本文描述了一种通过行为学方法简单测量成年斑马鱼应激反应的技术。该方法利用了斑马鱼在应激状态下倾向于停留在水箱下半部分的先天行为特征。我们还介绍了将该检测方法与药理学实验相结合的技术。
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本文内容
摘要
摘要
对压力刺激做出适当反应对于生物体的生存至关重要。目前已有大量关于压力相关疾病和精神障碍的研究，但要开发更有效的治疗方法，仍需进一步深入研究压力的遗传和神经调控机制。斑马鱼作为一种强大的遗传学模型，可用于探究压力的神经基础，因为目前已建立了大量突变体和转基因品系。此外，药理学方法在斑马鱼中也易于应用，大多数药物可直接添加到水中。本文介绍了利用“新环境鱼缸实验”（novel tank test）研究斑马鱼先天应激反应的方法，并展示了如何通过该检测方法验证潜在的抗焦虑药物。该方法可方便地与携带特定基因突变的斑马鱼品系结合使用，也可与用于操控特定神经回路的转基因技术联用。该检测方法还可应用于其他鱼类模型。综上所述，本实验方案有助于推动其他实验室采用这一简便的检测手段。
引言
应激反应是由潜在有害或厌恶性刺激引起的、发生改变的行为和生理状态。应激反应在动物界中具有高度保守性，对生物体的生存至关重要1。数十年的研究极大地拓展了我们对某些应激状态背后遗传和神经机制的认识。目前，诸如杏仁核和纹状体2等脑区，以及诸如促肾上腺皮质激素释放激素（corticotropin releasing hormone，crh）、糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor，gr）和盐皮质激素受体（mineralocorticoid receptor，mr）等遗传因子已被广泛研究3,4,5,6。尽管取得了这些关键发现，但关于应激的遗传和神经调控机制仍有许多未知之处。因此，许多与应激相关的疾病缺乏有效的治疗手段。
可进行遗传改造的模式生物为研究行为的遗传和神经控制提供了有用的工具。其中，鱼类模型尤其强大：它们体型小、世代周期短，在实验室环境中易于操作，基因组易于修饰，并且作为脊椎动物，不仅在遗传上，而且....
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方案
该实验方案已获得佛罗里达大西洋大学机构动物护理与使用委员会的批准。
1. 准备
- 指定一个独立的房间用于进行行为学研究，或封闭房间内的一个区域以实现隔离。
注意：该房间应保持安静且人员走动较少，以避免干扰鱼类的正常行为。 - 将以下材料和设备移入行为学实验房间：(i) 相机及镜头，(ii) 可安装在镜头上的红外滤光片，(iii) 相机支架，(iv) 安装有相机采集软件的计算机，(v) 坚固且稳定的实验操作台，(vi) 红外光源（IR光源；850 nm 或 940 nm），(vii) 白色亚克力漫射板，其长度需超过记录用鱼缸的长度，(viii) 1.8 L 容量的梯形塑料实验缸（称为“新奇环境缸”；本文所用规格为 12 × 18 英寸），以及 (ix) 一桶养殖系统用水。
注意：对于新奇环境缸，本实验室使用市售的梯形塑料容器。该鱼缸尺寸约为 6 英寸 × 9 英寸（详细尺寸见 图1A）。所用漫射板略大于新奇环境缸（12 英寸 × 18 英寸）。已有研究使用不同形状的新奇环境缸进行实验，例如矩形缸或不同尺寸的梯形缸20,21。通常情况下，无论鱼缸尺寸如何，鱼类行为表现相似：在所有容器中，鱼类最初倾向于停留在下半部分....
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结果
检测斑马鱼的应激反应
为了研究野生型斑马鱼随时间变化的应激行为，我们采用AB品系的成年鱼在新型水箱实验（novel tank test）中进行测试24。AB品系成年鱼按照上述方案进行处理。简言之，将鱼置于行为实验室内水箱中适应环境1小时。随后将单条鱼放入烧杯中10分钟，再轻柔转移至装有新鲜系统用水的陌生水箱（新型水箱）中。记录10分钟内的运动活动，并使用 commercially available software 离线进行轨迹追踪。对第一分钟与最后一分钟的运动活动进行比较，发现存在显著差异（图2A,B）。当鱼刚被放入水箱时，大部分时间停留在底部（图2B）；但随着时间推移，成年鱼在上部区域停留的时间逐渐增加（图2B,C）.......
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讨论
斑马鱼在新环境中表现出强烈的应激反应
本文介绍一种简单的斑马鱼成鱼应激反应行为学检测方法，并通过药理学手段验证该方法作为应激水平简易评估指标的有效性。
新水箱实验是一种广泛用于研究斑马鱼及其他鱼类先天应激反应的测试方法12,14,21,35,36，且斑马鱼已被证明是研究抗焦虑相关药物药理作用的有力模型。与人类相似，这些研究表明，如丁螺环酮、尼古丁、氟西汀和东莨菪碱等药物在斑马鱼中具有抗焦虑效应12,13,14,
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披露
作者声明不存在任何竞争性或经济利益冲突。
致谢
本研究得到了佛罗里达大西洋大学朱庇特生命科学计划（Jupiter Life Science Initiative）对ERD和ACK的资助。此外，本研究还获得了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）资助的R21NS105071（授予ACK和ERD）和R15MH118625（授予ERD）两项基金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 相机 | 我们使用 Edmund Optics 提供镜头的 Point Grey Grasshopper3 USB 相机。 | ||
| 红外滤光片 | Edmund Optics | ||
| 视频采集程序 | 使用 Virtualdub 或 FlyCapture 等程序，因为可以设置采集帧率。 | ||
| 红外 LED 灯 | |||
| 实验水箱 | Aquaneering | 货号 ZT180 | 规格：M3 1.8 升 |
| 相机支架和夹具，或标准三脚架 | |||
| 250 mL 烧杯 | |||
| 轨迹追踪软件 | 我们使用 Noldus Information Technology 公司的 Ethovision XT 13 | ||
| 盐酸丁螺环酮 | Sigma-Aldrich | B7148 | |
| 随机试验生成器 | 我们使用 Microsoft Excel 中的 RANDBETWEEN 函数 |
参考文献
- McEwen, B. S. Stress, adaptation, and disease. Allostasis and allostatic load. Annals of the New York Academy of Sciences. 840, 33-44 (1998).
- Tovote, P., Fadok, J. P., Lüthi, A. Neuronal circuits for fear and anxiety. Nature Reviews Neuroscience.
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重印与许可
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