微电极通过探头中的电极夹与电位计相连。电位计的通道输出端通过BNC-BNC电缆连接至数据采集器的模拟输入通道。数据采集器的输出进一步连接至示波器，以便在记录软件中观察信号。接地通过从电位计机箱引出的AgCl颗粒导线实现，该导线延伸至肌动描记器中的浴液中。最终，数字信号迹线可在计算机显示器上的记录软件中实时显示。

讨论

本文提供了使用锋利微电极穿刺法记录灌流血管标本膜电位（V_m）所需的各项步骤。该方法应用广泛，可获得高质量且稳定的V_m记录数据，适用于回答多种实验科学问题。

以下介绍一些关键注意事项和故障排除步骤，以确保本方法的成功实施。微电极的质量（包括其尖锐程度和电阻）以及其所穿刺的细胞结构会影响膜电位（V_m）记录的稳定性和准确性。如果信号持续漂移，或超出放大器的记录范围，很可能是因为电极被堵塞或尖端已断裂。如果穿刺不完全、不足或对细胞造成损伤，则记录到的电位会回升至0 mV，导致信号不稳定或无法记录到信号。在某些情况下，细胞内容物也可能堵塞高电阻电极。上述所有问题通常只需更换新的电极即可解决。

要成功进行穿刺，必须确保细胞膜的总电阻保持不变，且测得的膜电位稳定，电极与膜之间无泄漏。电极必须通过稳定的显微操作器向细胞推进，这一点至关重要。当电极推进至距离细胞几微米范围内时，电极尖端电位将发生变化，导致检测到的电压出现轻微偏转。为避免损伤电极尖端或拉伸细胞膜，需快速推进电极。成...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
解剖器械
麻醉蒸发器	Parkland Scientific	V3000PK
解剖显微镜	Nikon Instruments Inc., NY	Eclipse Ti-S
Kleine Guillotine Type 7575	Harvard Apparatus, MA	73-198
Littauer 骨剪	Fine Science Tools	16152-15
Moria MC40 超细镊子	Fine Science Tools	11370-40
锐钝外科剪	Fine Science Tools	14008-14
缝合线	Harvard Apparatus	72-3287
Vannas 弹簧剪	Fine Science Tools	15018-10
电生理仪器
电荷耦合器件相机	Qimaging, BC	Retiga 2000R
差分电位放大器	WPI	FD223A
串联式压力传感器	Harvard Apparatus, MA	MA1 72-4496
显微操作器	Thorlabs	PCS-5400
微电极	Warner Instruments LLC, CT	G200-6
Micro Fil（微纤维注射器）	WPI	MF28G67-5
微电极夹持器	WPI	MEH1SF
肌动描记仪	Living Systems Instrumentation, VT	CH-1-SH
拉制仪	Sutter Instrument, San Rafael, CA	P-97
防振台	TMC	3435-14
软件
Clampex 10	Molecular Devices
pClamp 10	Molecular Devices
成像软件	Nikon, NY	NIS-Elements
化学试剂
NaCl	Sigma	S7653
KCl	Sigma	P4504
MgSO4	Sigma	M7506
CaCl2	Sigma	C3881
HEPES	Sigma	H7006
葡萄糖	Sigma	G7021
NaH2PO4	Sigma	S0751
NaHCO3	Sigma	S5761