使用CRISPR-Cas在哺乳动物细胞系中进行基因组编辑

摘要

CRISPR-Cas 是一种用于编辑动植物复杂基因组的强大技术。本文详细介绍了一种利用不同 Cas 核酸酶高效编辑人类基因组的实验方案。我们强调了优化编辑效率所需考虑的关键因素和设计参数。

摘要

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）系统在细菌的适应性免疫中具有天然功能，但已被成功改造用于多种不同生物体的基因组编辑。最常见的是利用野生型CRISPR相关蛋白9（Cas9）或Cas12a核酸内切酶切割基因组中的特定位点，随后根据是否存在供体模板，通过非同源末端连接（NHEJ）途径或同源定向修复（HDR）途径修复DNA双链断裂。迄今为止，已发现来自不同细菌物种的CRISPR系统均能在哺乳动物细胞中实现基因组编辑。然而，尽管该技术看似简单，仍需考虑多个设计参数，这常常使使用者对如何最优地开展基因组编辑实验感到困惑。本文介绍了一个从实验设计到鉴定携带目标DNA修饰的细胞克隆的完整工作流程，旨在促进在哺乳动物细胞系中成功实施基因组编辑实验。我们强调了用户需注意的关键因素，包括CRISPR系统的选择、间隔序列长度以及单链寡脱氧核苷酸（ssODN）供体模板的设计。我们预期该工作流程将有助于基因敲除研究、疾病建模或报告细胞系的构建。

引言

对任何生物体基因组进行编辑的能力在生物医学和生物技术领域具有广泛的应用，例如校正致病性突变、构建用于疾病研究的精确细胞模型，或培育具有优良性状的农作物。自21世纪初以来，已开发出多种用于哺乳动物细胞基因组编辑的技术，包括巨核酸酶^1,2,3、锌指核酸酶^4,5以及转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）^6,7,8,9。然而，这些早期技术要么难以编程，要么构建过程繁琐，从而限制了其在科研和工业领域的广泛应用。

近年来，成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）-CRISPR 相关蛋白（Cas）系统已成为一种强大的新型基因组编辑技术^10,11。该系统最初是细菌的一种适应性免疫系统，现已成功应用于包括人类在内的动植....

方案

1. sgRNA 的设计

1. 选择合适的CRISPR-Cas系统。
   1. 首先，检查所有已在哺乳动物细胞中证实具有功能的Cas9和Cas12a核酸酶的PAM序列^16,21-32。五种常用酶及其对应的PAM序列见表1。
      注意：除表1中列出的核酸酶外，还有其他较少使用的Cas酶也已在哺乳动物细胞中成功应用，例如来自Streptococcus thermophilus的Cas9核酸酶（St1Cas9），其识别的PAM序列为NNAGAAW。如果目标位点不包含已知的PAM序列，则无法使用CRISPR-Cas系统进行基因组编辑。
   2. 其次，考虑目标基因组位点或基因的任何已知特性。需考虑的特性包括基因表达水平、染色质可及性，以及是否存在其他高度相似的序列。
      注意：某些酶更适用于特定的生物学背景。例如，在编辑重复基因组位点或具有多个近缘同源基因的基因时，建议使用AsCas12a（因其对sgRNA与靶DNA之间的错配容忍度低于SpCas9和LbCas12a）或SaCas9（因其需要更长的间隔序列，从而提供更高的靶向特异性）²⁵。

结果

为了进行基因组编辑实验，需要克隆一种表达靶向目标位点的sgRNA的CRISPR质粒。首先，使用限制性内切酶（通常为IIs型酶）对质粒进行消化以使其线性化。建议将消化产物与未消化的质粒一同在1%琼脂糖凝胶上进行电泳，以区分完全消化与部分消化。由于未消化的质粒呈超螺旋结构，其迁移速度通常快于线性化的产物（见图7a）。其次，需将两条sgRNA的寡核苷酸退火后连接至切割后的质粒中。为了确认寡核苷酸是否成功克隆到CRISPR质粒骨架中，需进行菌落PCR（见图7b）。筛选出阳性克隆后，接种培养，提取质粒并送测Sanger序列。

图7

讨论

CRISPR-Cas 系统是一种强大且革命性的技术，可用于动植物基因组和转录组的编辑。已发现多种细菌含有 CRISPR-Cas 系统，这些系统可能被改造用于基因组和转录组工程⁴⁴。尽管来自Streptococcus pyogenes（SpCas9）的 Cas9 核酸酶是首个在人类细胞中成功应用的酶^21,22,23,24，但其他细菌来源的酶，包括表1中列出的那些，也已被证明在人类细胞中作为编辑工具具有良好的功能^16,26,27,28。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
T4 多核苷酸激酶（PNK）	NEB	M0201
虾碱性磷酸酶（rSAP）	NEB	M0371
Tris-乙酸-EDTA（TAE）缓冲液，50X	1st Base	BUF-3000-50X4L	使用前稀释至1X。1X溶液含有40 mM Tris、20 mM乙酸和1 mM EDTA。
Tris-EDTA（TE）缓冲液，10X	1st Base	BUF-3020-10X4L	使用前稀释至1X。1X溶液含有10 mM Tris（pH 8.0）和1 mM EDTA。
BbsI	NEB	R0539
BsmBI	NEB	R0580
T4 DNA连接酶	NEB	M0202	400,000 单位/ml
快速连接试剂盒	NEB	M2200	T4 DNA连接酶的替代品。
快速DNA连接试剂盒	Thermo Scientific	K1423	T4 DNA连接酶的替代品。
Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒	Thermo Scientific	451245	试剂盒中的TOPO载体附带盐溶液。
NEBuilder HiFi DNA组装预混液	NEB	E2621L	用于Gibson组装的试剂盒。
One Shot Stbl3 化学感受态大肠杆菌	Thermo Scientific	C737303
LB肉汤（Lennox），粉末	Sigma Aldrich	L3022	用ddH2O溶解，使用前高压灭菌
含琼脂的LB肉汤（Lennox），粉末	Sigma Aldrich	L2897	用ddH2O溶解，使用前高压灭菌
SOC培养基	-	-	1 L LB肉汤中含有2.5 mM KCl、10 mM MgCl2、20 mM葡萄糖
氨苄青霉素（钠盐），USP级	Gold Biotechnology	A-301
REDiant 2X PCR预混液	1st Base	BIO-5185
琼脂糖	1st Base	BIO-1000
T7核酸内切酶I	NEB	M0302
质粒DNA提取小量试剂盒	Favorgen	FAPDE 300
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），高糖	Hyclone	SH30081.01	含4.5 g/L葡萄糖，不含L-谷氨酰胺、HEPES和丙酮酸钠
L-谷氨酰胺，200 mM	Gibco	25030
青霉素-链霉素，10,000 U/mL	Gibco	15140
0.25% 胰蛋白酶-EDTA，1X	Gibco	25200
胎牛血清	Hyclone	SV30160	FBS在使用前于56 oC加热灭活30分钟
磷酸盐缓冲液，1X	Gibco	20012
jetPRIME转染试剂	Polyplus Transfection	114-75
QuickExtract DNA提取溶液，1.0	Epicentre	LUCG-QE09050
ISOLATE II 基因组DNA试剂盒	Bioline	BIO-52067	QuickExtract的替代品
Q5高保真DNA聚合酶	NEB	M0491
脱氧核苷三磷酸（dNTP）溶液混合物	NEB	N0447
6X DNA上样染料	Thermo Scientific	R0611	含10 mM Tris-HCl（pH 7.6）、0.03%溴酚蓝、0.03%二甲苯青FF、60%甘油、60 mM EDTA
蛋白酶抑制剂混合物，Set3	Merck	539134
硝酸纤维素膜，0.2µm	Bio-Rad	1620112
Tris-甘氨酸-SDS缓冲液，10X	Bio-Rad	1610772	使用前稀释至1X。1X溶液含25 mM Tris、192 mM甘氨酸和0.1% SDS。
Tris-甘氨酸缓冲液，10X	1st base	BUF-2020	使用前稀释至1X。1X溶液含25 mM Tris和192 mM甘氨酸。
丽春红S溶液	Sigma Aldrich	P7170
TBS，20X	1st base	BUF-3030	使用前稀释至1X。1X溶液含25 mM Tris-HCl（pH 7.5）和150 mM NaCl。
吐温20	Sigma Aldrich	P9416
免疫检测用脱脂奶粉	Nacalai Tesque	31149-75
WesternBright Sirius-femtogram HRP	Advansta	K12043
抗β-肌动蛋白（C4）抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc-47778	批号：C0916
MiSeq系统	Illumina	SY-410-1003
NanoDrop分光光度计	Thermo Scientific	ND-2000
Qubit荧光计	Thermo Scientific	Q33226
EVOS FL细胞成像系统	Thermo Scientific	AMF4300
CRISPR质粒：pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)	Addgene	48138	单载体系统：gRNA由同一质粒表达。
CRISPR质粒：pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA	Addgene	61591	单载体系统：gRNA由同一质粒表达。
CRISPR质粒：xCas9 3.7	Addgene	108379	双载体系统：gRNA由不同质粒表达。
CRISPR质粒：pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9	Addgene	42230	单载体系统：gRNA由同一质粒表达。
CRISPR质粒：hCas9	Addgene	41815	双载体系统：gRNA由不同质粒表达。
CRISPR质粒：eSpCas9(1.1)	Addgene	71814	单载体系统：gRNA由同一质粒表达。
CRISPR质粒：VP12 (SpCas9-HF1)	Addgene	72247	双载体系统：gRNA由不同质粒表达。