我们介绍一种从复杂的生物样品中纯化、检测和鉴定来源于泛素化蛋白质的diGly肽的方法。该方法具有良好的重复性和稳健性，在泛素化修饰组分析的深度方面优于已发表的方法。
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摘要
摘要
蛋白质通过小分子蛋白泛素进行翻译后修饰，参与多种细胞活动。在泛素化蛋白质经胰蛋白酶消化后，可产生带有二甘氨酸残基共价连接至赖氨酸ε-氨基的肽段（“K-ε-二甘氨酸”或简称为“diGly”），可用于追溯原始修饰位点。通过高效的diGly肽段免疫富集结合质谱高灵敏度检测，迄今已鉴定的泛素化位点数量大幅增加。我们对该实验流程进行了多项优化，包括在富集步骤前对肽段进行离线高pH反相分级分离，以及在离子导向多极装置中采用更先进的肽段碎裂参数设置。此外，使用基于滤膜的微柱对样本进行更高效的纯化，有助于保留抗体磁珠，从而提高对diGly肽段的富集特异性。这些改进使得在蛋白酶体抑制条件下，从人宫颈癌细胞（HeLa）裂解液中常规检测到超过23,000个diGly肽段。我们展示了该策略在多种不同类型细胞以及脑组织等体内样本泛素化修饰谱深度分析中的有效性。本研究为蛋白质泛素化分析工具箱提供了新的方法，有助于深入揭示细胞内复杂的泛素化修饰图谱。
引言
泛素与蛋白质的共价连接可标记其被蛋白酶体降解，是蛋白质稳态中的关键过程。泛素的C端羧基与靶蛋白赖氨酸的ε-氨基形成异肽键1,2。此外，泛素还可连接至其他泛素模块，从而形成同型（如K48或K11连接）或分支型（即异型或混合型）的多聚泛素结构1,3。泛素最广为人知的功能是通过K48连接的多聚泛素介导蛋白酶体降解。然而，现已明确单泛素化和多泛素化也参与多种不依赖蛋白酶体降解的生物学过程。例如，K63连接的泛素链在细胞内运输、溶酶体降解、激酶信号传导以及DNA损伤应答中发挥非降解性功能4,5。其余六种连接类型相对稀少，其功能在很大程度上仍不明确，但随着新型特异性检测工具的开发，关于它们在细胞中作用的初步线索正逐渐浮现6,7。
质谱技术已成为蛋白质组分析不可或缺的工具，如今在单次实验中即可鉴定出几乎任何生物来源的数千种不同蛋白质。蛋白质的翻译后修饰（PTMs）（例如磷酸化、甲基化、乙酰化和泛素化）为研究增加了额外的复杂性，这些修饰能够调节蛋白质的活性。随着质谱技术的发展，大规模鉴定携带翻译后修饰的蛋白质已成为可能。由于携带翻译后修饰的肽段与其未修饰形式相比化学计量比相对较低，这构成了技术上的挑战，因此在质谱分析之前通常需要进行生物化学富集步骤。在过去的二十年中，已开发出多种不同的特异性富集方法用于翻译后修饰的分析。
由于蛋白质泛素化在细胞中具有多种功能，因此迫切需要开发用于检测蛋白质上泛素化位点的分析方法8。质谱技术的应用使得在果蝇、小鼠、人类和酵母蛋白质中鉴定出的泛素化位点数量迅速增加9,10,11,12,13,14。其中一个重要进展是开发出基于免疫沉淀的肽段富集策略，利用特异性识别K-ε-GG残基基序（也称为“二甘氨酸”或“diGly”）的抗体进行富集。这些diGly肽段是在使用胰蛋白酶作为蛋白酶消化泛素化蛋白质后产生的15,16。
本文介绍了一种通过免疫富集结合Orbitrap质谱检测来富集二甘氨酸化（diGly）肽段的优化工作流程。通过整合现有流程的多项改进，特别是在样品制备和质谱分析阶段的优化，我们能够常规地从经蛋白酶体抑制剂处理的单个HeLa细胞样品中鉴定出超过23,000种diGly肽段，从未处理的HeLa细胞中鉴定出约10,000种。该方案已成功应用于未标记和使用细胞培养中氨基酸稳定同位素标记（SILAC）的HeLa细胞裂解液，以及脑组织等内源性样品。
该工作流程为泛素化位点分析工具库提供了一个有价值的补充，有助于揭示深层次的泛素化蛋白质组。以下方案详细描述了该工作流程的各个步骤。
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方案
本文所述所有方法均已获得伊拉斯姆斯医学中心机构动物护理和使用委员会（EDC）的批准。
1. 样品制备
- 培养的细胞
- 选择感兴趣的细胞系（例如 HeLa 或骨肉瘤 [U2OS] 细胞），在添加了 10% 热灭活胎牛血清（FBS）和 100 单位/毫升青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养细胞。
- 进行定量蛋白质组学实验时，在缺乏精氨酸和赖氨酸的DMEM培养基中培养细胞。培养基需添加10%透析胎牛血清（FBS）、100单位/毫升青霉素-链霉素和丙氨酰-谷氨酰胺。通过分别添加普通赖氨酸和精氨酸（“轻”培养基）或赖氨酸-8（Lys-8）与精氨酸-10（Arg-10），配制两种类型的培养基。13C6;15N2）和精氨酸-10（13C6;15N4）（“重”培养基）。
- 在扩增和处理前，分别使用轻培养基（即未标记）和重培养基（即标记，SILAC）培养细胞，至少传代六次，以确保重培养基中的所有蛋白质均被含重稳定同位素的氨基酸完全标记。
- 用10 µM蛋白酶体抑制剂bortezomib处理细胞8小时，或加入等体积的DMSO作为模拟处理。用PBS洗涤细胞，使用1%胰蛋白酶/EDTA消化细胞并离心收集细胞沉淀。
- 从一个150 cm²培养皿中收集的细胞沉淀进行裂解2 每种实验条件下，将培养板中的样品加入2 mL预冷的50 mM Tris-HCl（pH = 8.2）缓冲液（含0.5%脱氧胆酸钠（DOC）），在95 °C下煮沸裂解液5分钟，随后进行超声处理10分钟（设定参数 "H" 对于文中所列的超声波破碎仪 材料表4 °C下。不建议使用去泛素化酶抑制剂（如N-乙基马来酰亚胺，NEM），因为这可能会引入非预期的蛋白质修饰，从而增加肽段鉴定的复杂性。
- 活体小鼠脑组织
- 使用体内组织时，将组织置于含有 100 mM Tris-HCl（pH = 8.5）、12 mM 氯化钠脱氧胆酸盐（sodium DOC）和 12 mM 月桂酰肌氨酸钠（sodium N-lauroylsarcosinate）的冰浴缓冲液中裂解17. 将裂解液超声处理10分钟（设定参数 "H" 对于所列的超声波破碎仪 材料表在 4 °C 下孵育，并将裂解液在 95 °C 下煮沸 5 分钟。
- 使用比色法BCA蛋白检测试剂盒定量总蛋白含量。为确保二甘氨酰肽免疫沉淀（IP）实验成功，总蛋白量应至少达到数毫克。对于SILAC实验，根据总蛋白量将轻标和重标蛋白按1:1比例混合。
- 使用5 mM 1,4-二硫苏糖醇在50 °C下还原所有蛋白质30分钟，随后在避光条件下用10 mM碘乙酰胺烷基化15分钟。以Lys-C（酶与底物比例为1:200）消化蛋白质4小时，随后在30 °C或室温（RT）下用胰蛋白酶（酶与底物比例为1:50）过夜消化。
- 向消化后的样品中加入三氟乙酸（TFA），使其终浓度为 0.5%，然后在 10,000 x g 条件下离心样品 g 孵育10分钟，以沉淀并去除所有去污剂。收集含有肽段的上清液，用于后续分级分离。
2. 肽段的离线分离
- 使用高pH反相（RP）C18色谱柱，固定相为聚合物材料（300 Å，50 µM；参见材料表），装填至空柱管中，用于分离胰蛋白酶消化后的肽段。固定相填料的用量需根据待分离蛋白质消化产物的量进行调整。准备一个6 mL空柱管（参见材料表），装入0.5 g固定相材料，适用于约10 mg蛋白质消化产物。蛋白质消化产物与固定相的质量比应约为1:50（w/w）。
- 将肽段上样至预装柱中，用约10倍柱体积的0.1%三氟乙酸（TFA）洗涤柱子，随后用约10倍柱体积的H2O冲洗。
- 用含7%、13.5%和50%乙腈（AcN）的10 mM甲酸铵溶液（pH = 10）分别以10倍柱体积洗脱，将肽段分为三个组分。将所有组分完全冻干。
- 使用与蛋白A琼脂糖微珠偶联的泛素残基基序（K-ε-GG）抗体，对二甘氨酸修饰肽段（diGly肽段）进行免疫富集。由于每批微珠所含抗体的确切量属于制造商的专有信息且未公开，建议采用与制造商相同的“一批”定义，以避免混淆。用PBS洗涤一批微珠两次，并将微珠悬液均分为六等份。详细实验方案见图1。
- 将步骤2.3中收集的三个肽段组分溶解于1.4 mL缓冲液中，缓冲液组成为50 mM MOPS、10 mM磷酸钠和50 mM NaCl（pH = 7.2），离心去除不溶物。
- 将各组分的上清液加入diGly抗体微珠中，在4 °C下旋转孵育2小时。离心收集微珠后，将上清液转移至另一批新鲜抗体微珠中，再次在4 °C下孵育2小时。
- 将上清液保存，用于后续全蛋白质组（GP）分析。
- 将各组分中的微珠转移至装有GF/F滤芯的200 µL移液枪头中以保留微珠。将装有微珠的枪头插入配有离心柱适配器的1.5 mL微量离心管中。每次用200 µL冰浴IAP缓冲液洗涤微珠3次，随后再用200 µL冰浴milliQ H2O洗涤3次。每次洗涤前以200 × g离心2分钟，注意避免柱子干涸。使用两轮各50 µL的0.15% TFA溶液洗脱肽段。
- 使用C18固相萃取小柱（本质上为装有两个C18圆盘的200 µL移液枪头）对肽段进行脱盐，并通过真空离心完全干燥。
3. 纳流液相色谱-质谱/质谱
- 在与纳米流液相色谱系统联用的高灵敏度质谱仪上进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）实验。
- 使用自制的50 cm反相色谱柱（内径75 µm），填充CSH130树脂（3.5 µm，130 Å），以2−28%乙腈（含0.1%甲酸）梯度在120分钟内以300 nL/min流速洗脱肽段。或者，可使用具有类似性能的市售液相色谱柱。使用柱温箱将色谱柱温度保持在50 °C（例如（见 材料表).
- 进行质谱分析。
- 质谱仪必须以数据依赖性采集（DDA）模式运行。MS1质谱应以高分辨率（例如120,000）采集，对于Orbitrap质谱仪，自动增益控制（AGC）目标值设为4E5，最大注入时间设为50 ms。
- 进行质谱分析 "强度优先级最高" 首先采用最高强度模式，利用总循环时间为3秒的高速方法，依次选择强度最高的离子进行碎裂，然后选择第二高的离子，依此类推。随后，进行第二轮DDA MS分析 "最低强度优先" 模式下，首先选择强度最低的离子，然后是第二低的离子，依此类推。该策略可确保对丰度极低的肽段实现最佳检测。
- 根据前体离子的电荷态（2-7电荷）和单一同位素峰指派对前体离子进行筛选。动态排除已检测过的前体离子，排除时间为60秒。使用四极杆质量过滤器（设定宽度为1.6 Th）对肽段前体离子进行分离。
- 在离子阱中以 7E3 的自动增益控制（AGC）值、最大注入时间 50 ms 和 30% 的 HCD 碰撞能量采集 MS2 谱图。
4. 数据分析
- 使用合适的搜索引擎（例如基于Andromeda搜索算法的免费MaxQuant软件套件）分析质谱原始数据文件18,19。在MaxQuant中，采用默认设置，并根据以下说明进行若干调整：将酶切特异性设为胰蛋白酶，最大漏切位点数设为3；将赖氨酸上的二甘氨酸残留物（+114.04 Da）、甲硫氨酸氧化和N端乙酰化设为可变修饰，将半胱氨酸的羧甲基化设为固定修饰。
- 使用包含从Uniprot数据库（例如https://www.uniprot.org/downloads）下载的蛋白质序列的FASTA文件，结合MaxQuant自动提供的反向数据库（decoy）和标准常见污染物数据库进行数据库搜索。设定错误发现率（FDR）为1%，修饰肽段（diGly）的最低得分设为40（默认值）。排除含有C端二甘氨酸化赖氨酸残基的肽段，不再进行后续分析。
- 对于SILAC实验文件的定量分析，将多重性（multiplicity）设为"2"，并重复步骤4.2。
- 使用MaxQuant软件套件中的Perseus模块20进行所有下游分析（例如统计分析、基因本体论分析）。
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结果
蛋白质经胰蛋白酶消化后，泛素化蛋白会在靶向赖氨酸残基上留下114.04 Da的二甘氨酸（diglycine）残留基团。质谱实验中可利用该基团引起的质量差异，明确识别泛素化位点。本文所述策略是一种前沿方法，用于通过纳米液相色谱-串联质谱（nanoflow LC-MS/MS）对二甘氨酸肽（diGly peptides）进行富集及后续鉴定（图1A）。本研究中使用了培养细胞和体内样本作为蛋白质的生物来源，但本方案适用于任何蛋白质来源。按照本方案操作，从2-20 mg输入蛋白中可直接鉴定出10,000-25,000个二甘氨酸肽。为提高细胞中蛋白质泛素化程度，可在收获细胞前数小时加入蛋白酶体抑制剂（如bortezomib或MG132）。若未使用蛋白酶体抑制剂，所鉴定出的二甘氨酸肽数量通常显著降低（减少30-40%）。
我们对现有方案进行了多项改进。首先，基于反相色谱并结合...
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讨论
本文所述方案已应用于多种生物来源的样品，如培养细胞和体内组织。在所有情况下，只要总蛋白投入量至少为1 mg，我们均能鉴定出数千种diGly肽段。使用特异性抗体进行富集的效率非常高，因为若不对泛素化蛋白或diGly肽段进行任何富集处理，从全细胞裂解液中仅能鉴定出最多100–150种丰度极低的diGly肽段。显然，高灵敏度的质谱分析是获得大量diGly鉴定结果的前提条件。尽管我们已成功使用多种不同的质谱仪，但发现Orbitrap Tribrid Lumos的灵敏度最高，可获得最多的鉴定产量。
在进行免疫沉淀（IP）之前，应先测试高pH洗脱的离线反相色谱。为了获得最佳实验效果，各组分在肽段鉴定方面的重叠应尽可能低。完成免疫沉淀后，其中一个组分应包含泛素自身K48修饰的胰蛋白酶双甘氨酸（diGly）肽段LIFAGK(GG)QLEDGR（m/z 730.39）。这是免疫沉淀组分中丰度最高的肽段，在120分钟梯度洗脱条件下，其液相色谱图中50–55分钟区间呈现出强烈而宽泛的峰（图1B）。如果色谱图中缺...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作属于项目"Proteins at Work"的一部分，该项目由荷兰蛋白质组学中心（Netherlands Proteomics Centre）承担，由荷兰科学研究组织（NWO）资助，属于国家大型研究设施路线图项目（项目编号 184.032.201）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1,4-二硫苏糖醇 | Sigma-Aldrich | D8255 | |
| 3M Empore C18 十八烷基圆盘 | Supelco | 66883-U | Supelco 已停产该产品；CDS Analytical 为新制造商（https://www.cdsanalytical.com/empore） |
| 甲酸铵 | Sigma-Aldrich | 70221 | |
| 硼替佐米 | UBPbio | ||
| CSH130 树脂，3.5 μm，130 Å | Waters | ||
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | 34869 | |
| DMEM | ThermoFisher | ||
| EASY-nanoLC 1200 | ThermoFisher | ||
| FBS | Gibco | ||
| GF/F 滤膜插头 | Whatman | 1825-021 | |
| 碘乙酰胺 | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| 赖氨酸，精氨酸 | Sigma-Aldrich | ||
| 赖氨酸-8（13C6；15N2），精氨酸-10（13C6；15N4） | Cambridge Isotope Laboratories | ||
| 赖氨酰内肽酶（LysC） | Wako Pure Chemicals | 129-02541 | |
| 纳升液相色谱柱温箱 | MPI design, MS Wil GmbH | ||
| 月桂酰肌氨酸钠盐 | Sigma-Aldrich | L-5125 | |
| Orbitrap Fusion Lumos 质谱仪 | ThermoFisher | ||
| Pierce BCA 蛋白定量试剂盒 | ThermoFisher / Pierce | 23225 | |
| PLRP-S（300 Å，50 µm）聚合物反相填料 | Agilent Technologies | PL1412-2K01 | |
| PTMScan 泛素化残基基序（K-ε-GG）试剂盒 | Cell Signaling Technologies | 5562 | |
| Sep-Pak tC18 6 cc 真空小柱 | Waters | WAT036790 | 在用 PLRP-S 填料填充小柱前，需先将 tC18 材料从小柱中移除 |
| 脱氧胆酸钠 | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| Tris碱 | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| 胰蛋白酶，TPCK 处理 | ThermoFisher | 20233 |
参考文献
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