小鼠肺泡巨噬细胞吞噬作用与细菌清除

摘要

本文报道了分析小鼠肺泡巨噬细胞吞噬功能及肺部细菌清除能力的常用方法。这些方法用于研究体外荧光素异硫氰酸酯微球的吞噬作用以及体内的吞噬作用 铜绿假单胞菌 绿色荧光蛋白。我们还描述了一种清除方法 P. aeruginosa 在小鼠中。

摘要

肺泡巨噬细胞（AMs）守卫着肺部的肺泡腔。AMs的吞噬作用在抵御入侵病原体、清除死亡细胞或外来颗粒、以及介导炎症反应的消退和组织重塑过程中发挥关键作用，这些过程由AMs的多种表面受体所调控。本文介绍了利用体外和体内实验方法分析AMs吞噬功能的技术，以及区分模式识别受体、补体受体和Fcγ受体介导的吞噬作用的实验策略。最后，我们讨论了一种建立和表征小鼠P. aeruginosa肺炎模型的方法，用于评估体内的细菌清除能力。这些检测方法代表了评估AMs功能的常用手段，也可用于研究其他器官中巨噬细胞功能及细菌清除情况。

引言

肺泡巨噬细胞（AM）在静息状态下是肺泡中主要的常驻吞噬细胞，通过识别和内化吸入的病原体及外来颗粒，参与固有免疫应答的重要过程^1,2。已有研究报道，AM对于多种肺部病原体（如P. aeruginosa和Klebsiella pneumoniae）的快速清除至关重要^3,4，因此AM吞噬功能缺陷常导致呼吸道感染（如急性肺炎），进而引起更高的发病率和死亡率。

肺泡巨噬细胞（AMs）还通过产生TNF-α和IL-1β等细胞因子和趋化因子，启动肺部的天然免疫炎症反应，这些因子与肺泡微环境中的其他细胞相互作用，诱导趋化因子的释放，从而招募中性粒细胞、单核细胞及适应性免疫细胞至肺部⁵。例如，AMs产生的IL-1β可促进上皮细胞释放中性粒细胞趋化因子CXCL8⁶。此外，AMs还参与吞噬凋亡的多形核白细胞（PMNs）；若此功能受损，将导致PMNs内的细胞内酶持续泄漏至周围组织，引发组织损伤和慢性炎症^7,8,

方案

本方案遵循弗吉尼亚东部医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指导原则。

1. 荧光微球吞噬作用

1. 根据IACUC关于动物人道安乐死的规程，通过CO₂窒息法处死小鼠（C57BL/6J，6周龄，雌性）。
2. 将小鼠仰卧置于铺有纸巾的解剖板上，用大头针固定其四肢呈伸展状，并用绳子钩住其前牙以向后牵拉头部，使气管保持平直。
3. 用70%乙醇润湿小鼠的咽喉、胸部和腹部，以消毒并防止毛发粘附于器械上。
4. 使用普通镊子提起体中线处的皮肤，沿中线用手术剪向上剪至咽喉顶部。
5. 使用标准手术剪的钝端小心分离咽喉部位的肌肉和结缔组织，并用弹簧剪（显微剪）暴露气管。
6. 用镊子夹住一个软骨环，借助显微剪在气管腹侧面小心地做一小切口（约1.5 mm），并将18 G套管针 插入气管内。
7. 用磷酸盐缓冲液（PBS）轻柔灌洗3 mL，每次1 mL。每次将液体缓慢抽吸回注射器，再重新注入肺部，连续操作3次。收集支气管肺泡灌洗液（BALF）后，实施颈椎脱位以确认动物死亡。 将收集的PBS（约2.8 mL，即支气管肺泡灌洗液BALF）转移至离心管中，在1,000 × g下离心10分钟，收集沉淀。向管中加入1 mL新鲜PBS，再次在1,000 × g下离心10分钟以清洗杂质，收集沉淀的肺泡巨噬细胞。
8. 将沉淀....

结果

我们首先进行了实验以分析小鼠原代肺泡巨噬细胞（AMs）的吞噬作用。在所有分析中，我们比较了来自野生型（WT）和TRIM72基因修饰小鼠的肺泡巨噬细胞。^基因敲除 小鼠。如图所示 图1A荧光显微镜显示，小鼠原代肺泡巨噬细胞在孵育1小时后即可吞噬FITC-玻璃珠。 图1B 通过流式细胞术展示吞噬作用的分析。显微镜和流式细胞术测量的吞噬作用定量结果如图所示。 图1C 和 图1D分别表示MH-S细胞通过FcγR和CR介导的吞噬作用 图2A，以及 图2

讨论

肺在执行气体交换功能的同时，持续暴露于外来颗粒、病原体和过敏原的威胁之下。肺泡巨噬细胞（AMs）通过其主要功能——吞噬作用，构成了第一道防御屏障。此外，AMs 还与其他免疫细胞协同作用，以清除病原体并促进炎症消退。本文介绍了一种特异性评估从小鼠肺部分离的肺泡巨噬细胞吞噬功能的方法。本论文所提供的实验方案详细阐述了体内和体外研究吞噬作用的技术流程，该方法也可用于研究其他器官中巨噬细胞的功能及细菌清除能力。

所述体外吞噬实验基于一个简单的原理：将经血清处理的FITC珠或调理过的SRBC与培养的肺泡巨噬细胞（AM）共同孵育，以启动吞噬作用。该方法包括多次洗涤以及裂解未被吞噬的红细胞，以降低背景信号。操作过程中需注意避免使贴壁的AM脱落。使用ACK裂解液的洗涤步骤应在1分钟内完成，因为过长的处理时间会导致巨噬细胞裂解。

此外，在成像分析中，我们同时表征了吞噬细胞的百分比和吞噬指数，以全面评估肺泡巨噬细胞的吞噬功能。我们还阐述了在小鼠巨噬细胞 MH-S 细胞系中区分 PRR、FcγR 和 CR 介导的吞噬作用的方法。结合基因调控，该步骤.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
18-G 针头	尼普洛医疗	CI+1832-2C	分子生物学级
2,7-二氨基芴（DAF）	Sigma-Aldrich	D17106	分子生物学级
70% 乙醇	Decon Labs Inc.	18C27B	分析纯
96孔板	康宁	3603	细胞生物学级别
ACK裂解缓冲液	Life Technologies	A10492	分子生物学级
Alexa Fluor-488 Zymosan-A 生物颗粒	赛默飞世尔科技	Z23373	分子生物学级
C5缺陷血清	Sigma-Aldrich	C1163	生化试剂
离心	Labnet International	C0160-R
Cytospin 4 细胞离心涂片机	赛默飞世尔科技	A78300101 期号 11
DMEM细胞培养基	Gibco	11995-065	细胞生物学级别
FBS	Atlanta Biologicals	S11550	细胞生物学级别
流式细胞仪	BD生物科学	FACSCalibur
Flow Jo 软件	FlowJo, LLC
镊子	Dumont	0508-SS/45-PS-1	适用于实验动物解剖
FITC-羧基化乳胶微球	Sigma-Aldrich	L4530	细胞生物学级别
GFP-P. aeruginosa	ATCC	101045GFP	适用于  细胞感染实验
玻璃底培养皿	MatTek 公司	P35G-0.170-14-C	细胞生物学级别
高压注射器	Penn-Century	FMJ-250	适用于实验动物使用
匀浆器	Omni International	TH-01
过氧化氢	Sigma-Aldrich	H1009	分析纯
倒置荧光显微镜	Olympus	IX73
盐酸氯胺酮	Hospira	CA-2904	药品级
Shandon Kwik-Diff 染色液	赛默飞世尔科技	9990700	细胞生物学级别
LB 琼脂	Fisher Scientific	BP1425	分子生物学级
LB肉汤	Fisher Scientific	BP1427	分子生物学级
微型喷雾器气溶胶化装置	Penn-Century	IA-1C	适用于实验动物使用
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148	试剂级
PBS	Gibco	20012-027	细胞生物学级别
兔抗SRBC-IgG	MP Biomedicals	55806	适用于免疫测定
兔抗SRBC-IgM	Cedarline Laboratories	CL9000-M	适用于免疫测定
剪刀	Miltex	5-2	适用于实验动物解剖
小型动物喉镜	Penn-Century	LS-2	适用于实验动物使用
十二烷基硫酸钠（SDS）	BioRad	1610301	分析纯
弹簧剪（中号）	精细科学工具	15012-12	适用于实验动物解剖
小型弹簧剪	Fine Science Tools	91500-09	适用于实验动物解剖
绵羊红细胞（SRBCs）	MP Biomedicals	55876	洗涤并保存的SRBCs
尿素	Sigma-Aldrich	U5378	分子生物学级
赛拉嗪	Akorn动物健康	59399-110-20	药品级