通过肽浓缩和质谱检测蛋白质泛化位点检测

泛蛋白与蛋白质的结合标志着蛋白酶体降解，是蛋白酶病的关键过程。泛素的C端卡博基组与目标蛋白^11、22的裂氨酸-氨基组形成等肽键。此外，泛素可以附着在其他泛素模块上，导致形成均匀（即K48或K11）或分支（即异质或混合）聚氨基金结构^11、3。3泛蛋白的最广为人知的功能是它在蛋白酶体降解中的作用，由K48链接的多聚丙酮介导。然而，很明显，单一和多聚二化在许多独立于蛋白酶体降解的过程中也扮演着角色。例如，K63相关链在细胞内贩运、肌营养不良退化、激酶信号和DNA损伤反应^44、55等具有非降解作用。其他六种链接类型较少，它们的作用仍然在很大程度上是神秘的，尽管关于它们在细胞中功能的最初迹象正在出现，这主要是因为开发了新工具，使链接特定的检测^66，7。7

质谱法已成为蛋白质组分析不可或缺的工具，如今，几乎任何生物来源的数千种不同的蛋白质都可以在单个实验中被识别。蛋白质（例如磷酸化、甲基化、乙酰化和泛化）的翻译后修饰（如磷酸化、甲基化、乙酰化和泛化）又提出了一层复杂性，这些蛋白质可以调节蛋白质活性。大规模识别PTM轴承蛋白也通过质谱学领域的发展成为可能。与未修改的肽相比，携带PTM的肽的渗透量相对较低，这带来了技术挑战，在质谱分析之前，一般需要生化浓缩步骤。在过去二十年中，为分析PTM开发了几种不同的具体浓缩方法。

由于蛋白质泛化在细胞中的多方面作用，因此对开发分析方法以检测蛋白质⁸的泛化位点有很大的需求。质谱方法的应用，导致果蝇、小鼠、^,人类和酵母蛋白^{9、10、11、12、13、1410,11}中已识别的⁹泛化位点数量激增。^12,13,14在肽水平上开发基于免疫沉淀的浓缩策略，利用针对K-+-GG残余图案的抗体（也称为"diglycine"或"diGly"）提出了一个重大步骤。这些二甘肽是在消化泛化蛋白时产生的，使用胰蛋白酶作为蛋白酶^{15，16。15,}

在这里，我们提出了一个优化的工作流程，以丰富使用免疫纯化和Orbitrap质谱检测的二Gly肽。结合现有工作流程的多项修改，特别是在样品制备和质谱阶段，我们现在可以从用蛋白酶体处理的HeLa细胞单个样本中常规识别超过 23，000 个二Gly 肽未经治疗的HeLa细胞的抑制剂和±10，000。我们应用了该协议，从未标记和稳定的同位素标签与氨基酸在细胞培养（SILAC）标记HeLa细胞，以及内源性样本，如脑组织。

此工作流为分析无所不在位点以揭示深层泛化值的工具系列提供了宝贵的补充。以下协议详细介绍了工作流的所有步骤。

此处描述的所有方法均已获得伊拉斯谟 MC 机构动物护理和使用委员会 （EDC） 的批准。

1. 样品制备

1. 培养细胞
   1. 选择感兴趣的细胞系（例如，HeLa或骨肉瘤[U2OS]细胞），并在Dulbecco的最小鹰中（DMEM）中生长细胞，并辅以10%热灭活胎儿牛血清（FBS）和100单位/mL青霉素/链霉素。
   2. 对于定量蛋白质组学实验，DMEM中的培养细胞缺乏精氨酸和莱氨酸。该介质必须补充10%分解胎儿牛血清（FBS）、100单位/mL青霉素/链霉素和丙氨酸谷氨酰胺。通过添加传统的莱氨酸和精氨酸（"光"介质）或莱氨酸^-8（13C_6;¹⁵N₂） 和精氨酸-10 （¹³C₆;¹⁵N₄） （"重"中等），分别。
   3. 在膨胀和处理之前，在轻介质（即未标记）和重介质（即标记，SILAC）中培养细胞分批至少增加六倍，以确保重介质培养中的所有蛋白质都标有含有重稳定同位素的标记氨基酸。
   4. 用10μM的蛋白酶体抑制剂bortezomib或同等体积的DMSO将细胞治疗8小时，作为模拟治疗。用PBS清洗细胞，用1%的胰蛋白酶/EDTA分离细胞，并颗粒细胞。
   5. 根据在2 mL冰冷50 mM Tris-HCl（pH = 8.2）中测试的150 cm²培养板中的细胞颗粒，以及0.5%脱氧酸钠（DOC）。在95°C下将水化水化，5分钟，在4°C下为材料表中列出的声波器设置"H"10分钟。我们不建议使用二乙酰胺酶抑制剂，如N-乙酰胺（NEM），因为这可能会引入不需要的蛋白质修饰，使肽的识别复杂化。
2. 体内小鼠脑组织
   1. 在体内组织中使用时，在含有100 mM Tris-HCl的冰冷缓冲液中lys组织（pH = 8.5）、12 mM DOC钠和12 mM钠N-劳罗伊尔沙氨酸^17。在4°C下将水化酶声波10分钟（为材料表中列出的声波器设置"H"），并在95°C下将水化物煮5分钟。
3. 使用色度吸收 BCA 蛋白质测定试剂盒对总蛋白质量进行定量。蛋白质的总量应至少为几毫克，以成功进行二甘肽免疫沉淀（IP）。对于SILAC实验，根据总蛋白质量，将轻和重标记的蛋白质以1:1的比例混合。
4. 在50°C下，使用5 mM 1，4-二硫硫醇醇减少所有蛋白质30分钟，然后在黑暗中用10mM碘酰胺烷状物15分钟。使用 Lys-C（1:200 酶基底比）进行蛋白质消化 4 小时，然后在 30°C 或室温 （RT） 下用胰蛋白素（1:50 酶基底比）进行隔夜消化。
5. 将三氟乙酸 （TFA） 添加到消化的样品中，最终浓度为 0.5%，并将样品在 10，000 x g下离心 10 分钟，以便沉淀并去除所有洗涤剂。收集含有肽的上清剂，以便随后进行分馏。

2. 离线肽分馏

1. 使用高pH反向相 （RP） C18 色谱与聚合物固定相材料 （300°， 50 μM; 参见材料表） 加载到空柱盒中，以分馏锥形肽。固定相床大小必须调整到要分馏的蛋白质消化量。准备一个空的6 mL柱盒（见材料表），填充0.5克固定相材料，用于10毫克蛋白质消化。蛋白质消化到固定相比应约为1:50（w/w）。
2. 将肽加载到准备好的柱上，用大约 10 列卷 0.1% TFA 清洗列，然后将大约 10 列卷 H₂O 清洗。
3. 将肽分成三个分数，10列体积为10mM铵酯溶液（pH = 10），分别具有7%、13.5%和50%的醋酸（AcN）。将所有分数都归为完整。
4. 使用泛素残留图案（K-+-GG）抗体与蛋白质A琼玫瑰珠结合，以免疫富集二甘肽。由于每批珠子的抗体的确切量是专有信息，制造商不会披露，因此建议对一批珠子使用与制造商相同的定义，以避免混淆。用PBS洗涤一批这些珠子2倍，并将珠浆分成六个相等的分数。有关详细的实验方案，请参阅图 1。
5. 溶解在步骤 2.3 中收集的三个肽分数，该缓冲液由 50 mM MOPS、10 mM 磷酸钠和 50 mM NaCl（pH = 7.2）组成，在 1.4 mL 中收集，然后旋转碎屑。
6. 将分数的超钠添加到二Gly抗体珠子中，并在旋转器单元上以4°C孵育2小时。向下旋转珠子，将上清液转移到一批新鲜抗体珠，并在4°C下再次孵育2小时。
7. 存储超子体，以便进行后续全局蛋白体 （GP） 分析。
8. 将珠子从每一个馏分转移到200μL移液器尖端，并配有GF/F过滤器插头以保留珠子。将带珠子的移液器尖端放入配备离心尖端适配器的 1.5 mL 微离心管中。用 200 μL 的冷 IAP 缓冲液清洗珠 3x，然后用 200 μL 的冷毫Q H₂O 进行 3g倍的冲下柱，每次洗涤步骤前旋转 2 分钟，但请注意不要让柱运行干燥。使用 2 个周期 50 μL 0.15% TFA 来刺激肽。
9. 使用 C18 级尖端（本质上是带有两个 C18 盘的 200 μL 移液器尖端）对肽进行脱盐，并用真空离心将其干燥成完全。

3. 纳米流 LC-MS/MS

1. 在与纳米流LC系统耦合的敏感质谱仪上执行LC-MS/MS实验。
2. 使用内部包装的50厘米反向相柱，内径为75μm，包装有CSH130树脂（3.5μm，130°），在300 nL/min下，将梯度为2~28%（AcN，0.1%FA）的肽在120分钟以上。例如，使用柱烤箱将列保持在 50°C 处（参见材料表）。
3. 执行质谱分析。
   1. 质谱仪必须在数据依赖采集 （DDA） 模式下运行。MS1 质谱应以高分辨率（例如 120，000）收集，自动增益控制 （AGC） 目标设置为 4E5，在 Orbitrap 质谱仪的情况下，最大喷射时间为 50 毫秒。
   2. 首先在"最高强度第一"模式下执行质谱分析。这样，最强烈的ion首先选择碎片，然后第二高，等等，使用总循环时间为3秒的最高时速方法。随后，在"最低强度优先"模式下执行第二轮 DDA MS 分析，以便首先选择强度最小的 ion，然后选择第二个最低度，依此类推。此策略可确保对极低的捆绑肽进行最佳检测。
   3. 根据前体离子的电荷状态（2-7 电荷）和单同位素峰值分配进行过滤。将先前询问的前体动态排除为60 s. 分离肽前体与四极波质量过滤器设置为宽度为1.6Th。
   4. 在 7E3 AGC 的电子陷阱中收集 MS2 光谱，最大喷射时间为 50 ms，HCD 碰撞能量为 30%。

4. 数据分析

1. 使用适当的搜索引擎分析质谱原始文件，例如基于仙女座搜索引擎^18，19,19的免费可用的MaxQuant软件套件。在 MaxQuant 中，选择具有下面指示的一些自适应的默认设置。将酶特异性设置为胰蛋白酶，将缺失的裂解的最大数量提高到三个。将二甘菊残留物（+114.04 Da）的莱氨酸、蛋氨酸氧化和N端乙酰化作为可变修饰，并将半胱氨酸的卡酰胺甲基化作为固定修饰。
2. 对从 Uniprot 存储库（https://www.uniprot.org/downloads）下载的蛋白质序列的 FASTA 文件执行数据库搜索，并结合 MaxQuant 自动提供的诱饵和标准常见污染物数据库。将错误发现率 （FDR） 设置为 1%，并将已修改（二格里）肽的最小分数设置为 40（默认值）。从进一步分析中排除与C端二Gly改性裂二蛋白残留物一起识别的肽。
3. 对于SILAC实验文件的定量分析，将多重性设置为"2"，重复步骤4.2。
4. 使用 MaxQuant 软件套件的 Perseus 模块²⁰执行所有下游分析（例如统计、基因本体分析）。

当蛋白质用胰蛋白酶消化时，泛化蛋白在目标莱氨酸残留物上留下114.04 Da diglycine残留物。这个图案引起的质量差异用于在质谱实验中明确识别泛化位点。我们在这里描述的策略是一种最先进的方法，用于通过纳米流LC-MS/MS浓缩和随后识别二甘肽（图1A）。在这项研究中，培养细胞和体内物质都被用作蛋白质的生物来源，但该协议与任何蛋白质来源是相容的。按照协议中的步骤，从2-20毫克蛋白质输入中识别10，000-25，000个二Gly肽应该很简单。为了增加细胞中蛋白质泛化的程度，可以在收获细胞前几个小时添加蛋白酶体抑制剂，如波特佐米布或MG132。如果没有使用蛋白酶体抑制剂，则已识别的二甘肽数量往往明显较低（30-40%）。

我们对现有协议进行了一些改进。首先，根据反向相色谱和随后在高pH下进行粗分馏成三个分数，以降低肽混合物的复杂性。这些分数显示肽识别的重叠度非常低，每个分数应识别可比数量的二甘肽（图2）。这导致在这些分数中识别出大量独特的二甘肽。重要的是，其中一个分数（通常是第二个）应包含泛文蛋白自己的K48改性二甘肽LIFAGK（GG）QLEDGR（m/z 730.39）。这是迄今为止免疫沉淀分数中最丰富的肽，其特点是LC色谱图中的强峰和广泛峰（图1B）。这是一个基准色谱峰值，如果它不在色谱图中，IP很可能不成功。

另一个改进是DDA分析过程的适应，是质谱仪中的电子路由多极。在传统的N前数据依赖采集 （DDA） 中，从 MS1 频谱中选择N峰值进行碎片化。这种碎片方案首先从最高强度峰值开始，然后是第二高强度的峰值，等等。在替代碎片方案中，首先选择最强烈的峰值，然后是第二个最不强烈的峰值等。这种选择顺序背后的理由是，有足够的时间来分解非常低的丰富的肽。事实上，我们发现，与具有标准 DDA 设置（即最高第一）的重复 LC-MS 分析（即最高第一）相比，将"最高第一"和"最低第一"DDA 运行与重复的 LC-MS 分析相结合，肽识别数量会增加。因此，为了进行更全面的泛泛分析，建议将 LC-MS 运行与数据分析程序中的"最高优先"和"最低优先"碎片系统相结合。这种"最低优先"策略可以产生超过4，000种独特的二甘肽，而当只使用传统的DDA系统时，这些肽是未检测到的（图2）。

最后，第一个 IP 之后流经的其他 IP 可以生成另一个 ±2，500 个唯一的二Gly 肽（图 2）。

文献中关于泛化分析的文章通常报告大约10，000个二甘肽12，21。12,在这里，在通过三个生物复制屏幕识别的所有二Gly肽中，所有三个屏幕都存在>9，000，而 >17，000 存在于至少三分之二的复制中（图 3）。通常，按照此处所述的协议，您应该使用一批标准 CST 抗体珠子从一个 15-20 mg 的蛋白质样本中识别 >21，000 种独特的二甘肽。在纯度和选择性方面，已识别的二甘肽和未改性肽之间的比率应始终为 >0.5。二Gly肽的识别数量高度依赖于蛋白质输入材料的量。一项仅1mg输入材料的IP产生约2，500个二Gly肽识别，同时生产10毫克蛋白质输入材料>15，000二Gly肽识别。表 1列出了每种情况的已识别二Gly 肽的预期数量。应该指出，这些数字只是估计，取决于所使用的质谱仪的类型。图 4显示了低、中、高输入量的二Gly肽标识之间的重叠。

为了说明上述泛化位分析的改进的附加价值，我们还对SILAC标记的HeLa细胞进行了定量泛化分析，该细胞在重复标签交换测定中与未经处理的控制细胞相比，用蛋白酶体抑制剂bortezomib处理。超过一半 （>55%）在IP后，在平气管中所有已识别的肽都是二甘肽。已鉴定出19，000多个独特的二甘肽，仅略低于非SILAC标记的样品。原因可能是，由于肽峰对的存在，SILAC测定中MS1光谱的复杂性更高。在SILAC分析中，观察到在正向条件下专门识别的二甘肽数量（即重通道中的bortezomib治疗细胞、光通道中的对照细胞）与完全在相反条件下识别的细胞（即光通道中的bortezomib治疗细胞、重通道中的对照细胞）之间的差异较大，在本例中为1，752比6，356（补充表1）。在"多重 = 2"（即双通道 SILAC）模式下操作 MaxQuant 软件时，在重通道（几乎全部在反向实验中）中识别 7，555 个二Gly 肽，并在光通道中识别非零强度值。相反，在重通道中，没有一个二Gly肽被识别为非零强度值，并在光通道中伴有零强度值。当 MaxQuant 分析相同的数据集在"多重 = 1"模式下执行，其中二Gly moity 和标记的氨基酸组合成单个可变修饰，即使无法检测到该肽的轻对应物，也发现了许多重二肽变异。最可能的解释是，软件无法应对在重通道中专门存在的二Gly肽的识别。这种现象很可能广泛发生，因为抑制蛋白酶体将触发新的泛化位点的形成。在 MaxQuant 中勾选"重新量化"选项复选框，该复选框是为处理这些问题而开发的，应该对此进行更正，这似乎不足以完全避免此问题。显然，绝大多数二甘肽在蛋白酶体抑制后被向上调节或形成，因为超过三分之二的肽池的H:L比至少为1.5（图5B）。

最后，将这种泛化位分析方法应用于体内组织样本。为了评估效果，我们从新鲜的小鼠大脑中提取了大约32毫克的蛋白质（湿组织重量的10%是蛋白质）。大脑物质没有用蛋白酶体抑制剂或任何其他试剂治疗，可以促进整体蛋白质的泛化。从该样本中，确定了10，871种独特的二甘肽（补充表2）。在这种组织中鉴定的所有二甘肽都源自在稳定状态情况下的内源性泛化位点。没有实施促进全球泛化（例如，蛋白酶体抑制）的治疗。因此，我们假设这些泛化位点至少部分地产生于（多性）泛化，涉及非蛋白酶体介导细胞信号事件，这与文献55、16、2216,22中提出的想法一致。

最后，本文描述的方法允许以可重复的方式深入探索无所不在的。有关通过此过程获得的典型结果的概述，请参阅范德沃尔等人23。

图 1:实验概述。（A） 实验方法概述。使用具有高pH洗脱的反向相色谱法制备、试光和分馏成三个分数。一批商用β-二Gly肽抗体珠被分解成六个相等的馏分，然后三个肽分数被加载到三个珠子分数上。二甘肽被免疫化、洗脱和收集，然后通过流转移到剩下的三个新鲜的珠子分数。收集的二Gly肽通过Lumos Orbitrap质谱仪的质谱分析，该方案结合了一个周期，其中首先选择最强烈的峰用于肽碎片，下一个周期首先选择最不强烈的峰。然后使用 MaxQuant 对完整的 nLC-MS/MS 运行集进行了分析。（B） 其中一个分数应包含泛化蛋白自己的 K48 改性二甘肽 LIFAGK （GG） QLEDGR （m/z 730.39）。这是迄今为止免疫沉淀分数中最丰富的肽，其特点是LC色谱图在120分钟梯度50-55分钟之间出现强烈和广泛的峰值。如果色谱图中缺少此基准峰值，则 IP 很可能不成功。这个数字是从范德沃尔等人23号修改的。请点击此处查看此图形的较大版本。

图 2:在三个改进步骤中检测到的二Gly肽数量。（A） 免疫沉淀前原油分馏的影响。显示了三个独立分数中确定的二甘肽种群之间的重叠。（B） 第一和第二个孵育步骤的影响。（C） 调整后肽碎片系统的结果。这个数字是从范德沃尔等人23号修改的。请点击此处查看此图形的较大版本。

图3:在三种生物复制的Bortezomib处理细胞中检测到的二格利肽，显示运行之间的重叠量。这个数字是从范德沃尔等人23号修改的。请点击此处查看此图形的较大版本。

图4:从分析中确定的二甘肽与低（4毫克）、中（10毫克）和高（40毫克）总蛋白质输入量重叠。请点击此处查看此图形的较大版本。

图5:在SILAC标记细胞中检测二甘肽。（A） 在 SILAC 的正向和反向条件下检测到的肽数标记为 HeLa 细胞，用于多重设置 1 和 2。（B） 在Bortezomib （Btz） 治疗海拉细胞的二甘肽SILAC比的散射图。只显示在正向和反向实验中识别和定量的肽。这个数字是从范德沃尔等人23号修改的。请点击此处查看此图形的较大版本。

表1:不同条件下的二Gly肽识别的预期数量。这些数字只是估计，取决于所使用的实验设置。

补充表1.请点击此处查看此表（右键单击以下载）。

补充表2。请点击此处查看此表（右键单击以下载）。

提交人声明没有利益冲突。