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墨西哥洞穴鱼基因功能的操作

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DOI：

10.3791/59093

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2019年4月22日

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1Department of Biological Sciences, Florida Atlantic University, 2Jupiter Life Science Initiative, Florida Atlantic University, 3Harriet L. Wilkes Honors College, Florida Atlantic University

本文内容

摘要

我们介绍了在进化模型系统 Astyanax mexicanus 中进行基因操作的方法。文中描述了三种不同的技术：基于Tol2的转基因技术、利用CRISPR/Cas9对基因组进行靶向编辑，以及使用吗啉寡核苷酸（morpholinos）进行基因表达敲低。这些工具将有助于直接研究控制表型鱼类与洞穴栖息鱼类之间差异的基因基础。

摘要

洞穴动物为研究多种复杂性状（包括眼睛退化、白化病、睡眠减少、多食行为以及感觉处理）的进化机制和遗传基础提供了极具吸引力的研究体系。来自世界各地的洞穴鱼类物种由于不同洞穴系统之间相似的环境压力，表现出形态和行为性状的趋同进化。目前已有多种洞穴物种在实验室条件下被研究。其中，墨西哥盲鳉（Astyanax mexicanus）具有视觉正常和盲眼两种形态，为揭示复杂性状进化的生物学与分子机制提供了独特视角，并正迅速发展成为一个新兴的模式系统。尽管已在 A. mexicanus 中鉴定出调控多种生物学过程进化的候选基因，但验证单个基因功能的能力仍受到限制。转基因技术和基因编辑技术的应用有望克服这一重大障碍，并深入探究复杂性状进化的潜在机制。本文介绍了一种在 A. mexicanus 中操控基因表达的不同方法。该方法包括使用吗啉代寡核苷酸（morpholinos）、Tol2 转基因技术以及基因编辑系统——这些技术在斑马鱼及其他鱼类模型中已被广泛应用，可用于调控 A. mexicanus 中的基因功能。这些实验方案包含对定时繁殖程序、受精卵收集、显微注射以及遗传修饰个体筛选的详细描述。这些方法学手段将有助于深入研究 A. mexicanus 中复杂性状进化的遗传与神经机制。 

引言

自达尔文以来 物种起源1，科学家通过洞穴生物获得了关于性状如何在特定环境和生态压力下发生进化性改变的深刻见解2墨西哥 tetra， A. mexicanus，包括分布在墨西哥各地及美国南部德克萨斯州河流中的有眼祖先型“表层”种群，以及至少29个地理上相互隔离的衍生洞穴形态种群，后者栖息于阿布拉山脉及墨西哥东北部其他地区3已鉴定出多种与洞穴相关的性状 A. mexicanus包括耗氧量改变、脱色、眼睛退化以及摄食和觅食行为的改变4,5,6,7,8,9. A. mexicanus 由于具有明确的进化历史、对生态环境的详细表征以及独立进化的洞穴种群，该模型为研究趋同进化机制提供了一个强有力的体系10,11许多在洞穴鱼中....

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方案

1. 形态寡核苷酸设计

注意：A. mexicanus 的序列可通过国家生物技术信息中心（NCBI）基因数据库和NCBI SRA（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）以及Ensembl基因组浏览器（https://www.ensembl.org）获取。在设计用于地表型和洞穴型个体的吗啉代寡核苷酸时，关键是在此阶段识别两种形态之间在基因序列上的任何差异，以避免将这些存在变异的区域作为吗啉代的靶标。吗啉代靶位点内的任何多态性变异都可能导致结合失效。该设计方法与其他鱼类系统（如斑马鱼）类似，此前已证明在 A. mexicanus21,36,40。 中可有效应用。

  1. 翻译阻断型吗啉代寡核苷酸的设计
    注意：翻译阻断型吗啉代寡核苷酸通过与内源性起始位点结合，利用空间位阻阻碍翻译机器与mRNA序列结合，从而阻断翻译过程。
    1. 确定目标基因的编码区，起始位置为ATG起始位点。
    2. 通过复制粘贴将目标序列的前25个碱基对记录到文本编辑器或实验记录本中。
    3. 使用在线软件（例如 http://reverse-co....

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结果

多个洞穴栖居的A. mexicanus种群相较于其地表栖居的同种个体表现出睡眠减少以及清醒/活动时间增加14。下丘脑分泌素/食欲素（Hypocretin/orexin, HCRT）是一种高度保守的神经肽，具有促进觉醒的作用，而HCRT通路的异常会导致人类及其他哺乳动物发生嗜睡症47,48。我们先前已证实，洞穴型A. mexicanus中HCRT肽的表达量升高，提示该肽表达水平的增加可能是洞穴鱼睡眠减少现象的潜在机制38。通过吗啉代寡核苷酸（MO）敲低hcrt基因的表达，可为直接检验hcrt表达增加在介导洞穴鱼睡眠减少中的作用提供有力手段。

为了研究hcrt表达与睡眠之间的关系，我们设计了一种翻译阻断型吗啉代寡核苷酸（morpholino）。该MO靶向第一外显子的前25个碱基对，包含A.......

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讨论

本文提供了一种利用吗啉环寡核苷酸（morpholinos）、CRISPR/Cas9 基因编辑和转基因技术来调控基因功能的方法。A. mexicanus 中遗传技术的不断丰富以及这些系统在斑马鱼中的优化，有望使这些工具轻松应用于该物种52。尽管已有研究在 A. mexicanus 中采用了这些方法，但其在该体系多种形态学、发育及行为性状研究中的应用仍显不足30,36,42,53。 

吗啉寡核苷酸（Morpholinos）已广泛应用于斑马鱼研究中以敲低基因表达。该方法操作简便，且能有效实现基因表达的显著下调。然而，已有大量文献报道其存在脱靶效应22,

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 Sunishka Thakur 在基因分型以及对图2中所示的oca2突变型鱼进行成像方面提供的帮助。本研究由美国国家科学基金会（NSF）资助，项目编号1656574（授予 A.C.K.），NSF 项目编号1754321（授予 J.K. 和 A.C.K.），以及美国国立卫生研究院（NIH）项目编号 R21NS105071（授予 A.C.K. 和 E.R.D.）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
鱼类繁殖 &和卵供应
细孔鱼网Penn PlaxBN4
鱼缸加热器Aqueon100106108
卵捕获装置定制制作NA设计并制作塑料格栅，放置于水箱底部以保护鱼卵
玻璃移液管Fisher Scientific13-678-20C
移液管吸头Fisher Scientific03-448-21
琼脂糖Fisher ScientificBP160-500
卵模具适应性科学工具TU-1
吗啉寡核苷酸供应
对照吗啉代寡核苷酸Gene Tools, LLC标准对照油
定制吗啉代寡核苷酸Gene Tools, LLCNA
酚红Sigma AldrichP0290-100ML
CRISPR试剂
Cas9 质粒AddGene46757
GoTaq DNA 聚合酶PromegaM3001
KOD Hot Start TaqEMD Millipore71-842-3
引物Integrated DNA Technologies定制
T7 Megascript 试剂盒Ambion/ThermofisherAM1333
miRNeasy试剂盒Qiagen217004
mMessage mMachine T3 试剂盒Ambion/ThermofisherAM1348
MinElute 试剂盒Qiagen28204
Tol2 转基因技术
pCS-zT2TP 质粒Kawakami 等，2004资深作者请求
CutSmart Buffer新英格兰生物实验室B7204
NotI-HF 限制性内切酶New England BiolabsR3189
PCR纯化试剂盒Qiagen28104
SP6 mMessenger 试剂盒Ambion/ThermofisherAM1340
显微注射试剂与器材
玻璃毛细管Sutter InstrumentsBF100-58-10
移液管拉制仪Sutter InstrumentsP-97
皮下注射仪Warner InstrumentsPLI-100A
显微操作仪世界精密仪器公司M3301R
显微操作仪支架World Precision InstrumentsM10
显微操作仪基座世界精密仪器公司钢制底板，10磅

参考文献

  1. Darwin, C. On the Origin of Species by Means of Natural Selection. , D. Appleton and Company. (1859).
  2. Culver, D. C., Pipan, T. The Biology of Caves and Other Subterranean Habitats. , Oxford University Press. New York, NY. (2009).
  3. Mitchell, R. W., Russell, W. H., Elliott, W. R.

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标签

CRISPR Tol2 DNA

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