方法文章

墨西哥洞穴鱼基因功能的操作

DOI：

10.3791/59093

⸱

2019年4月22日

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1Department of Biological Sciences, Florida Atlantic University, 2Jupiter Life Science Initiative, Florida Atlantic University, 3Harriet L. Wilkes Honors College, Florida Atlantic University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们介绍了在进化模型系统 Astyanax mexicanus 中进行基因操作的方法。文中描述了三种不同的技术：基于Tol2的转基因技术、利用CRISPR/Cas9对基因组进行靶向编辑，以及使用吗啉寡核苷酸（morpholinos）进行基因表达敲低。这些工具将有助于直接研究控制表型鱼类与洞穴栖息鱼类之间差异的基因基础。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

洞穴动物为研究多种复杂性状（包括眼睛退化、白化病、睡眠减少、多食行为以及感觉处理）的进化机制和遗传基础提供了极具吸引力的研究体系。来自世界各地的洞穴鱼类物种由于不同洞穴系统之间相似的环境压力，表现出形态和行为性状的趋同进化。目前已有多种洞穴物种在实验室条件下被研究。其中，墨西哥盲鳉（Astyanax mexicanus）具有视觉正常和盲眼两种形态，为揭示复杂性状进化的生物学与分子机制提供了独特视角，并正迅速发展成为一个新兴的模式系统。尽管已在 A. mexicanus 中鉴定出调控多种生物学过程进化的候选基因，但验证单个基因功能的能力仍受到限制。转基因技术和基因编辑技术的应用有望克服这一重大障碍，并深入探究复杂性状进化的潜在机制。本文介绍了一种在 A. mexicanus 中操控基因表达的不同方法。该方法包括使用吗啉代寡核苷酸（morpholinos）、Tol2 转基因技术以及基因编辑系统——这些技术在斑马鱼及其他鱼类模型中已被广泛应用，可用于调控 A. mexicanus 中的基因功能。这些实验方案包含对定时繁殖程序、受精卵收集、显微注射以及遗传修饰个体筛选的详细描述。这些方法学手段将有助于深入研究 A. mexicanus 中复杂性状进化的遗传与神经机制。 

引言

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自达尔文以来 物种起源1，科学家通过洞穴生物获得了关于性状如何在特定环境和生态压力下发生进化性改变的深刻见解2墨西哥 tetra， A. mexicanus，包括分布在墨西哥各地及美国南部德克萨斯州河流中的有眼祖先型“表层”种群，以及至少29个地理上相互隔离的衍生洞穴形态种群，后者栖息于阿布拉山脉及墨西哥东北部其他地区3已鉴定出多种与洞穴相关的性状 A. mexicanus包括耗氧量改变、脱色、眼睛退化以及摄食和觅食行为的改变4,5,6,7,8,9. A. mexicanus 由于具有明确的进化历史、对生态环境的详细表征以及独立进化的洞穴种群，该模型为研究趋同进化机制提供了一个强有力的体系10,11许多在洞穴鱼中存在的洞穴衍生性状，包括眼睛退化、睡眠减少、摄食增加、群游行为丧失、攻击性降低以及应激反应减弱，已通过独立起源多次演化形成，且不同洞穴种群间常利用不同的遗传通路实现这些性状的演化。8,12,13,14,15这一重复演化是其重要特征 A. mexicanus 系统，并有助于深入理解更普遍的问题，即如何通过扰动遗传系统以产生相似的表型。 

尽管遗传技术在多种鱼类物种（包括 A. mexicanus），斑马鱼领域的最新进展为鱼类遗传技术的开发奠定了基础16,17,18,19,20. 斑马鱼中广泛使用多种工具来操控基因表达，这些操作流程早已实现标准化。例如，在单细胞阶段注射吗啉代寡核苷酸（MOs）可选择性阻断RNA并抑制翻译，从而在发育的短暂时间窗口内实现基因功能的敲低21,22此外，基因编辑技术（如成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（Cas9）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN））能够通过基因组中的重组实现特定的缺失，或在某些情况下实现插入。19,20,23,24转基因技术用于以细胞类型特异性的方式操控基因的稳定表达或功能。 Tol2 系统通过共注射转座酶mRNA与转座子载体，可高效用于转基因动物的制备 Tol2 含有转基因的DNA质粒25,26。该 Tol2 系统利用了 Tol2 转座酶用于青鳉以产生转基因构建体的稳定生殖系插入。生成 Tol2 转基因技术涉及共注射一种质粒，该质粒包含两侧带有侧翼序列的外源基因 Tol2 整合位点和 mRNA Tol2 转座酶17该系统已被用于在斑马鱼中产生一系列转基因品系，近年来其应用已扩展到其他新兴的模式生物系统，包括慈鲷、鳉鱼、刺鱼，以及最近的墨西哥洞穴鱼。27,28,29,30. 

尽管洞穴鱼是阐明性状进化机制的一个引人入胜的生物系统，但其作为进化模型的全部潜力尚未得到充分开发。部分原因在于难以直接操控其遗传和细胞功能31。虽然已通过数量性状位点（QTL）研究鉴定出调控复杂性状的候选基因，但这些候选基因的验证仍存在困难32,33,34。近年来，已采用吗啉代寡核苷酸进行瞬时敲低、利用CRISPR和TALEN系统进行基因编辑，以及通过Tol2介导的转基因技术，来研究多种性状背后的遗传基础35,36,37,38。这些技术的实施与标准化将有助于深入探究生物性状的分子与神经机制，包括基因功能的操控、特定细胞群体的标记以及功能性报告基因的表达。尽管这些遗传工具在新兴模式系统中已成功用于操控基因或细胞功能，但在A. mexicanus中仍缺乏详细的实验方案。 

A. mexicanus 为研究生物在环境变化下的进化机制提供了重要见解，并为鉴定调控多种性状的新基因创造了机会。多种因素表明，A. mexicanus 是一个极为适用的模型，可用于应用目前在成熟遗传模型中已建立的基因组工具，这些优势包括易于在实验室中饲养、产卵量大、胚胎透明、基因组已测序以及具备明确的行为学检测方法39。本文描述了在A. mexicanus 的表型鱼和洞穴鱼种群中使用吗啉环寡核苷酸（morpholinos）、转基因技术和基因编辑技术的方法。这些工具在A. mexicanus 中的广泛应用，将有助于从机制层面深入探究洞穴鱼与表型鱼在发育、生理和行为差异背后的分子过程。 

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方案

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1. 形态寡核苷酸设计

注意：A. mexicanus 的序列可通过国家生物技术信息中心（NCBI）基因数据库和NCBI SRA（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）以及Ensembl基因组浏览器（https://www.ensembl.org）获取。在设计用于地表型和洞穴型个体的吗啉代寡核苷酸时，关键是在此阶段识别两种形态之间在基因序列上的任何差异，以避免将这些存在变异的区域作为吗啉代的靶标。吗啉代靶位点内的任何多态性变异都可能导致结合失效。该设计方法与其他鱼类系统（如斑马鱼）类似，此前已证明在 A. mexicanus21,36,40。 中可有效应用。

  1. 翻译阻断型吗啉代寡核苷酸的设计
    注意：翻译阻断型吗啉代寡核苷酸通过与内源性起始位点结合，利用空间位阻阻碍翻译机器与mRNA序列结合，从而阻断翻译过程。
    1. 确定目标基因的编码区，起始位置为ATG起始位点。
    2. 通过复制粘贴将目标序列的前25个碱基对记录到文本编辑器或实验记录本中。
    3. 使用在线软件（例如 http://reverse-complement.com）或手动转换，生成目标序列的反向互补序列。将所得的反向互补序列保存在文本编辑器或实验记录本中。
    4. 向生产吗啉代寡核苷酸的公司订购含有该反向互补序列的吗啉代寡核苷酸。参见材料表中的相关公司。
  2. 剪接阻断型吗啉代寡核苷酸的设计
    注意：剪接阻断型吗啉代寡核苷酸通过阻断RNA剪接过程，从而阻止成熟mRNA分子的形成。当起始位点不明确时，或希望利用聚合酶链式反应（PCR）验证基因敲低效果时，该方法可作为替代或更优策略。相较于ATG阻断型吗啉代寡核苷酸，剪接阻断型吗啉代寡核苷酸的优势在于可通过逆转录PCR（RT-PCR）检测外显子跳跃或内含子保留现象，并通过凝胶电泳观察到片段大小差异。应采用标准实验室流程进行RT-PCR和凝胶电泳，以评估吗啉代寡核苷酸的有效性。
    1. 确定目标基因的前体mRNA（pre-mRNA）序列。利用NCBI或Ensembl数据库中提供的 A. mexicanus 基因组信息，确定内含子与外显子的边界33。
    2. 选择外显子-内含子（剪接供体）或内含子-外显子边界（剪接受体）位点，以实现内含子保留或外显子排除。
      注意：剪接体通常识别内含子5'剪接位点处的“GU”序列（U1靶点）以及3'剪接位点处的“AG”序列（U2靶点）。在正常情况下，剪接体的U1和U2亚基会结合pre-mRNA序列上的这些靶点，以完成正确的剪接。然而，若这些靶序列之一被吗啉代寡核苷酸阻断，剪接体将转向下一个可用的U1或U2位点，导致内含子未被剪除或外显子缺失。具体设计需根据目标基因的结构进行规划和优化21。通常，阻断内部U1位点会使剪接转向下一个可用的U1位点，导致外显子被切除；而阻断首个或末尾的剪接连接位点则会导致内含子保留，因为无其他可替代的剪接位点。可使用序列分析软件预测不同剪接变异的影响，预测结果可提示是否可能发生移码突变或提前出现终止密码子，从而帮助识别更有效的mRNA干扰靶点。
    3. 确定目标位点后，将其序列记录在文本编辑器或实验记录本中。确保目标位点长度为25个碱基对（bp）。
    4. 使用在线软件（例如 http://reverse-complement.com）或手动转换，生成目标序列的反向互补序列，并将其序列记录在文本编辑器或实验记录本中。
    5. 向生产吗啉代寡核苷酸的公司订购含有该反向互补序列的吗啉代寡核苷酸。参见材料表中的示例公司。

2. 用于注射的吗啉代寡核苷酸（Morpholinos）

注意：需要进行多种浓度或体积的吗啉代寡核苷酸（MO）注射，以确定最佳注射浓度。典型的注射量为 400–800 pg 的 MO。吗啉代寡核苷酸敲低效应可在注射后持续长达 6 天。

  1. 获取储存用吗啉代寡核苷酸。储存用吗啉代寡核苷酸以冻干粉形式提供。使用前用无菌 H2O 溶解至所需储存浓度（例如 4 mM）。保存于 -20 °C，待用。

3. CRISPR gRNA 设计、体外转录及制备

  1. CRISPR gRNA 设计
    注意：gRNA 是根据 Varshney 等人此前发表的研究生成的。40 和 Wierson 等人41.
    1. 使用基因组浏览器确定目标基因的编码区。根据基因组序列，通过搜索以GG开头并后接PAM序列（NGG）的20 bp核苷酸靶序列，在外显子内确定gRNA靶向序列。将靶向基因起始密码子（ATG）之后的区域。
      注意：如果在目标基因的指定外显子中无法找到5'端带有GG的靶序列，则可使用一个或两个G’s 可以替换序列 5' 端的前两个核苷酸。然而，这两个 G’寡核苷酸中必须包含这些序列，因为T7转录需要它们。
    2. 设计并订购一条基因特异性的寡核苷酸（寡核苷酸A：5'-TAATACGACTCACTATAGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3'）。在T7启动子序列（红色）与用于与第二条寡核苷酸（蓝色）退火的重叠序列之间插入基因特异性的20 bp gRNA靶序列（加粗），不包含PAM序列。将该寡核苷酸A与第二条寡核苷酸（寡核苷酸B：5'- GATCCGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTT AACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC-3'）退火并扩增（见步骤3.2.1），以生成用于转录的gRNA模板。
      注意：Oligo B 在每个反应中均相同，只需订购一次。
  2. gRNA 准备与转录
    1. 退火并扩增寡核苷酸。为提高产量，加入以下引物以扩增gRNA：5'-TAATACGACTCACTATA-3'（T7引物）和5'-GATCCGCACCGACTCGGTG-3'（gRNA 3'引物）。进行PCR反应，使用 Thermococcus kodakaraensis (KOD) 聚合酶
      注意：对于寡核苷酸A和寡核苷酸B中的两对引物，建议进行10个循环以获得良好的产量。详细实验方案见Wierson等人的研究。41.
    2. 使用市售的体外转录试剂盒对gRNA进行转录（参见 材料表）。这是通过对制造商的修改来实现的’Klaassen 等人发表的实验方案42.
    3. 沉淀、洗涤并重悬gRNA，具体步骤参照Klaassen等人的描述。42.
      注意：gRNA 必须用无 RNase 水重悬，以防止降解。
    4. 记录gRNA浓度，可使用分光光度计测定。取2 µL RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，以评估RNA质量。将RNA分装以避免冻融，并于-80 ℃保存。 °注射前应立即置于 C 条件下。
  3. Cas9 蛋白的制备与转录
    1. Cas9 mRNA 可使用市售的体外转录试剂盒进行转录（参见 材料表如前所述43使用 nls-Cas9-nls 版本43.
    2. 记录gRNA的浓度，并取2 µL在琼脂糖凝胶上电泳以评估其质量。将RNA分装保存，避免因多次冻融循环导致降解，并将分装样品储存在-80 °C.

4. Tol2 载体构建、Tol2 转座酶制备及转基因操作

  1. 制备用于注射的 Tol2 转基因载体。
    注意：我们已成功使用已发表/可获得的斑马鱼和青鳉鱼的载体构建 A. mexicanus这些构建体在功能上是完全正常的 A. mexicanus，这很可能是因为序列同源性较高（可参考 AddGene 共享库和斑马鱼信息网络 [ZFIN] 数据库中已有的载体信息）。当在斑马鱼中使用这些斑马鱼启动子片段时，外源基因在预期的组织中得到了表达 A. mexicanus
    1. 获取 Tol2 载体或构建含有组织特异性启动子、目的转基因片段和 Tol2 末端序列的质粒（参见 Kwan 等人）。44收到后，对质粒构建体进行测序以验证其序列。
    2. 按照制造商说明对构建体进行中量提质粒’s 指南操作。用无 RNase 的 H 洗脱最终质粒2O，使用分光光度计测定浓度，将浓度稀释至100–300 ng/μL，并分装后于 -20 保存 °C.
  2. 消化 Tol2 转座酶质粒，并合成 mRNA。
    1. 获取 Tol2 转座酶质粒（pCS-zT2TP）的拷贝，作为合成 Tol2 mRNA 的模板45.
    2. 根据制造商说明，对 pCS-zT2TP 质粒进行中量提取’s 指南操作。用少量无 RNase 水或缓冲液（约 50 μL）洗脱。将分装样品于 -20 °C.
    3. 使用限制性内切酶消化 Tol2 质粒。
      1. 对10 µg环状pCS-zT2TP质粒进行限制性酶切消化 表1.
      2. 将反应分成2份–50 μL 反应体系，37℃ 过夜孵育 °在热循环仪中进行 C 步骤。
      3. 第二天，通过加热至65℃使酶失活 °20 分钟，C
      4. 消化后立即使用市售的PCR纯化试剂盒纯化线性化质粒（参见 材料表按照制造商说明’ 指南。用 15 μL 无 RNase 的 H 洗脱质粒2使用分光光度计测定产物的浓度。
      5. 在1.5%琼脂糖凝胶上分别点样1 μL酶切质粒和1 μL未酶切质粒，以确认质粒是否线性化。
    4. 体外转录 Tol2 mRNA。
      1. 使用1 µg线性化的pCS-zT2TP质粒作为转录模板。按照生产商’体外转录实验操作指南（参见 材料表如所述 表2.
      2. 37℃孵育 °按照制造商说明在热循环仪中进行，温度为 C’s 指南。
      3. 加入1 µL DNase，在37℃孵育 °按照制造商说明在热循环仪中进行，温度为 C’s 指南。
      4. 按照转录试剂盒说明书进行氯化锂沉淀。将RNA沉淀重悬于约20 μL中–30 μL 无RNase的H2O.
      5. 使用分光光度计测定产物浓度，并记录RNA质量。
      6. 将产物稀释至约100–300 ng/µL，并分装为5份–10 μL 样品以避免反复冻融。将它们储存在 -80 °C，直至使用。
        注意：可以检查 1–2 µL 纯化的 Tol2 mRNA 用于凝胶电泳检测，呈现弥散条带/清晰条带。

5. 显微注射

  1. 注射用通用工具的准备
    注意：本节中的实验步骤已在 Kowalko 等人的研究中进行了详细描述。46，此处介绍经过少量修改的概述。
    1. 通过将溶于鱼系统水中的温热3%琼脂糖倒入100 mL培养皿中制备注射板。将一枚卵注射模具小心地放入 freshly poured 琼脂糖中，以形成鱼卵的加样孔。将模具的一侧以45°角置于琼脂中° 角度缓慢放入琼脂糖中；以倾斜角度缓慢放下模具可避免模具下方困住气泡。待琼脂糖凝固后，轻轻取出模具。平板可密封后于4℃保存。 °最多可于 C 保存 1 周。
    2. 根据制造商说明，使用电极/针头拉制仪从硼硅酸盐玻璃毛细管中拉制用于注射的针头’s 指南。该方案会因移液器拉制仪的不同而有所差异；然而，可在 表3.
      注意：优化注射针至关重要，因为针头过长会导致弯曲，而无法干净利落地刺入卵细胞。
    3. 通过折断标准玻璃移液管制备大口径玻璃移液管用于卵的转移，使其开口足够大以容纳卵。使用本生灯将移液管断裂端暴露于火焰中加热，直至边缘光滑，完成断口抛光。
  2. 繁殖装置
    注意：用于繁殖的方案有多种不同方法 A. mexicanus详细方案请参见 Borowsky39在注射前1周开始准备繁殖装置。
    1. 第1天，将2至3条雌鱼和3至4条雄鱼放入一个10加仑的水族箱中，水温维持在24 ± 1 ℃ °C.
    2. 第1天–7. 增加喂食频率至每天约3次。确保饮食中包含活体食物，例如黑虫和卤虫。
    3. 第6天，加入一个设定为27℃的单个水族箱加热器 °C. 实验室水族箱的温度可能有所不同；因此，这将是升高2–3 °相对于正常水箱温度。
    4. 第7天晚上，即傍晚（时间诱导因子 [ZT] 9）–11）在注射当晚，用浸湿的海绵彻底清洁水箱，并使用细网捞或虹吸管清除多余的饲料或碎屑。
    5. 在第7天晚上，从ZT15开始检查鱼卵表面，之后每15分钟检查一次–30 分钟至 ZT18。对于洞穴鱼，从 ZT17 开始检查卵，并每隔 15 分钟继续检查一次–30 分钟，直到 ZT20。
      注意：时间基于14小时光照：10小时黑暗的昼夜循环，使用时间诱导剂时间（zeitgeber time）。繁殖时间仅为估计值，各实验室需确定确切时间。为在单细胞阶段进行显微注射，必须在卵子释放/受精后尽快收集卵子。
  3. 单细胞阶段卵子的收集
    1. 预期交配的夜晚，每隔15分钟检查一次养殖缸–30 分钟后观察鱼缸底部是否有卵。卵呈半透明状，直径约为 1 mm。
    2. 使用细网孔的渔网收集卵子，并将其转移至盛有新鲜鱼系统水的玻璃碗中。在显微镜下观察卵子，确认其处于单细胞阶段。
    3. 使用玻璃移液管将单细胞期卵子转移至显微注射板中。此步骤必须使用玻璃移液管，因为卵子会黏附于塑料材质表面。
    4. 使用移液器小心地将卵释放到第5.1节所述的琼脂糖注射板的孔中。将预热（室温）的注射板各孔尽可能装满卵（最多30个）–每行40枚，最多可排列五行）。完整的行排列有助于防止注射过程中卵子移动。在注射板上用少量鱼类系统水保持卵子湿润，直至进行注射操作。
  4. 皮升注射装置设置及常规注射优化指南
    1. 使用适合毛细管内部的凝胶上样吸头或标准微量移液器吸头，加入2 μL样品，回填注射针–将4 µL样品推注至末端。针头充满后，用镊子剪去注射针多余的长度。
    2. 使用安装在显微操作仪上并连接至皮升级微注射仪的针头进行显微注射。
    3. 将注射时间设置为 0.03 秒，压力输出设置为约 0.0 psi。由于不同针头之间存在微小差异，注射压力会相应变化，因此需优化参数以实现约 1.0 nL 的注射剂量。
      注意：注射压力通常在约10的范围内–30 psi
    4. 通过将注射团注注入矿物油中，并使用载物台测微尺测量团注大小，以获得约1 μL的标准化团注体积–1.5 nL 注射体积。调节注射压力（psi）以增加或减少团注体积。
    5. 使用实验室纸巾从卵的最上层吸去水分。
      注意： Astyanax 卵壳比斑马鱼卵稍难穿透。我们发现，吸去卵上方的水分有助于针头刺入卵内。通过优化培养板，单个培养板上可容纳约200枚卵。
    6. 使用显微操作仪将针头刺入每个卵子，并直接注入卵黄。当针头定位至卵黄后，按下注射按钮或脚踏注射开关以完成注射。
      ​注意：一个完整的培养板可在约15分钟内完成注射。单细胞阶段持续约40分钟。
  5. 吗啡啉寡核苷酸注射
    注意：针对不同基因靶点，实现基因敲低且不引起毒性的吗啉寡聚体用量需进行优化；然而，400 pg 的浓度是一个合适的起始点。
    1. 准备吗啉代寡核苷酸，使每个卵子注射400 pg的吗啉代。在冰上解冻吗啉代。注射液包含所需浓度的吗啉代和无RN酶的H2O或Danieau’s 溶液，以及酚红（终体积的10%）。示例见 表4.
    2. 每枚胚胎注射 1 nL。
  6. CRISPR 注射
    1. 准备RNA，使每枚胚胎注射25 pg gRNA和总计300 pg Cas9 mRNA。有关示例性的CRISPR/Cas9注射混合物，请参见 表5.
    2. 每枚胚胎直接注射 2 nL 的 gRNA/Cas9 mRNA。
  7. 注射Tol2转座酶和Tol2侧翼质粒以实现转基因
    1. 在冰上解冻转座酶mRNA和Tol2质粒。将Cas9 mRNA（25 ng/µL）、所需的Tol2载体（25 ng/µL）混合μL）和酚红（≤10% 最终体积）加入无 RNase 水中。有关 Tol2 转基因注射混合物的样本，参见 表6.
    2. 将注射液和针头置于冰上，以防止mRNA降解。每个胚胎注射体积为1 nL。

6. 培养和筛选显微注射后的鱼类

  1. 注射鱼类的饲养管理
    1. 注射完成后，立即将卵转移至装有约 200 mL 鱼房系统水的玻璃培养皿（10 × 5 cm）中。可通过将注射用培养板浸入盛有鱼房系统水的培养皿中，并用移液器冲洗卵，以轻松清洗卵。
    2. 放置约50–每碗注射80个胚胎，并在22℃下培养–24 °C.
    3. 每天用注入鱼的水碗清洁两次，以清除死亡的胚胎，并每天更换约20%的水。
    4. 额外的饲养操作按照先前已发表的方案进行39.
  2. 筛选注射吗啉寡核苷酸的个体
    1. 在体视显微镜下观察动物以筛选表型。吗啉代的作用效果可持续至注射后约5天21.
    2. 在注射后第4天测量行为表型。
  3. CRISPR 插入缺失突变筛选
    1. 设计引物以扩增靶位点周围的基因组DNA。引物设计应使目标PCR产物长度约为100–125 bp
      注意：例如，对于 oca2 基因座，使用上游引物 5'-CTCCTCTGTCAGGCTGTGC-3' 和下游引物 5'-GAAGGGGATGTTGTCTATGAGC-3' 扩增 gRNA 靶位点周围的区域，获得长度为 105 bp 的 PCR 产物。
    2. 根据机构动物实验方案处死胚胎或剪取成年鱼的鳍组织。
    3. 将胚胎或解剖得到的鳍收集到PCR管中，提取DNA并进行PCR扩增。针对基因特异性引物的PCR实验方案可参见Ma et al.。35.
    4. 为评估突变情况，取5 µL PCR产物在3%琼脂糖凝胶中以70 V电压电泳3小时。野生型（未突变）DNA的PCR产物将呈现清晰的条带，而突变型DNA则在凝胶上呈现弥散条带。
    5. 为了确定突变等位基因的序列，按照制造商说明对PCR产物进行TA克隆’按照说明挑选菌落，进行小量培养并提取质粒。将所得DNA送测序。
    6. 为建立并维持携带突变等位基因的鱼类品系，将成年显微注射后的鱼与野生型鱼杂交，并对子代进行5轮筛选–10个胚胎，以确定后代中是否有携带该基因突变等位基因的个体，具体步骤参见6.3.1–6.3.6。
      注意：不同的 F1 同一F的个体0 奠基鱼可能携带不同的突变。应确保对突变品系进行测序，以获得预测会导致移码的等位基因的突变。
    7. 通过PCR使用条带弥散检测法（步骤6.3.1–6.3.6）或设计等位基因特异性PCR引物以扩增突变型和野生型条带，来鉴定携带突变等位基因的鱼类。图 2C).
    8. 建立鱼系后，将突变等位基因纯合化以检测隐性表型。
  4. 筛选转基因阳性个体
    注意：建议使用含有荧光标记的构建体，以简化对转基因阳性个体的筛选。然而，也可采用标准的PCR筛选方法来检测遗传传递。
    1. 在 F 中可视化组织特异性荧光蛋白0 注射后2天即可通过落射荧光解剖显微镜观察鱼类。
      注意：F 中的表达0 幼虫呈嵌合体，阳性个体可能表现出一系列的表达表型。
    2. 将阳性个体保留为 F0 奠基者鱼类
    3. 当 F0当鱼成熟后，将回交奠基鱼与来自同一群体/实验室品系的非转基因个体进行回交。筛选F1 使用与第6.2步所述相同的方案繁殖后代。
      注意：F 中的表达1 幼虫分布均匀，可确保F组间的一致性1 兄弟姐妹
    4. 由于Tol2整合不具有位点特异性，且不同创始个体间的整合情况可能存在差异，因此需选择F1 由单个F衍生的兄弟姐妹0 创始人并交配表达阳性的F1 兄弟姐妹交配以产生 F2该后代将作为稳定品系的基础。

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结果

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多个洞穴栖居的A. mexicanus种群相较于其地表栖居的同种个体表现出睡眠减少以及清醒/活动时间增加14。下丘脑分泌素/食欲素（Hypocretin/orexin, HCRT）是一种高度保守的神经肽，具有促进觉醒的作用，而HCRT通路的异常会导致人类及其他哺乳动物发生嗜睡症47,48。我们先前已证实，洞穴型A. mexicanus中HCRT肽的表达量升高，提示该肽表达水平的增加可能是洞穴鱼睡眠减少现象的潜在机制38。通过吗啉代寡核苷酸（MO）敲低hcrt基因的表达，可为直接检验hcrt表达增加在介导洞穴鱼睡眠减少中的作用提供有力手段。

为了研究hcrt表达与睡眠之间的关系，我们设计了一种翻译阻断型吗啉代寡核苷酸（morpholino）。该MO靶向第一外显子的前25个碱基对，包含A...

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讨论

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本文提供了一种利用吗啉环寡核苷酸（morpholinos）、CRISPR/Cas9 基因编辑和转基因技术来调控基因功能的方法。A. mexicanus 中遗传技术的不断丰富以及这些系统在斑马鱼中的优化，有望使这些工具轻松应用于该物种52。尽管已有研究在 A. mexicanus 中采用了这些方法，但其在该体系多种形态学、发育及行为性状研究中的应用仍显不足30,36,42,53。 

吗啉寡核苷酸（Morpholinos）已广泛应用于斑马鱼研究中以敲低基因表达。该方法操作简便，且能有效实现基因表达的显著下调。然而，已有大量文献报道其存在脱靶效应22,

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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作者感谢 Sunishka Thakur 在基因分型以及对图2中所示的oca2突变型鱼进行成像方面提供的帮助。本研究由美国国家科学基金会（NSF）资助，项目编号1656574（授予 A.C.K.），NSF 项目编号1754321（授予 J.K. 和 A.C.K.），以及美国国立卫生研究院（NIH）项目编号 R21NS105071（授予 A.C.K. 和 E.R.D.）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
鱼类繁殖 &和卵供应
细孔鱼网Penn PlaxBN4
鱼缸加热器Aqueon100106108
卵捕获装置定制制作NA设计并制作塑料格栅，放置于水箱底部以保护鱼卵
玻璃移液管Fisher Scientific13-678-20C
移液管吸头Fisher Scientific03-448-21
琼脂糖Fisher ScientificBP160-500
卵模具适应性科学工具TU-1
吗啉寡核苷酸供应
对照吗啉代寡核苷酸Gene Tools, LLC标准对照油
定制吗啉代寡核苷酸Gene Tools, LLCNA
酚红Sigma AldrichP0290-100ML
CRISPR试剂
Cas9 质粒AddGene46757
GoTaq DNA 聚合酶PromegaM3001
KOD Hot Start TaqEMD Millipore71-842-3
引物Integrated DNA Technologies定制
T7 Megascript 试剂盒Ambion/ThermofisherAM1333
miRNeasy试剂盒Qiagen217004
mMessage mMachine T3 试剂盒Ambion/ThermofisherAM1348
MinElute 试剂盒Qiagen28204
Tol2 转基因技术
pCS-zT2TP 质粒Kawakami 等，2004资深作者请求
CutSmart Buffer新英格兰生物实验室B7204
NotI-HF 限制性内切酶New England BiolabsR3189
PCR纯化试剂盒Qiagen28104
SP6 mMessenger 试剂盒Ambion/ThermofisherAM1340
显微注射试剂与器材
玻璃毛细管Sutter InstrumentsBF100-58-10
移液管拉制仪Sutter InstrumentsP-97
皮下注射仪Warner InstrumentsPLI-100A
显微操作仪世界精密仪器公司M3301R
显微操作仪支架World Precision InstrumentsM10
显微操作仪基座世界精密仪器公司钢制底板，10磅

参考文献

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CRISPR Tol2 DNA

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