我们介绍一种从复杂的生物样品中纯化、检测和鉴定来源于泛素化蛋白质的diGly肽的方法。该方法具有良好的重复性和稳健性，在泛素化修饰组分析的深度方面优于已发表的方法。
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本文内容
摘要
摘要
蛋白质通过小分子蛋白泛素进行翻译后修饰，参与多种细胞活动。在泛素化蛋白质经胰蛋白酶消化后，可产生带有二甘氨酸残基共价连接至赖氨酸ε-氨基的肽段（“K-ε-二甘氨酸”或简称为“diGly”），可用于追溯原始修饰位点。通过高效的diGly肽段免疫富集结合质谱高灵敏度检测，迄今已鉴定的泛素化位点数量大幅增加。我们对该实验流程进行了多项优化，包括在富集步骤前对肽段进行离线高pH反相分级分离，以及在离子导向多极装置中采用更先进的肽段碎裂参数设置。此外，使用基于滤膜的微柱对样本进行更高效的纯化，有助于保留抗体磁珠，从而提高对diGly肽段的富集特异性。这些改进使得在蛋白酶体抑制条件下，从人宫颈癌细胞（HeLa）裂解液中常规检测到超过23,000个diGly肽段。我们展示了该策略在多种不同类型细胞以及脑组织等体内样本泛素化修饰谱深度分析中的有效性。本研究为蛋白质泛素化分析工具箱提供了新的方法，有助于深入揭示细胞内复杂的泛素化修饰图谱。
引言
泛素与蛋白质的共价连接可标记其被蛋白酶体降解，是蛋白质稳态中的关键过程。泛素的C端羧基与靶蛋白赖氨酸的ε-氨基形成异肽键1,2。此外，泛素还可连接至其他泛素模块，从而形成同型（如K48或K11连接）或分支型（即异型或混合型）的多聚泛素结构1,3。泛素最广为人知的功能是通过K48连接的多聚泛素介导蛋白酶体降解。然而，现已明确单泛素化和多泛素化也参与多种不依赖蛋白酶体降解的生物学过程。例如，K63连接的泛素链在细胞内运输、溶酶体降解、激酶信号传导以及DNA损伤应答中发挥非降解性功能4,5。其余六种连接类型相对稀少，其功能在很大程度上仍不明确，但随着新型特异性检测工具的开发，关于它们在细胞中作用的初步线索正逐渐浮现6,7。
质谱技术已成为蛋白质组分析不可或缺的工具，如今在单次实验中即可鉴定出几乎任何生物来源的数千种不同蛋白质。蛋白质的翻译后修饰（PTMs）（例如磷酸化、甲基化、乙酰化和泛素化）为研究增加了额外的复杂性，....
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方案
本文所述所有方法均已获得伊拉斯姆斯医学中心机构动物护理和使用委员会（EDC）的批准。
1. 样品制备
- 培养的细胞
- 选择感兴趣的细胞系（例如 HeLa 或骨肉瘤 [U2OS] 细胞），在添加了 10% 热灭活胎牛血清（FBS）和 100 单位/毫升青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养细胞。
- 进行定量蛋白质组学实验时，在缺乏精氨酸和赖氨酸的DMEM培养基中培养细胞。培养基需添加10%透析胎牛血清（FBS）、100单位/毫升青霉素-链霉素和丙氨酰-谷氨酰胺。通过分别添加普通赖氨酸和精氨酸（“轻”培养基）或赖氨酸-8（Lys-8）与精氨酸-10（Arg-10），配制两种类型的培养基。13C6;15N2）和精氨酸-10（13C6;15N4）（“重”培养基）。
- 在扩增和处理前，分别使用轻培养基（即未标记）和重培养基（即标记，SILAC）培养细胞，至少传代六次，以确保重培养基中的所有蛋白质均被含重稳定同位素的氨基酸完全标记。
- 用10 µM蛋白酶体抑制剂bortezomib处理细胞8小时，或加入等体积的DMSO作为模拟处理。用PBS洗涤细胞，使用1%胰蛋白酶/EDTA消化细胞并离心收集....
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结果
蛋白质经胰蛋白酶消化后，泛素化蛋白会在靶向赖氨酸残基上留下114.04 Da的二甘氨酸（diglycine）残留基团。质谱实验中可利用该基团引起的质量差异，明确识别泛素化位点。本文所述策略是一种前沿方法，用于通过纳米液相色谱-串联质谱（nanoflow LC-MS/MS）对二甘氨酸肽（diGly peptides）进行富集及后续鉴定（图1A）。本研究中使用了培养细胞和体内样本作为蛋白质的生物来源，但本方案适用于任何蛋白质来源。按照本方案操作，从2-20 mg输入蛋白中可直接鉴定出10,000-25,000个二甘氨酸肽。为提高细胞中蛋白质泛素化程度，可在收获细胞前数小时加入蛋白酶体抑制剂（如bortezomib或MG132）。若未使用蛋白酶体抑制剂，所鉴定出的二甘氨酸肽数量通常显著降低（减少30-40%）。
我们对现有方案进行了多项改进。首先，基于反相色谱并结合.......
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讨论
本文所述方案已应用于多种生物来源的样品，如培养细胞和体内组织。在所有情况下，只要总蛋白投入量至少为1 mg，我们均能鉴定出数千种diGly肽段。使用特异性抗体进行富集的效率非常高，因为若不对泛素化蛋白或diGly肽段进行任何富集处理，从全细胞裂解液中仅能鉴定出最多100–150种丰度极低的diGly肽段。显然，高灵敏度的质谱分析是获得大量diGly鉴定结果的前提条件。尽管我们已成功使用多种不同的质谱仪，但发现Orbitrap Tribrid Lumos的灵敏度最高，可获得最多的鉴定产量。
在进行免疫沉淀（IP）之前，应先测试高pH洗脱的离线反相色谱。为了获得最佳实验效果，各组分在肽段鉴定方面的重叠应尽可能低。完成免疫沉淀后，其中一个组分应包含泛素自身K48修饰的胰蛋白酶双甘氨酸（diGly）肽段LIFAGK(GG)QLEDGR（m/z 730.39）。这是免疫沉淀组分中丰度最高的肽段，在120分钟梯度洗脱条件下，其液相色谱图中50–55分钟区间呈现出强烈而宽泛的峰（图1B）。如果色谱图中缺.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作属于项目"Proteins at Work"的一部分，该项目由荷兰蛋白质组学中心（Netherlands Proteomics Centre）承担，由荷兰科学研究组织（NWO）资助，属于国家大型研究设施路线图项目（项目编号 184.032.201）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1,4-二硫苏糖醇 | Sigma-Aldrich | D8255 | |
| 3M Empore C18 十八烷基圆盘 | Supelco | 66883-U | Supelco 已停产该产品；CDS Analytical 为新制造商（https://www.cdsanalytical.com/empore） |
| 甲酸铵 | Sigma-Aldrich | 70221 | |
| 硼替佐米 | UBPbio | ||
| CSH130 树脂，3.5 μm，130 Å | Waters | ||
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | 34869 | |
| DMEM | ThermoFisher | ||
| EASY-nanoLC 1200 | ThermoFisher | ||
| FBS | Gibco | ||
| GF/F 滤膜插头 | Whatman | 1825-021 | |
| 碘乙酰胺 | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| 赖氨酸，精氨酸 | Sigma-Aldrich | ||
| 赖氨酸-8（13C6；15N2），精氨酸-10（13C6；15N4） | Cambridge Isotope Laboratories | ||
| 赖氨酰内肽酶（LysC） | Wako Pure Chemicals | 129-02541 | |
| 纳升液相色谱柱温箱 | MPI design, MS Wil GmbH | ||
| 月桂酰肌氨酸钠盐 | Sigma-Aldrich | L-5125 | |
| Orbitrap Fusion Lumos 质谱仪 | ThermoFisher | ||
| Pierce BCA 蛋白定量试剂盒 | ThermoFisher / Pierce | 23225 | |
| PLRP-S（300 Å，50 µm）聚合物反相填料 | Agilent Technologies | PL1412-2K01 | |
| PTMScan 泛素化残基基序（K-ε-GG）试剂盒 | Cell Signaling Technologies | 5562 | |
| Sep-Pak tC18 6 cc 真空小柱 | Waters | WAT036790 | 在用 PLRP-S 填料填充小柱前，需先将 tC18 材料从小柱中移除 |
| 脱氧胆酸钠 | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| Tris碱 | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| 胰蛋白酶，TPCK 处理 | ThermoFisher | 20233 |
参考文献
- Clague, M. J., Urbé, S. Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways. Cell. 143, 682-685 (2010).
- Ciechanover, A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway. Cell. 79 (1), 13-21 (1995).
- Ohtake, F., Tsuchiya, H.
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重印与许可
