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小鼠经颅光生物调节治疗方案

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DOI：

10.3791/59076

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2018年11月18日

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1Neurosciences Research Center, Tabriz University of Medical Sciences, 2ProNeuroLIGHT LLC, 3LiteCure LLC, 4Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 5Depression Clinical and Research Program, Department of Psychiatry, Massachusetts General Hospital, 6Center for Anxiety and Traumatic Stress Disorders, Department of Psychiatry, Massachusetts General Hospital, 7Research Institute for Applied Physics and Astronomy, University of Tabriz, 8Department of Medical Physics, Tabriz University of Medical Sciences, 9Department of Medical Bioengineering, Tabriz University of Medical Sciences, 10School of Medical Sciences, University of Aberdeen

本文内容

摘要

光生物调节疗法是一种创新的非侵入性治疗手段，可用于治疗多种神经系统和精神疾病，同时也能改善健康大脑的功能。本方案提供了通过经颅光照递送在小鼠中实施脑部光生物调节的逐步操作指南，该方法可适用于其他实验啮齿类动物。

摘要

经颅光生物调节是一种潜在的创新性无创治疗方法，有望改善多种神经和精神疾病中的脑生物能量代谢和脑功能，并增强与年龄相关的认知衰退及神经退行性疾病中的记忆力。本文描述了一种在小鼠中实施经颅光生物调节治疗（PBMT）的实验室方案。对18月龄的衰老BALB/c小鼠进行为期2周、每日一次的660 nm激光经颅照射。激光透射数据显示，约有1%的入射红光可穿透至大脑皮层表面以下1 mm深度，达到背侧海马区。治疗效果通过两种方法进行评估：巴恩斯迷宫测试（用于评价依赖海马的空间学习与记忆能力）以及检测海马组织中的ATP水平（作为生物能量代谢的指标）。巴恩斯迷宫测试结果显示，与同龄对照组相比，接受激光治疗的老年小鼠空间记忆能力显著增强。激光治疗后的生化分析表明，海马区ATP水平升高。我们推测，记忆功能的改善可能源于红光照射诱导的海马能量代谢增强。在小鼠中获得的这些观察结果可推广至其他动物模型，因为本方案有望适用于转化神经科学中常用的其他物种，如兔、猫、犬或猴。经颅光生物调节是一种安全且成本效益高的干预手段，可能成为治疗年龄相关认知障碍的有前景的治疗策略。

引言

光生物调节疗法（PBMT），或称低强度激光光疗（LLLT），是一个通用术语，指利用激光或发光二极管（LED）发出的光能刺激生物组织以达到治疗目的的各种方法。几乎所有PBMT治疗均采用波长为600至1100 nm的红光至近红外（NIR）光，输出功率范围为1至500 mW，能量密度范围为<1至>20 J/cm2（参见Chung等人的研究1）。

经颅光生物调节疗法（PBMT）是一种非侵入性的光递送方法，通过使用外部光源（激光或LED）照射头部来实施2。在动物应用中，该方法包括将LED或激光探头直接接触或非接触地放置于动物头部。根据目标治疗区域的不同，光探头可置于整个头部（以覆盖所有脑区），也可置于头部特定区域，例如前额叶、额叶或顶叶区域。红光/近红外光可部分穿透头皮、颅骨和硬脑膜，到达大脑皮层表面，并提供足够能量的光子以产生治疗效应。随后，到达皮层水平的光通量将进一步传播至大脑的灰质和白质，直至抵达脑内更深层结构3。

红光至远红光谱段（600–680 nm）以及近红外早期波段（800–870 nm）的光与线粒体呼吸链末端酶细胞色素c氧化酶的吸收光谱相对应4。据假说，红光/近红外光的光生物调节疗法（PBMT）可导致一氧化氮（NO）从细胞色素c氧化酶上发生光解离，从而促进线粒体电子传递，并最终增加ATP的生成5。在神经科学应用方面，已有多种临床前研究报道了经颅照射方式实施脑部PBMT可能带来的神经刺激益处，这些研究包括创伤性脑损伤（TBI）6、急性脑卒中7、阿尔茨海默病（AD）8、帕金森病（PD）9、抑郁症10以及衰老11的啮齿类动物模型。

脑衰老被认为是一种神经心理学状态，会对某些认知功能产生负面影响，例如学习和记忆能力12。线粒体是负责ATP生成和神经元生物能量的主要细胞器。已知线粒体功能障碍与海马等脑区与年龄相关的空间导航记忆缺陷有关13。由于头颅部位接受红光/近红外光治疗主要通过调节线粒体生物能量发挥作用，因此向海马区域输送足够的光剂量可改善空间记忆表现14。

本实验方案旨在演示使用低强度红光对小鼠进行经颅光生物调节治疗（PBMT）的操作过程。文中描述了激光穿透老龄小鼠头部组织所需的光传输测量方法。此外，采用巴恩斯迷宫（一种依赖海马体的空间学习与记忆任务）以及海马体三磷酸腺苷（ATP）水平（作为生物能量学指标）来评估该治疗对动物的影响效果。

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方案

所有操作均按照美国国立卫生研究院（NIH；出版号85-23，1985年修订版）《实验动物护理和使用指南》的规定进行，并经大不里士医科大学地区伦理委员会批准。

警告：本方案涉及3B类激光仪器的使用，需要经过适当的培训并严格遵守安全指南。3B类激光可能对眼睛造成严重损伤，并可能灼热皮肤。3B类激光不被视为烧伤危害。操作激光设备时必须始终佩戴护目镜。

1. 激光透射实验

注意：本实验使用了三只来自大不里士医科大学动物实验中心的18月龄雄性BALB/c小鼠。光源采用功率为60 mW、波长为660 nm、光束呈直径2.5 mm圆形的激光器。该激光源产生具有高斯强度分布的圆偏振光，并以连续波模式运行。使用商用光电二极管功率计测量样品透射光功率，该功率计分辨率为10 nW，光电二极管有效面积为1 cm2的正方形，光谱响应范围为400至1100 nm。

  1. 样品制备
    1. 为了获得新鲜样品，使用氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）混合物对小鼠进行深度麻醉。
    2. 使用普通剪刀从小鼠肩部上方位置开始解剖其头部。
    3. 旋转头部，使下颌腹侧朝上。将斜角解剖剪平滑地穿过口腔，直至感受到下颌关节的阻力。剪断连接下颌骨与颅骨的所有大块肌肉并弃去。
    4. 使用斜角解剖剪去除腭骨。
    5. 使用弯头镊子去除颅骨周围的所有软组织。
    6. 解剖颅骨的下部，然后用弯头刮匙小心地将脑组织从剩余的颅骨中取出。
    7. 将完整的脑组织固定在2%琼脂糖凝胶中，以便后续切片。
      注意：若需获得完整的颅骨加头皮样品，应从动物头部腹侧移除脑组织，同时确保头部背侧部分不受损伤。
  2. 脑切片操作步骤
    1. 在振动切片机安装块表面滴加一滴瞬干胶（约0.05 mL）。
    2. 小心地将琼脂糖块粘附在振动切片机安装块上，使脑组织的腹面朝下，并调整其位置。
    3. 轻微调整振动切片机刀片与琼脂糖块上表面齐平，并记录此时切割值作为初始基准水平。
    4. 用冰浴的生理盐水充满振动切片机的槽体。
    5. 调节振动切片机参数（例如 切片厚度 [1 mm]、速度 [设备单位5/5] 和振动频率 [设备单位5/5]），以获得满意的切片效果。
    6. 将脑组织横向切成厚度为1,000 µm的切片。
      注意：该切片是指由皮层表面及位于皮层表面下方1,000 µm处平面所限定的脑组织部分（即背侧海马区）。
    7. 在光学玻璃表面滴加一滴水（约0.05 mL），将脑切片置于其上。然后在脑切片上再滴加一滴水，并小心地将第二片光学玻璃覆盖其上。
      注意：应在样品玻璃边缘处滴加水滴，以防止组织干燥以及因表面粗糙导致的光散射。
  3. 测量光通过头部组织的透射率
    1. 设置光学设备，包括激光器、反射镜和功率计单元。
      警告：开启激光器前必须佩戴防护眼镜。
    2. 在功率计表面无样品时开启激光器，并将激光束聚焦于适当距离的反射镜上，使光束垂直照射到光电二极管的感光区域。
      注意：光透射测量必须在室温（23–25 °C）的暗室中进行，且在头部组织提取后30分钟内完成。
    3. 对切片脑组织进行测量。
      1. 将两片空白光学玻璃放置在功率计表面。
      2. 从功率计显示屏读取透射光功率（I0），并记录数值。
      3. 轻柔地将夹在两片光学玻璃之间的脑样品放置在功率计表面，将光束聚焦于组织对应区域，读取透射功率并记录数值。
    4. 对颅骨加头皮组织进行测量。
      1. 将一片空白光学玻璃放置在功率计表面。
      2. 从功率计显示屏读取透射光功率（I0），并记录数值。
      3. 轻轻将带有新鲜颅骨加头皮组织的光学玻璃放置在功率计表面，使光束对准前囟区域，读取透射功率并记录数值。
      4. 为最大化信噪比，应对所有样品至少重复光透射测量3次。
        注意：前囟区域位于通过耳基前缘连线前方约3 mm处。颅骨加头皮组织的厚度使用标准游标卡尺测量。

2. 光生物调节治疗（PBMT）

注意：共使用45只雄性BALB/c小鼠，随机分为3组，每组15只。各组分别为接受假性PBMT处理的年轻对照组小鼠（2月龄）、接受假性PBMT处理的年老对照组小鼠（18月龄）以及接受PBMT处理的年老小鼠（18月龄）。假性PBMT处理的操作与PBMT组完全相同，但激光设备处于关闭状态。小鼠来源于大不里士医科大学动物实验中心，并饲养于神经科学研究中⼼（NSRC）的动物饲养单元，环境温度为24–25 °C，相对湿度为55%，光照周期为12小时光照/12小时黑暗。食物和水自由供应。ad libitum。所有小鼠在开始处理前均适应环境至少1周。

  1. 激光治疗程序
    注意：采用波长为660 nm的连续波模式GaAlAs半导体激光器进行经颅光生物调节治疗（PBMT）。激光设备的输出功率为200 ± 2 mW，辐照度为6.66 W/cm2，光斑面积为0.03 cm2。每次治疗持续照射15秒，头皮表面接受的平均能量密度为99.9 J/cm2。照射每日进行1次，连续进行2周。
    1. 在开始治疗前约20分钟，将小鼠连同其饲养笼带入治疗室。
    2. 将电源保护器插入墙壁插座。
    3. 将激光设备的插头插入电源保护器。
    4. 在激光探头尖端覆盖一层透明尼龙薄膜，以防止对表面造成划伤。
    5. 小心地将探头连接至激光设备的通道。
    6. 打开激光设备，等待数秒使其预热。
    7. 调节激光/治疗参数，包括照射时间和工作模式。
    8. 在无样本情况下，将探头尖端接触激光设备功率计的活性区域，测定激光平均功率。记录该数值。
    9. 重复校准过程（步骤2.1.8）至少5次，读取功率计显示屏上的入射功率值，并记录。
    10. 用手掌轻轻抓住小鼠颈部背侧皮肤，固定其头部。
      注意：在本方案中，激光探头放置于前囟区域，该位置位于两耳内侧基部连线前方约3 mm处。
    11. 将探头尖端轻柔地直接置于头皮中线位置，位于两耳前基部连线前方约3 mm处。
      注意：探头应与腹部平面呈约45°角持握。
    12. 为避免激光直接照射动物眼睛，应先将探头尖端接触头部，然后再开启激光设备。
    13. 开启激光，并稳定持握探头直至照射完成。
    14. 治疗结束后，将激光探头从头部移开，并轻柔地将小鼠放回其饲养笼中。
    15. 关闭激光设备，并将探头从设备上断开。
    16. 使用适当的光学清洁剂清洁激光探头。
    17. 将小鼠转移回动物饲养设施。

3. 行为学任务

  1. 旷场实验
    1. 按照先前所述方法15，通过小鼠在旷场实验期间的总移动距离来评估每只小鼠的运动活动能力。
  2. 巴恩斯迷宫任务
    1. ​装置
      注意：空间学习与记忆任务在巴恩斯迷宫中进行16。用于该神经行为学任务的装置由一个黑色木质圆形平台组成（直径95 cm），平台上设有20个等距分布、直径为5 cm的圆形孔洞，孔洞位于平台边缘内侧3 cm处。装置离地高度为50 cm，以防止动物爬下。一个可移动的黑色塑料逃生箱（20 cm × 15 cm × 5 cm）放置在逃生孔下方。测试白色小鼠时使用黑色迷宫，当使用软件追踪系统时，应在迷宫下方放置一块黑色垫子。
      1. 将迷宫装置放置在一个安静房间的中央，并确保顶部有明亮的照明。
      2. 在任务室门外张贴“禁止进入”的标识""。
      3. 在周围墙壁上贴上视觉空间线索。
      4. 在迷宫平台正上方安装一台数码摄像机。
      5. 用70%乙醇清洁迷宫平台表面，以去除不必要的嗅觉线索。
      6. 将动物饲养笼中的少量垫料放入逃生箱内部，作为嗅觉线索。
    2. 适应阶段
      1. 在实验开始前约30分钟将每只小鼠带入任务房间，使其适应环境。
      2. 将小鼠从笼中取出，并轻轻放入逃生箱中，停留1分钟。
    3. 训练阶段
      注意：每只小鼠需连续4天重复进行训练阶段。
      1. 轻轻地将小鼠从逃生箱中取出。
      2. 将小鼠放置于平台中心，然后将起始室罩在其上方。
      3. 10秒后移除起始室，允许小鼠在迷宫中自由探索3分钟。
      4. 安静地移动到计算机操作区域，并戴上降噪耳机。
      5. 启动一个负性听觉刺激，即在平台水平产生约80 dB的高强度白噪声，同时开始录像记录小鼠行为。
      6. 当小鼠进入逃生箱时，关闭白噪声并停止录像，让动物在箱内不受干扰地停留1分钟。
      7. 将小鼠从逃生箱中取出，并放回其饲养笼中。
      8. 每天重复步骤3.4.2至3.4.7共4次，每次试验之间间隔3分钟。
        注意：每次试验之间，需清除迷宫表面的尿液或粪便，并用70%乙醇清洁迷宫。
    4. 探查试验阶段
      1. 在最后一次训练试验24小时后，将逃生箱从迷宫平台上移除，并重复执行步骤3.4.2至3.4.5。
      2. 3分钟后，关闭白噪声并停止录像，将小鼠从迷宫中取出并放回其饲养笼中。
      3. 在所有动物完成测试后，清洁迷宫平台和起始室，关闭房间灯光，并从门上取下“禁止进入”标识""。
      4. 将测试期间的视频记录存储至外接硬盘，以供后续分析。
      5. 设置视频追踪软件程序，从录制的视频中提取相关参数，包括在连续4天训练期间找到目标孔的潜伏时间，以及在探查试验阶段在目标象限停留的时间。

4. 生物化学评估

  1. 海马体中的ATP水平
    1. 通过腹腔注射氯胺酮（每克体重100 mg）和赛拉嗪（每克体重10 mg）的混合物，使每只小鼠深度麻醉。
    2. 将动物断头，并迅速从颅骨中取出脑组织。
    3. 解剖分离海马体，并使用组织匀浆器在冰浴的样品缓冲液（试剂盒提供）中匀浆组织。
    4. 立即在4 °C条件下以2,000 x g离心3分钟。
    5. 将上清液转移至洁净的离心管中。
    6. 采用先前所述的分光光度法测定海马体ATP水平11。

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结果

统计学分析

Barnes训练实验获得的数据采用双因素方差分析（two-way ANOVA）进行统计分析；其他行为学实验及各组间海马ATP水平的比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行Tukey事后检验。所有数据均以均值±均值标准误（SEM）表示，激光透射数据除外，后者以均值±标准差（SD）表示。显著性水平设定为p < 0.05。

激光透射

当激光束聚焦于老年小鼠的前囟时（样本厚度为 0.85 ± 0.09 mm），660 nm 激光穿过颅骨及头皮组织的透射率为 15.67% ± 0.87%（

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讨论

我们描述了一种在小鼠中进行经颅光生物调节治疗（PBMT）的操作方案。该方案主要面向开展以啮齿类动物为研究对象的光生物调节研究的神经科学研究实验室。然而，该方案也可根据需要调整，适用于神经科学领域常用的其他实验动物，如兔、猫、狗或猴。

目前，人们对使用红光/近红外激光和LED进行经颅光生物调节治疗（PBMT）的研究兴趣日益增加。为了在啮齿类动物中成功完成整个治疗过程，需要考虑一些关键步骤。

首先，在对活体动物进行任何处理之前，必须精确测量光穿过动物头部组织的穿透情况，以递送最佳的光子剂量（J/cm2）。

其次，根据病理影响及治疗靶向的脑区，需要优化多个参数，以最大化光穿透深度并提高获得积极疗效的可能性。这些参数包括照射时间、治疗间隔、施加的辐照度以及能量密度。例如，在老年动物模型中，向脑部海马体和额叶皮层输送足够的辐射剂量至关重要，因为这些区域与年龄相关的病理变化相关2。靶组织中的最佳能量密度速率是光生物...

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披露

P.C. 的薪资由哈佛大学精神病学系（杜邦-沃伦研究员项目和利文斯顿奖）、脑与行为研究基金会（NARSAD 青年研究者奖）以及 Photothera 公司的无限制资助提供支持。药物捐赠来自 TEVA 公司。差旅费用报销由 Pharmacia-Upjohn 公司提供。P.C. 已从强生研发部门获得咨询费。P.C. 已申请多项与近红外光在精神病学中应用相关的专利。PhotoMedex 公司为一项临床研究提供了四台设备。P.C. 从 Litecure 公司获得无限制资金，用于开展经颅光生物调节治疗重度抑郁障碍的研究，以及对健康受试者进行的研究。P.C. 联合创办了一家公司（Niraxx Light Therapeutics），致力于基于近红外光的新治疗方式的开发；他同时担任该公司的顾问。P.C. 收到了来自 Cerebral Sciences 的资助，用于开展经颅光生物调节治疗广泛性焦虑障碍的研究。其他作者声明无利益冲突。

致谢

本研究得到了伊朗大不里士医科大学（项目编号：61019）向 S.S.-E. 提供的资助，以及美国特拉华州纽瓦克市 LiteCure LLC 公司向 L.D.T. 提供的出版资助。作者谨此感谢大不里士医科大学免疫学系及教育发展中心（EDC）提供的大力支持与协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
氯胺酮Alfasan#1608234-01
赛拉嗪Alfasan#1608238-01
琼脂糖Sigma#A4679
超级胶水Quickstar
振动切片机Campden Instruments#MA752-707
光学玻璃Sail Brand#7102
功率计Thor labs#PM100D
光电二极管探测器Thor labs#S121C
卡尺Pittsburgh
砷化镓铝激光器Thor Photomedicine
EthoVisionNoldus
离心机Froilabo#SW14R
耳罩Blue Eagle
数码相机Visionlite#VCS2-E742H
立体声放大器Sony
乙醇Hamonteb#665.128321
巴恩斯迷宫定制
ATP检测试剂盒Sigma#MAK190
酶标仪Awareness#Stat Fax 2100

参考文献

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