研究斑马鱼先天应激的动物行为学方法

摘要

本文描述了一种通过行为学方法简单测量成年斑马鱼应激反应的技术。该方法利用了斑马鱼在应激状态下倾向于停留在水箱下半部分的先天行为特征。我们还介绍了将该检测方法与药理学实验相结合的技术。

摘要

对压力刺激做出适当反应对于生物体的生存至关重要。目前已有大量关于压力相关疾病和精神障碍的研究，但要开发更有效的治疗方法，仍需进一步深入研究压力的遗传和神经调控机制。斑马鱼作为一种强大的遗传学模型，可用于探究压力的神经基础，因为目前已建立了大量突变体和转基因品系。此外，药理学方法在斑马鱼中也易于应用，大多数药物可直接添加到水中。本文介绍了利用“新环境鱼缸实验”（novel tank test）研究斑马鱼先天应激反应的方法，并展示了如何通过该检测方法验证潜在的抗焦虑药物。该方法可方便地与携带特定基因突变的斑马鱼品系结合使用，也可与用于操控特定神经回路的转基因技术联用。该检测方法还可应用于其他鱼类模型。综上所述，本实验方案有助于推动其他实验室采用这一简便的检测手段。

引言

应激反应是由潜在有害或厌恶性刺激引起的、发生改变的行为和生理状态。应激反应在动物界中具有高度保守性，对生物体的生存至关重要¹。数十年的研究极大地拓展了我们对某些应激状态背后遗传和神经机制的认识。目前，诸如杏仁核和纹状体²等脑区，以及诸如促肾上腺皮质激素释放激素（corticotropin releasing hormone，crh）、糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor，gr）和盐皮质激素受体（mineralocorticoid receptor，mr）等遗传因子已被广泛研究^3,4,5,6。尽管取得了这些关键发现，但关于应激的遗传和神经调控机制仍有许多未知之处。因此，许多与应激相关的疾病缺乏有效的治疗手段。

可进行遗传改造的模式生物为研究行为的遗传和神经控制提供了有用的工具。其中，鱼类模型尤其强大：它们体型小、世代周期短，在实验室环境中易于操作，基因组易于修饰，并且作为脊椎动物，不仅在遗传上，而且在神经解剖结构上与其哺乳动物对应物具有同源性^7,8。标准的应激检测方法可与携带特定基因突变的斑马鱼品系，或能够精确操控特定神经元亚群的品系相结合，从而快速高效地评估单个基因或特定神经元的作用。

从行为学角度来看，鱼类的应激反应可表现为活动过度或长时间的静止不动（类似于“僵直”状态）⁹、探索行为减少¹⁰、呼吸加快、摄食量降低¹¹，以及倾向于停留在水箱底部¹²。例如，当成年斑马鱼或其他小型鱼类模型被放入一个陌生水箱时，最初会偏好停留在水箱下半部分；但随着时间推移，鱼类会逐渐以接近相等的频率探索水箱的上半部和下半部¹²。若使用已知具有抗焦虑作用的药物处理成年鱼，则这些鱼类会立即开始探索水箱上半部分^10,13。相反，使用可增强焦虑的药物则会导致鱼类强烈偏好停留在水箱下半部分^12,14,15。因此，探索行为减少以及对水箱下半部分的偏好是衡量鱼类应激状态简单而可靠的指标。

与其他大多数脊椎动物类似，鱼类的应激反应由下丘脑-垂体-间肾轴（HPI；类似于哺乳动物的下丘脑-垂体-肾上腺轴[HPA]）的激活所驱动^14,16。表达促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）的下丘脑神经元向垂体发出信号，促使垂体释放促肾上腺皮质激素（ACTH）。ACTH 随后作用于间肾组织，促进皮质醇的合成与分泌。皮质醇具有多种下游作用靶点¹⁶，其中之一是对产生 crh 的下丘脑神经元施加负反馈调节^3,17,18,19。

本文介绍了一种评估先天性应激行为指标的方法。在行为学检测方面，我们详细描述了使用新环境水箱潜水实验的方案^12,14。随后，我们以已知的抗焦虑药物丁螺环酮为例，证明其可降低应激相关的行为学指标。

方案

该实验方案已获得佛罗里达大西洋大学机构动物护理与使用委员会的批准。

1. 准备

1. 指定一个独立的房间用于进行行为学研究，或封闭房间内的一个区域以实现隔离。
   注意：该房间应保持安静且人员走动较少，以避免干扰鱼类的正常行为。
2. 将以下材料和设备移入行为学实验房间：(i) 相机及镜头，(ii) 可安装在镜头上的红外滤光片，(iii) 相机支架，(iv) 安装有相机采集软件的计算机，(v) 坚固且稳定的实验操作台，(vi) 红外光源（IR光源；850 nm 或 940 nm），(vii) 白色亚克力漫射板，其长度需超过记录用鱼缸的长度，(viii) 1.8 L 容量的梯形塑料实验缸（称为“新奇环境缸”；本文所用规格为 12 × 18 英寸），以及 (ix) 一桶养殖系统用水。
   注意：对于新奇环境缸，本实验室使用市售的梯形塑料容器。该鱼缸尺寸约为 6 英寸 × 9 英寸（详细尺寸见 图1A）。所用漫射板略大于新奇环境缸（12 英寸 × 18 英寸）。已有研究使用不同形状的新奇环境缸进行实验，例如矩形缸或不同尺寸的梯形缸^20,21。通常情况下，无论鱼缸尺寸如何，鱼类行为表现相似：在所有容器中，鱼类最初倾向于停留在下半部分，但随着时间推移，逐渐更频繁地探索上半部分。
3. 将红外滤光片安装到相机镜头上。红外灯带的波长通常在 850 nm 至 940 nm 范围内。该滤光片为长通滤光片，可阻止波长低于 720 nm 的光线透过并进入相机。
4. 为相机采集软件选择合适的参数。大多数实验中，将采集帧率设为每秒 30 帧，记录时长设为 10 分钟。
   注意：这些参数可能因实验需求而异。例如，在研究新奇环境中的习惯化过程^22,23时，可能需要更长的记录时间。

2. 实验设置

注意：本节步骤描述了新水箱实验的设置方法。最终产物的示意图见图1B。

1. 将新环境水箱放置在桌子中央。
2. 将红外光源置于水箱后方，并在水箱与LED光源之间放置白色亚克力板或漫射屏。
   1. 放置漫射屏时，应使其最大程度地分散来自LED的光线，且光照强度足以照亮新环境水箱。漫射板离光源越近，光线越亮，但扩散效果越差；相反，将漫射板远离光源可更好地扩散光线，但会降低光照强度。
3. 用养殖系统水填充新环境水箱约四分之三的体积。
   注：系统水通过将自来水进行反渗透处理后配制而成，调节至电导率为 900 ± 100 µS，pH 值为中性（7.2），温度为 27 ± 1 °C。
4. 将相机固定在相机支架上，并连接至计算机。打开视频采集软件，调整相机使其正对水箱前方，确保整个新环境水箱均在视野范围内，且视频中无任何遮挡区域。通过调整水箱和红外光源的位置，使相机观察时水箱内光照充足且均匀。
   注：在正式开展实验前，通常可先进行一次试运行，采集一条鱼的视频并进行轨迹追踪分析，以确认实验装置是否满足行为学实验的要求。

3. 新型水箱实验装置

1. 准备一个装有养殖系统水的250 mL烧杯，以及至少两个暂养容器。
2. 实验当天早晨，从鱼类饲养设施中选取至少10条用于每种实验条件（对照组和实验组成鱼）的成年斑马鱼，转移至暂养缸中，随后将其转移至行为学实验房间，静置至少1小时以适应环境。
   注意：实验前应进行功效分析，但在本实验条件下，n = 10 通常足以检测到统计学显著性。此外，饲养箱中每升水所含个体数不应超过五个。斑马鱼成鱼在进入新鱼缸后30分钟内即可适应环境，因此一小时的适应时间已足够。²²此外，行为节律受昼夜节律过程的影响，因此在不同日期进行的实验重复应于相同时间段内完成。我们通常在上午11:00至下午6:00之间进行所有实验。
3. 标记饲养箱，使实验人员对动物的处理条件或基因型处于盲态。
   注意：可通过使用字母或数字系统标记水箱（例如，一个水箱标记为“A”，另一个标记为“B”等），使实验者轻松实现盲法操作。由不参与实验的第三方人员使用该系统标记水箱，并在数据分析完成前对实验者隐藏各水箱的真实身份。
4. 使用网具，将一条成年鱼轻轻放入步骤3.1中预先装好溶液的烧杯中。让成年鱼在烧杯中适应10分钟。
   注意：记录成虫的性别，因为在后续分析中可能需要考察性别特异性差异。
5. 在烧杯中适应后，轻轻将烧杯中的水和成鱼倒入新环境鱼缸（第1节中设置的鱼缸）中，使鱼进入新环境。
6. 将成年鱼放入新水箱后，启动摄像机开始录像，并立即离开实验装置区域，以避免对鱼造成额外干扰。
7. 记录结束后，将个体从新环境水箱中取出，并放入一个新的暂养水箱中。
   注意：应使用与步骤 3.2 中不同的暂养容器，以避免对同一受试个体进行重复测试。
8. 对每只成年动物重复步骤 3.4 至 3.7，直至所有动物均完成检测。
   注意：除了对条件或基因型设盲外，还需对试验顺序进行随机化。可使用随机数生成器或其他能够实现试验随机分配的工具。随机化应在实验开始前完成，以确保每个试验的顺序在实验开始前即已确定。
9. 所有测试结束后，将鱼送回鱼类饲养设施。

4. 药物预处理

注意：以下步骤的目的是比较个体在用药前后的行为变化。该比较通过首先进行新环境水箱实验（如步骤 3.4 至 3.6 所述），随后给予药物处理，再进行第二次新环境水箱实验来实现（图 3A）。

1. 配制药物的储备液，包括阳性和阴性对照。
   注意：如果该药物在已有文献中使用过，请查找合适的使用剂量并采用该剂量。例如，在代表性结果中，对于丁螺环酮，我们配制了100倍浓缩的储备液，并以0.05 mg/mL作为终浓度，具体如文献所述^13,20。若推荐剂量未知，应通过检测多个浓度来建立剂量-反应曲线。设置多个含有药物系列稀释液的烧杯。如果药物不溶于水，可使用二甲基亚砜（DMSO）作为溶剂。
2. 将药物用系统用水稀释至工作浓度，置于250 mL烧杯中。例如，若已配制100倍浓缩液，则按1:100比例用系统用水稀释。另设一个仅含系统用水的烧杯作为对照。
   注意：如果在步骤3.1中使用了DMSO作为溶剂，则在对照烧杯中也应加入等体积的DMSO。
3. 在另一位研究人员的协助下，对药物组和对照组烧杯进行编号或标记，以隐藏其身份信息，确保测试人员在分析前对处理条件保持盲态。
   注意：可采用数字或字母系统进行标记。
4. 按照步骤3.1至3.6执行一次新环境水箱实验，以获得基础行为应激反应。
5. 完成基础记录后，使用渔网立即将成年鱼从新环境水箱中取出，并根据步骤4.2的描述将其放入含有药物或溶剂的烧杯中。让成年鱼在烧杯中停留10分钟。
   注意：确保渔网不接触烧杯中的水，以防止药物交叉污染。根据所用药物的不同，确保正确的给药剂量和时间。10分钟的处理时间可能并不适用于所有药物。
6. 处理结束后，使用渔网将成年鱼从步骤4.5中的烧杯中取出，并转移至另一个仅装有新鲜系统用水的烧杯中。此为洗脱期，旨在减少第二次新环境水箱测试期间的持续给药。让成年鱼在此洗脱烧杯中再停留10分钟。
   注意：每种药物条件应使用独立的渔网，以避免药物之间的非预期交叉处理。若实验者认为必要，可省略洗脱期。
7. 第二次执行新环境水箱潜水实验：将上一步中的成年鱼从烧杯中取出，放入一个新的新环境水箱中，并继续执行步骤3.5至3.6。
8. 第二次新环境水箱测试结束后，将个体转移至单独的暂养水箱中。倒掉第二个新环境水箱中的系统用水，并注入新鲜系统用水以备下一次测试。此步骤可防止任何药物的交叉污染。
   注意：根据药物的半衰期，含药烧杯应每3小时重新配制一次。对于丁螺环酮，需每3小时配制新鲜溶液。此外，参照步骤3.8中的说明，应在对照组与药物处理组之间随机安排实验顺序。
9. 所有实验结束后，将个体鱼返回至鱼类饲养设施。
   注意：根据所用药物的类型，这些处理对个体的影响可能是长期的。因此，不应将这些个体用于其他实验。

5. 视频分析

1. 所有试验结束后，将视频文件导入所选的追踪分析软件。
   注意：我们通常使用商业化的追踪软件，但也有多种免费软件包可供选择。不同软件包的操作步骤可能有所差异。
2. 从视频中选取一个静态帧，定义虚拟边界：(i) 围绕整个盛水的新环境水箱区域，以及 (ii) 水箱的上三分之一、(iii) 中三分之一和 (iv) 下三分之一区域。利用这些边界确定斑马鱼在新环境水箱各区域停留的时间。
3. 针对第5.2步中定义的每个区域，计算每帧的x-y位移。
4. 定义水箱的上、中、下三个区域，各区域大小应相近。确定这些区域的一种简要方法是：计算水箱在y方向上的长度，并将其除以3。
   注意：该通用方案存在一些变体。例如，部分实验室使用二分法而非三分法¹⁴。
5. 确定在每个区域中停留的时间、移动距离和速度。
   注意：大多数追踪软件会自动为用户计算这些参数。但如果所用软件不具备此功能，也可通过x-y位移数据手动计算。例如，距离可通过以下公式确定：
   
   速度则可通过以下公式确定：
   
6. 重复步骤5.2至5.4，以获取所有试验的运动轨迹和测量数据。
   注意：该通用方案存在多种变体

6. 正态性检验

1. 在计算统计学差异之前，先进行统计分析。使用Shapiro-Wilk检验来判断数据是否符合正态分布。
2. 如果拒绝数据服从正态分布的零假设（即数据不服从高斯分布），则应使用非参数检验进行所有分析；相反，如果数据符合正态分布，则继续使用参数检验。
   注意：我们使用商业软件进行统计分析；然而，也可以使用R编程语言。可通过R中的shapiro.test函数执行Shapiro-Wilk检验。

结果

检测斑马鱼的应激反应
为了研究野生型斑马鱼随时间变化的应激行为，我们采用AB品系的成年鱼在新型水箱实验（novel tank test）中进行测试²⁴。AB品系成年鱼按照上述方案进行处理。简言之，将鱼置于行为实验室内水箱中适应环境1小时。随后将单条鱼放入烧杯中10分钟，再轻柔转移至装有新鲜系统用水的陌生水箱（新型水箱）中。记录10分钟内的运动活动，并使用 commercially available software 离线进行轨迹追踪。对第一分钟与最后一分钟的运动活动进行比较，发现存在显著差异（图2A,B）。当鱼刚被放入水箱时，大部分时间停留在底部（图2B）；但随着时间推移，成年鱼在上部区域停留的时间逐渐增加（图2B,C）...

讨论

斑马鱼在新环境中表现出强烈的应激反应
本文介绍一种简单的斑马鱼成鱼应激反应行为学检测方法，并通过药理学手段验证该方法作为应激水平简易评估指标的有效性。

新水箱实验是一种广泛用于研究斑马鱼及其他鱼类先天应激反应的测试方法^{12,14,21,35,36}，且斑马鱼已被证明是研究抗焦虑相关药物药理作用的有力模型。与人类相似，这些研究表明，如丁螺环酮、尼古丁、氟西汀和东莨菪碱等药物在斑马鱼中具有抗焦虑效应^12,13,14,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
相机			我们使用 Edmund Optics 提供镜头的 Point Grey Grasshopper3 USB 相机。
红外滤光片	Edmund Optics
视频采集程序			使用 Virtualdub 或 FlyCapture 等程序，因为可以设置采集帧率。
红外 LED 灯
实验水箱	Aquaneering	货号 ZT180	规格：M3 1.8 升
相机支架和夹具，或标准三脚架
250 mL 烧杯
轨迹追踪软件			我们使用 Noldus Information Technology 公司的 Ethovision XT 13
盐酸丁螺环酮	Sigma-Aldrich	B7148
随机试验生成器			我们使用 Microsoft Excel 中的 RANDBETWEEN 函数