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小鼠肺泡巨噬细胞吞噬作用与细菌清除

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DOI：

10.3791/59088

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2019年3月2日

 ,  ,  , 
1Department of Physiological Sciences, Eastern Virginia Medical School

本文内容

摘要

本文报道了分析小鼠肺泡巨噬细胞吞噬功能及肺部细菌清除能力的常用方法。这些方法用于研究体外荧光素异硫氰酸酯微球的吞噬作用以及体内的吞噬作用 铜绿假单胞菌 绿色荧光蛋白。我们还描述了一种清除方法 P. aeruginosa 在小鼠中。

摘要

肺泡巨噬细胞（AMs）守卫着肺部的肺泡腔。AMs的吞噬作用在抵御入侵病原体、清除死亡细胞或外来颗粒、以及介导炎症反应的消退和组织重塑过程中发挥关键作用，这些过程由AMs的多种表面受体所调控。本文介绍了利用体外和体内实验方法分析AMs吞噬功能的技术，以及区分模式识别受体、补体受体和Fcγ受体介导的吞噬作用的实验策略。最后，我们讨论了一种建立和表征小鼠P. aeruginosa肺炎模型的方法，用于评估体内的细菌清除能力。这些检测方法代表了评估AMs功能的常用手段，也可用于研究其他器官中巨噬细胞功能及细菌清除情况。

引言

肺泡巨噬细胞（AM）在静息状态下是肺泡中主要的常驻吞噬细胞，通过识别和内化吸入的病原体及外来颗粒，参与固有免疫应答的重要过程1,2。已有研究报道，AM对于多种肺部病原体（如P. aeruginosa和Klebsiella pneumoniae）的快速清除至关重要3,4，因此AM吞噬功能缺陷常导致呼吸道感染（如急性肺炎），进而引起更高的发病率和死亡率。

肺泡巨噬细胞（AMs）还通过产生TNF-α和IL-1β等细胞因子和趋化因子，启动肺部的天然免疫炎症反应，这些因子与肺泡微环境中的其他细胞相互作用，诱导趋化因子的释放，从而招募中性粒细胞、单核细胞及适应性免疫细胞至肺部5。例如，AMs产生的IL-1β可促进上皮细胞释放中性粒细胞趋化因子CXCL86。此外，AMs还参与吞噬凋亡的多形核白细胞（PMNs）；若此功能受损，将导致PMNs内的细胞内酶持续泄漏至周围组织，引发组织损伤和慢性炎症7,8,9。

肺泡巨噬细胞（AMs）的吞噬作用由AMs的模式识别受体（PRRs）直接识别病原体表面的病原体相关分子模式介导，或通过AMs的免疫效应受体与被调理的病原体结合而介导10。在后一种情况下，AMs可通过其Fcγ受体（FcγR）识别被免疫球蛋白（IgG）调理的靶标，或通过其补体受体（CR）识别被补体片段C3b和C3bi包被的病原体11。在补体受体中，属于免疫球蛋白超家族的补体受体（CRIg）选择性地在组织巨噬细胞中表达12，最近一项研究强调了CRIg在铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）肺炎背景下AM吞噬作用中的重要作用13。

许多原始研究采用巨噬细胞吞噬作用的评估方法来描述巨噬细胞功能的分子机制14,15然而，诸如体内吞噬作用等方法需要对吞噬作用进行精确定量。本文总结了使用异硫氰酸荧光素（FITC）-玻璃珠进行体外和体内吞噬作用的详细方法。 P. aeruginosa 绿色荧光蛋白（GFP）。此外，我们阐述了区分PRR介导、CR介导和FcγR介导的吞噬作用的方法。最后，我们报道了一种针对小鼠体内细菌清除能力的表征方法，以P. aeruginosa 肺炎

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方案

本方案遵循弗吉尼亚东部医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指导原则。

1. 荧光微球吞噬作用

  1. 根据IACUC关于动物人道安乐死的规程，通过CO2窒息法处死小鼠（C57BL/6J，6周龄，雌性）。
  2. 将小鼠仰卧置于铺有纸巾的解剖板上，用大头针固定其四肢呈伸展状，并用绳子钩住其前牙以向后牵拉头部，使气管保持平直。
  3. 用70%乙醇润湿小鼠的咽喉、胸部和腹部，以消毒并防止毛发粘附于器械上。
  4. 使用普通镊子提起体中线处的皮肤，沿中线用手术剪向上剪至咽喉顶部。
  5. 使用标准手术剪的钝端小心分离咽喉部位的肌肉和结缔组织，并用弹簧剪（显微剪）暴露气管。
  6. 用镊子夹住一个软骨环，借助显微剪在气管腹侧面小心地做一小切口（约1.5 mm），并将18 G套管针 插入气管内。
  7. 用磷酸盐缓冲液（PBS）轻柔灌洗3 mL，每次1 mL。每次将液体缓慢抽吸回注射器，再重新注入肺部，连续操作3次。收集支气管肺泡灌洗液（BALF）后，实施颈椎脱位以确认动物死亡。 将收集的PBS（约2.8 mL，即支气管肺泡灌洗液BALF）转移至离心管中，在1,000 × g下离心10分钟，收集沉淀。向管中加入1 mL新鲜PBS，再次在1,000 × g下离心10分钟以清洗杂质，收集沉淀的肺泡巨噬细胞。
  8. 将沉淀重悬于2 mL含10%未灭活胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，并将原代肺泡巨噬细胞接种于玻璃底培养皿中，在37 °C、湿润气氛中培养2天。
  9. 吸除旧培养基，用1 mL PBS洗涤一次，加入2 mL新鲜培养基。加入FITC标记的微球（羧基化乳胶微球，直径2 µm，每细胞50个微球），在37 °C、湿润气氛中孵育1小时。
  10. 用PBS充分洗涤（每次1 mL，共洗涤5次），以去除细胞外微球。随机成像100个细胞，计数含有细胞内微球的细胞数量（激发波长488 nm）。
    ​注：吞噬指数为摄入微球总数除以巨噬细胞总数；吞噬细胞百分比为至少摄入一个微球的巨噬细胞数除以巨噬细胞总数16。
    1. 或者，在与微球孵育1小时后，用3 mL PBS洗涤细胞，并进行流式细胞术分析以定量吞噬作用。同样，将未加微球的肺泡巨噬细胞作为未染色对照或空白对照细胞处理。在流式细胞分析软件中选择相应选项，计算阳性百分比和平均荧光强度。

2. FcγR 和 CR 介导的吞噬作用

  1. 进行调理作用时，将 2 × 108 个绵羊红细胞（SRBCs）与 50 µL 兔抗SRBC-IgM 或 50 µL 兔抗SRBC-IgG 在室温下孵育 30 分钟11。
  2. 将经IgM调理的SRBCs与 50 µL C5缺陷型（C5D）人血清在 37 °C 下孵育 30 分钟，使补体片段 C3b 和 C3bi 固定在IgM包被的SRBCs上。
  3. 将小鼠巨噬细胞（MH-S细胞）以每孔 10,000 个细胞的密度接种于 96 孔板中，过夜培养至约 70% 汇合度。向每孔 MH-S 细胞中加入 100 µL 浓度为 1 × 107/mL 的调理SRBCs，在 37 °C 下孵育 1 小时。用 100 µL 氯化铵-钾（ACK）裂解缓冲液快速洗涤未结合的SRBCs（约 1 分钟）。
  4. 用 0.1% SDS 裂解细胞，加入含 3% 过氧化氢和 6 M 尿素的 50 µL 2,7-二氨基荧光素（DAF）。在 620 nm 处测定血红蛋白催化生成荧光蓝的吸光度。
  5. 利用已知数量SRBCs的标准曲线，根据 620 nm 处的吸光度值确定SRBCs的数量。同样处理与未调理SRBCs孵育的MH-S细胞，作为阴性对照。

3. PRR 介导的吞噬作用

  1. 按照步骤 1.1–1.9 分离并培养小鼠原代肺泡巨噬细胞。
  2. 培养 2 天后，弃去培养基，用 1 mL PBS 洗涤细胞，然后加入含有 Alexa Fluor-488 标记的酵母聚糖-A 生物颗粒（每皿 100 个颗粒）的新鲜培养基 500 µL。
  3. 在 37 °C 下孵育 1 小时。加入 500 µL 冰冷 PBS 终止吞噬作用。
  4. 用 PBS 充分洗涤细胞（每次 1 mL，共洗涤 5 次），然后在室温下用 4% 多聚甲醛固定细胞 10 分钟。
  5. 用 PBS 充分洗涤细胞（每次 1 mL，共洗涤 5 次），并将细胞保存在 500 µL PBS 中。
  6. 在微分干涉相差显微镜和 488 nm 荧光通道下观察细胞成像。计数含有酵母聚糖-A 生物颗粒的肺泡巨噬细胞，并计算吞噬作用的百分比。

4. 体内 肺泡巨噬细胞的吞噬作用

注意：将P. aeruginosa GFP接种于营养琼脂平板上，在37°C条件下培养过夜。次日，挑取单菌落接种至2 mL营养肉汤中，于37°C过夜培养细菌。

  1. 第二天，通过腹腔注射 100 mg/kg 氯胺酮和 10 mg/kg 赛拉嗪对小鼠进行麻醉。通过脚趾夹捏无反应来确认麻醉效果。
  2. 将小鼠仰卧固定于平板上，用橡皮筋固定上门齿，使其呈半卧位（45°），腹部和头端朝上。使用弯头镊子部分外拉舌头，利用微量喷雾器经气管向麻醉小鼠肺部给予 50 µL（5 × 106 菌落形成单位 [CFU]）17 的 P. aeruginosa GFP。
  3. 感染 1 小时后，执行步骤 1.1–1.7。
  4. 用 PBS 重悬细胞，并通过细胞离心机（1,000 × g，室温 1 分钟）将细胞沉降到载玻片上。
  5. 根据制造商说明书，对细胞涂片进行差异染色，以区分肺泡巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞。
  6. 随机选取 100 个肺泡巨噬细胞（AMs），计数含有胞内细菌的 AMs 数量，并计算吞噬作用的百分比。

5. 体内 使用细菌清除 P. aeruginosa

  1. 在 P. aeruginosa 分离琼脂平板上接种 P. aeruginosa，于 37°C 培养过夜。挑取单菌落接种至 2 mL 营养肉汤（LB）中，于 37°C 培养过夜。使用以下公式计算 CFU。

    CFU/mL =（菌落数 × 稀释倍数）/ 培养平板接种体积。

    用 PBS 稀释菌液，获得所需浓度的 CFU/mL。
  2. 在试验 1 中，按照步骤 4.2 所述，向麻醉的野生型（WT）和 TRIM72KO 小鼠气管内注射约 2.5 × 105 CFU/mL 的亚致死剂量 P. aeruginosa。连续 6 天每日测量小鼠体重。
  3. 在试验 2 中，向试验 1 中存活的小鼠再次注射第二剂 P. aeruginosa（5 × 105 CFU/mL），并连续 4 天测量体重。
  4. 在试验 3 中，使用另一组小鼠，向 WT 和 TRIM72KO 小鼠注射致死剂量（3 × 107 CFU/mL）的 P. aeruginosa，并在注射后 2 天内记录死亡率。 出现明显体重下降、弓背、厌食或呼吸困难等严重应激症状的动物将由驻场兽医进行评估，无法救治的动物将立即实施安乐死。
  5. 在动物死亡或注射后第 2 天实施安乐死后，采集全肺组织，用于检测感染高峰期的肺部细菌负荷量。
  6. 检测肺部细菌负荷时，向肺组织中加入 200 µL 生理盐水，使用已验证的电子匀浆仪参数进行匀浆处理，确保完全破坏肺组织但不破坏细菌。将肺匀浆液总体积调整至 1 mL，并将 100 µL 肺裂解液按 10 倍系列稀释后接种于 Pseudomonas 分离琼脂平板。
  7. 将平板于 37 °C 培养 24 小时，计数细菌菌落，确定每只小鼠全肺的 CFU 数量。

6. 统计分析

  1. 使用学生的 t 检验来确定两组之间差异的统计学显著性。当 p < 0.05 时，认为差异具有统计学显著性。所有数据均以均值 ± 均值标准误（SEM）表示。

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结果

我们首先进行了实验以分析小鼠原代肺泡巨噬细胞（AMs）的吞噬作用。在所有分析中，我们比较了来自野生型（WT）和TRIM72基因修饰小鼠的肺泡巨噬细胞。基因敲除 小鼠。如图所示 图1A荧光显微镜显示，小鼠原代肺泡巨噬细胞在孵育1小时后即可吞噬FITC-玻璃珠。 图1B 通过流式细胞术展示吞噬作用的分析。显微镜和流式细胞术测量的吞噬作用定量结果如图所示。 图1C 和 图1D分别表示MH-S细胞通过FcγR和CR介导的吞噬作用 图2A，以及 图2

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讨论

肺在执行气体交换功能的同时，持续暴露于外来颗粒、病原体和过敏原的威胁之下。肺泡巨噬细胞（AMs）通过其主要功能——吞噬作用，构成了第一道防御屏障。此外，AMs 还与其他免疫细胞协同作用，以清除病原体并促进炎症消退。本文介绍了一种特异性评估从小鼠肺部分离的肺泡巨噬细胞吞噬功能的方法。本论文所提供的实验方案详细阐述了体内和体外研究吞噬作用的技术流程，该方法也可用于研究其他器官中巨噬细胞的功能及细菌清除能力。

所述体外吞噬实验基于一个简单的原理：将经血清处理的FITC珠或调理过的SRBC与培养的肺泡巨噬细胞（AM）共同孵育，以启动吞噬作用。该方法包括多次洗涤以及裂解未被吞噬的红细胞，以降低背景信号。操作过程中需注意避免使贴壁的AM脱落。使用ACK裂解液的洗涤步骤应在1分钟内完成，因为过长的处理时间会导致巨噬细胞裂解。

此外，在成像分析中，我们同时表征了吞噬细胞的百分比和吞噬指数，以全面评估肺泡巨噬细胞的吞噬功能。我们还阐述了在小鼠巨噬细胞 MH-S 细胞系中区分 PRR、FcγR 和 CR 介导的吞噬作用的方法。结合基因调控，该步骤...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由 X. Zhao 获得的 R01HL116826 项目资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
18-G 针头尼普洛医疗 CI+1832-2C分子生物学级
2,7-二氨基芴（DAF）Sigma-AldrichD17106分子生物学级
70% 乙醇Decon Labs Inc.18C27B分析纯
96孔板康宁3603细胞生物学级别
ACK裂解缓冲液Life TechnologiesA10492分子生物学级
Alexa Fluor-488 Zymosan-A 生物颗粒赛默飞世尔科技Z23373分子生物学级
C5缺陷血清 Sigma-AldrichC1163生化试剂
离心Labnet InternationalC0160-R
Cytospin 4 细胞离心涂片机赛默飞世尔科技A78300101 期号 11
DMEM细胞培养基Gibco11995-065细胞生物学级别
FBSAtlanta BiologicalsS11550细胞生物学级别
流式细胞仪BD生物科学FACSCalibur
Flow Jo 软件FlowJo, LLC
镊子Dumont0508-SS/45-PS-1适用于实验动物解剖
FITC-羧基化乳胶微球Sigma-AldrichL4530细胞生物学级别
GFP-P. aeruginosaATCC101045GFP适用于  细胞感染实验
玻璃底培养皿MatTek 公司P35G-0.170-14-C细胞生物学级别
高压注射器Penn-CenturyFMJ-250适用于实验动物使用
匀浆器Omni InternationalTH-01
过氧化氢Sigma-AldrichH1009分析纯
倒置荧光显微镜OlympusIX73
盐酸氯胺酮HospiraCA-2904药品级
Shandon Kwik-Diff 染色液赛默飞世尔科技9990700细胞生物学级别
LB 琼脂Fisher ScientificBP1425分子生物学级
LB肉汤Fisher ScientificBP1427分子生物学级
微型喷雾器气溶胶化装置Penn-CenturyIA-1C适用于实验动物使用
多聚甲醛Sigma-AldrichP6148试剂级
PBSGibco20012-027细胞生物学级别
兔抗SRBC-IgG MP Biomedicals55806适用于免疫测定
兔抗SRBC-IgM Cedarline LaboratoriesCL9000-M适用于免疫测定
剪刀Miltex5-2适用于实验动物解剖
小型动物喉镜Penn-CenturyLS-2适用于实验动物使用
十二烷基硫酸钠（SDS）BioRad1610301分析纯
弹簧剪（中号）精细科学工具15012-12适用于实验动物解剖
小型弹簧剪Fine Science Tools91500-09适用于实验动物解剖
绵羊红细胞（SRBCs） MP Biomedicals55876洗涤并保存的SRBCs
尿素Sigma-AldrichU5378分子生物学级
赛拉嗪 Akorn动物健康59399-110-20药品级

参考文献

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