本文的主要目的是详细介绍如何使用微电极穿刺法记录大脑中动脉的膜电位（Vm）。将插管的大脑中动脉平衡以获得肌源性张力，并使用高阻抗微电极穿刺血管壁。
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本文内容
摘要
摘要
膜电位（Vm血管平滑肌细胞的膜电位决定了血管张力，从而调控器官的血流量。调控血管平滑肌细胞膜电位的离子通道和生电泵在表达和功能上的变化，会影响血管张力m 在疾病状态下可能会改变 Vm，血管张力和血流。因此，对电生理学及其准确记录血管平滑肌细胞（VSMC）电活动所需方法的基本理解至关重要。m 在健康与疾病状态下的研究至关重要。该方法将允许调节 Vm 使用不同的药理学试剂恢复 Vm. 尽管存在多种方法，且各有优缺点，本文提供了记录V的实验方案m 从中脑动脉等插管阻力血管中，采用微电极穿刺法记录血管平滑肌细胞的膜电位。将中脑动脉置于肌动图装置腔室内，使其形成肌源性张力，随后使用高阻抗微电极穿刺血管壁。该Vm 信号通过静电计收集，经数字化处理后进行分析。该方法可对V提供准确读数。m 在不损伤细胞且不改变膜电阻的情况下对血管壁进行操作。
引言
细胞的膜电位（Vm）是指细胞质膜两侧离子电荷的相对差异以及膜对这些离子的相对通透性。Vm由离子的不均等分布产生，并由离子通道和离子泵维持。钾离子（K+）、钠离子（Na+）和氯离子（Cl−）等离子通道对静息膜电位（Vm）有重要贡献。血管平滑肌细胞（VSMCs）的质膜上表达有四种以上的K+通道1、两种电压门控Ca2+通道（VGCC）2、两种以上的Cl−通道3,4,5、库容性Ca2+通道6、牵张激活的阳离子通道7,8以及生电性钠-钾ATP酶泵9，这些通道和泵均可能参与Vm的调控。
血管平滑肌细胞（VSMC）的膜电位（Vm）依赖于管腔压....
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方案
雄性大鼠饲养于经国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC）认证的密西西比大学医学中心（UMMC）动物护理设施中。实验期间，动物可自由获取食物和水。动物饲养环境条件受控，温度维持在 24 ± 2 °C，相对湿度为 60–80%，光照周期为 12 小时明/12 小时暗。所有实验方案均经 UMMC 动物护理与使用委员会批准。
1. 仪器设备的准备
- 将双通道差分电位计放大器（参见材料表）放置在靠近浴槽室且符合实验需求的位置。
- 使用 BNC-BNC 电缆将放大器 A 或 B 通道的输出端连接至数据采集器的通道输入端。
- 将探针安装在显微操作器上，并将其置于显微镜和肌动描记器附近。记录装置必须安装在防震台上。
- 根据说明书中的说明，将放大器前面板上的旋钮和开关调节至适合本实验的设置位置。
- 通过适当的电极将浴槽接地端连接至放大器的电路接地端。同样，确保屏蔽笼已接地至放大器的机壳。
2. 微电极的制备与组装
- 使用硼硅酸盐玻璃微电极（参见材料表），将玻璃尖端拉制成 8–10 mm 的锥形，充满 3 M KCl 后尖端直径小于<1 µm，电阻为 80–120 MΩ。
- 使用标准拉制仪，采用以下参数获得短而平....
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结果
该方法可稳定用于记录插管血管中的膜电位（Vm）。图1A简要描述了从脑组织中分离大脑中动脉（MCA）的操作流程。将脑组织从颅骨中分离后，解剖出MCA并置于含有低钙PSS的培养皿中。在分离过程中，使用弹簧剪刀和镊子将附着的部分结缔组织与MCA一同解剖下来，以防止MCA受损。随后小心去除结缔组织，解剖完成的MCA即可转移至肌动描记器中。将MCA固定在插管上，并在肌动描记器中用缝合结在插管两端扎紧。典型的微电极穿刺法装置示意图见图1B。充满3 M KCl溶液的微电极通过探头中的电极夹与电位计相连。电位计的通道输出端通过BNC-BNC电缆连接至数模转换器的模拟输入通道。数模转换器的输出进一步连接至示波器，以便在记录软件中观察信号。接地通过从电位计机箱引出的AgCl颗粒导线连接至肌动描记器中的浴液来实现。最终，数字信号在计算机显示器上的记录软件中显示。
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讨论
本文提供了使用锋利微电极穿刺法记录灌流血管标本膜电位（Vm）所需的各项步骤。该方法应用广泛，可获得高质量且稳定的Vm记录数据，适用于回答多种实验科学问题。
以下介绍一些关键注意事项和故障排除步骤，以确保本方法的成功实施。微电极的质量（包括其尖锐程度和电阻）以及其所穿刺的细胞结构会影响膜电位（Vm）记录的稳定性和准确性。如果信号持续漂移，或超出放大器的记录范围，很可能是因为电极被堵塞或尖端已断裂。如果穿刺不完全、不足或对细胞造成损伤，则记录到的电位会回升至0 mV，导致信号不稳定或无法记录到信号。在某些情况下，细胞内容物也可能堵塞高电阻电极。上述所有问题通常只需更换新的电极即可解决。
要成功进行穿刺，必须确保细胞膜的总电阻保持不变，且测得的膜电位稳定，电极与膜之间无泄漏。电极必须通过稳定的显微操作器向细胞推进，这一点至关重要。当电极推进至距离细胞几微米范围内时，电极尖端电位将发生变化，导致检测到的电压出现轻微偏转。为避免损伤电极尖端或拉伸细胞膜，需快速推进电极。成.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作部分得到了密西西比大学医学中心（UMMC）院内支持研究计划（IRSP）以及授予 Mallikarjuna R. Pabbidi 的美国心脏协会科学家发展基金（13SDG14000006）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 解剖器械 | |||
| 麻醉蒸发器 | Parkland Scientific | V3000PK | |
| 解剖显微镜 | Nikon Instruments Inc., NY | Eclipse Ti-S | |
| Kleine Guillotine Type 7575 | Harvard Apparatus, MA | 73-198 | |
| Littauer 骨剪 | Fine Science Tools | 16152-15 | |
| Moria MC40 超细镊子 | Fine Science Tools | 11370-40 | |
| 锐钝外科剪 | Fine Science Tools | 14008-14 | |
| 缝合线 | Harvard Apparatus | 72-3287 | |
| Vannas 弹簧剪 | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| 电生理仪器 | |||
| 电荷耦合器件相机 | Qimaging, BC | Retiga 2000R | |
| 差分电位放大器 | WPI | FD223A | |
| 串联式压力传感器 | Harvard Apparatus, MA | MA1 72-4496 | |
| 显微操作器 | Thorlabs | PCS-5400 | |
| 微电极 | Warner Instruments LLC, CT | G200-6 | |
| Micro Fil（微纤维注射器） | WPI | MF28G67-5 | |
| 微电极夹持器 | WPI | MEH1SF | |
| 肌动描记仪 | Living Systems Instrumentation, VT | CH-1-SH | |
| 拉制仪 | Sutter Instrument, San Rafael, CA | P-97 | |
| 防振台 | TMC | 3435-14 | |
| 软件 | |||
| Clampex 10 | Molecular Devices | ||
| pClamp 10 | Molecular Devices | ||
| 成像软件 | Nikon, NY | NIS-Elements | |
| 化学试剂 | |||
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| 葡萄糖 | Sigma | G7021 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S0751 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 |
参考文献
- Nelson, M. T., Quayle, J. M. Physiological roles and properties of potassium channels in arterial smooth muscle. American Journal of Physiology. 268, C799-C822 (1995).
- Hughes, A. D. Calcium channels in vascular smooth muscle cells. Journal of Va....
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重印与许可
