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方法文章

人骨髓间充质干细胞对含法尔卡林二醇的新型脂质包被纳米颗粒的摄取

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DOI：

10.3791/59094

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2019年2月9日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Biotechnology and Environmental Technology, University of Southern Denmark, 2Center for Single Particle Science and Engineering (SPSE), Institute for Molecular Medicine, Health Sciences, University of Southern Denmark, 3Department of Mechanical Engineering and Material Science, Duke University, 4School of Pharmacy, University of Nottingham

本文内容

摘要

本文描述了将法卡林二醇包载于脂质包被的74 nm纳米颗粒中的方法。通过荧光和共聚焦成像技术，监测人干细胞对纳米颗粒 摄取并进入脂滴的过程。纳米颗粒采用溶剂位移快速注入法制备，并通过动态光散射技术测定其粒径。

摘要

纳米颗粒在癌症治疗的药物递送系统中受到越来越多的关注。脂质包被的纳米颗粒在结构和尺寸上受到低密度脂蛋白（LDLs）的启发，因为癌细胞增殖需要更多的胆固醇，这一特性已被用作将抗癌药物递送至癌细胞的机制。此外，根据药物的化学性质，将药物包封可能有助于避免其在体内循环过程中发生降解。因此，在本 研究中，采用该设计制备了抗癌药物法尔卡林二醇（falcarindiol）的脂质包被纳米颗粒，旨在为法尔卡林二醇提供一种潜在的新型递送系统，以稳定其化学结构、防止降解，并提高肿瘤对其的摄取效率。所设计的法尔卡林二醇纳米颗粒具有由磷脂和胆固醇单层包裹纯化药物核心的结构。该脂质单层包被由1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC）、胆固醇（Chol）和1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-2000]（DSPE PEG 2000）组成，并包含荧光标记DiI（摩尔比为43:50:5:2）。纳米颗粒采用快速注射法制备，该方法是一种通过良溶剂与不良溶剂交换快速沉淀纳米颗粒的简便技术，具体操作为将含有纳米颗粒组分的乙醇溶液迅速注入水相中。利用动态光散射（DLS）测得荧光纳米颗粒的粒径为74.1 ± 6.7 nm。在人源间充质干细胞（hMSCs）中检测了纳米颗粒的摄取情况，并通过荧光显微镜和共聚焦显微镜进行成像观察。结果显示hMSCs能够摄取这些纳米颗粒，表明该稳定的药物递送系统在法尔卡林二醇递送方面具有潜在应用价值。

引言

脂质包被的纳米颗粒作为癌症治疗中药物递送系统的功能正受到越来越多的关注1癌症具有改变的脂质代谢重编程2 胆固醇需求增加以促进增殖3它们过表达LDLs1 并且比正常细胞吸收更多的低密度脂蛋白（LDL），以至于癌症患者的LDL计数甚至可能下降4低密度脂蛋白摄取促进侵袭性表型5 导致乳腺癌的增殖和侵袭6大量低密度脂蛋白受体（LDLRs）是转移潜能的预后指标7受低密度脂蛋白（LDL）及其被癌细胞摄取的启发，一种新策略被提出： 让药物看起来像癌细胞的食物8因此，这些新型纳米粒子药物递送设计8,9,10 受到天然低密度脂蛋白（LDL）核心结构及脂质稳定化设计的启发11 作为一种将抗癌药物递送至癌细胞的机制。这种被动靶向递送系统特别适用于包封疏水性药物，这类药物通常以口服剂型给药，但仅有少量药物进入血液，从而限制了其预期疗效12与隐形脂质体相同13聚乙二醇（PEG）涂层有助于降低免疫反应，并延长其在血液中的循环时间，从而通过假定的增强渗透与滞留（EPR）效应实现对肿瘤的最佳摄取14,15然而，除了在某些情况下存在循环中的不稳定性以及系统内不良分布外16一些障碍仍未解决，例如这类纳米颗粒被细胞摄取的方式和程度如何，以及它们在细胞内的命运是什么。本文利用共聚焦和落射荧光成像技术，研究了一种特定疏水性抗癌药物法卡里二醇的纳米颗粒摄取过程。

本研究旨在制备包覆脂质的法尔卡林二醇纳米颗粒，并研究其在人源间充质干细胞（hMSCs）中的细胞内摄取情况。 通过该方法，有望稳定药物给药过程，克服递送过程中的相关挑战，并提高其生物利用度，从而评估一种针对该抗癌药物的新型递送系统。此前，法尔卡林二醇以高浓度纯品作为膳食补充剂经口服途径给药17。然而，该药物的递送仍需更为系统化的方法。因此，本研究设计了以磷脂和胆固醇构成单层包封膜、纯化的药物作为颗粒核心的法尔卡林二醇纳米颗粒。本研究采用Needham 等8近期开发的溶剂转移快速注射法，对多炔类化合物法尔卡林二醇进行包封。

该方法此前已用于制备脂质纳米颗粒，以包载诊断成像剂18,19以及测试分子（三油酸甘油酯）27 以及药物（奥利司他、尼可刹米硬脂酸盐）8,27,28这是一种在使用合适分子时相对简单的技术。该技术可使溶解于极性溶剂中的高度不溶性疏水溶质形成纳米级颗粒，其尺寸接近临界成核尺寸（约20 nm直径）。溶剂交换是 通过将有机溶液快速注入过量的抗溶剂中实现（通常为有机相与水相体积比1:9的水相）20,21.

纳米颗粒的组成设计带来了多种优势。DSPC:Chol组分形成一层致密、几乎不透的生物相容性且可生物降解的单分子层。PEG提供了一种空间位阻稳定的界面，可屏蔽免疫系统对颗粒的调理作用，减缓网状内皮系统（肝脏和脾脏）对颗粒的摄取，同时保护其免受单核吞噬细胞系统的攻击，防止免疫系统对颗粒的滞留和降解，从而延长其在血液中的循环半衰期22。这使得颗粒能够在体内循环，直至在血管通透性较高的病变部位（如肿瘤）发生渗出，利用EPR效应实现颗粒的被动富集。此外，脂质包膜 可通过动力学捕获核心在其临界成核尺寸，从而更精确地控制纳米颗粒的尺寸27,28。脂质层可赋予颗粒多种表面特性（包括肽靶向功能，尽管本项目尚未应用该功能）、纯药物核心以及较低的多分散性22,27,28。用于颗粒尺寸分析的方法是动态光散射（DLS），该技术可同时测量大量颗粒的尺寸。然而，若纳米颗粒并非单分散体系，则该方法可能使测量结果偏向较大的尺寸23。这一问题也已在脂质包膜的研究中得到评估。有关这些基本设计原理及各项特性的定量分析的更多细节，可参见其他已发表文献27,28。

纳米颗粒中包封的药物为法尔卡林二醇（falcarindiol），这是一种存在于伞形科（Apiaceae）植物中的膳食多炔类化合物，属于脂肪族C17聚乙炔类化合物已被发现具有促进健康的功效，包括抗炎活性、抗菌作用以及对多种癌细胞系的细胞毒性。其高反应性与其和不同生物分子相互作用的能力相关，可作为对巯基和氨基具有高度反应性的烷基化试剂。24. 芹菜脑已被证实可减少结肠中肿瘤病变的数量17,25，尽管其生物学机制尚不明确。然而，据认为它可与NF-κB、COX1、COX-2和细胞因子等生物分子相互作用，抑制其介导的肿瘤进展和细胞增殖过程，从而导致细胞周期阻滞、内质网（ER）应激以及细胞凋亡17,26 在癌细胞中。本研究以法卡林二醇作为抗癌药物的示例，因其 目前正研究其抗癌潜力及作用机制，因其表现出良好的抗癌效果。通过表皮荧光显微镜和共聚焦显微镜检测纳米颗粒在hMSCs中的细胞摄取并进行成像。选择该细胞类型的原因在于其体积较大，适合显微观察。

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方案

1. 通过快速溶剂转移技术合成纳米颗粒

  1. 为纳米颗粒的制备设置以下设备：块状加热器/样品浓缩仪、干燥器、配备1 mL玻璃注射器的数字移液系统、12 mL玻璃小瓶、磁力搅拌器、置于玻璃小瓶内的磁力搅拌子（15 mm × 4.5 mm，圆柱形，聚四氟乙烯[PTFE]涂层）以及旋转蒸发仪。
  2. 在闪烁瓶中加入2.4 mL溶于70%乙醇水溶液的250 µM法尔卡林二醇储备液。
  3. 使用样品浓缩仪将液体部分蒸发约4小时，以获得干燥的法尔卡林二醇。
    1. 将闪烁瓶插入块状加热器中；样品浓缩仪通过不锈钢针向样品输送气体，从而浓缩样品。在室温下蒸发，切勿使用加热。
  4. 干燥后，向上述闪烁瓶中加入脂质包衣的以下组分：31.64 mM DSPC 氯仿储备液 16.3 µL、17.82 mM DSPE-PEG2000 氯仿储备液 3.4 µL、25 mM 胆固醇氯仿储备液 24 µL，以及 4 mM DiI 氯仿储备液 6 µL。 每次添加组分后，用氯仿清洗注射器，以避免交叉污染。 
    警告：立即盖紧含有脂质的离心管，防止溶剂蒸发从而改变浓度。操作应在通风橱中进行。
    注意：氯仿储备液的浓度可能因化学品供应商或实验室中的稀释操作而有所不同。
  5. 用铝箔包裹小瓶，以避光保护DiI。 将样品在干燥器中放置过夜，以蒸发氯仿。
  6. 将干燥的样品溶于无水乙醇中，定容至终体积1.2 mL，使DSPC、DSPE-PEG 2000、胆固醇和DiI的终浓度分别为0.43 mM、0.05 mM、0.5 mM和0.02 mM。此溶液作为有机相。
  7. 取一个12 mL玻璃小瓶，加入9 mL纯化水，并将磁力搅拌子放入盛有9 mL水的小瓶中。 将小瓶置于磁力搅拌器上，以500 rpm的速度搅拌（图1).
  8. 将1 mL玻璃注射器连接至分配系统，并用氯仿清洗以避免任何污染。具体操作为：缓慢将氯仿吸入玻璃注射器，然后手动将其排入废液收集器  至少10次。
    注意：此操作必须在通风橱内进行。
  9. 用乙醇预润注射器。预润可替换旧溶剂，并去除任何气泡。
    注意：此操作必须在通风橱内进行。
  10. 使用注射器吸取1 mL有机相。
  11. 将注射器插入玻璃小瓶，直至9 mL刻度线的中点，并保持其稳定地位于小瓶中央（如图所示） 图1).
  12. 以选定的注射速度（833 µL/s）按下分配系统的分配按钮注入溶液（图2)。这将生成10 mL含有10%乙醇的水中50 µM的法尔卡林二醇脂质包被纳米颗粒。
    注意：已发现此注射速度可获得最细小的颗粒，并得到较窄的粒径分布。在 dispensing 溶液时，必须确保注射器位于中心位置，保持稳定且垂直。
  13. 注射后立即从搅拌器上取下小瓶，并将样品转移至50 mL圆底烧瓶（RBF）中。
  14. 将旋转蒸发仪的圆底烧瓶（RBF）连接至旋转蒸发仪，于室温下蒸发1 mL有机溶剂，避免产生过多气泡。
    注意：此步骤将耗时约 5 分钟。
  15. 将纳米颗粒悬浮液从圆底烧瓶转移至另一个12 mL玻璃小瓶中，确保体积为9 mL。 将样品均分至两个12 mL玻璃小瓶中（每瓶加入4.5 mL）。
  16. 向其中一个样品瓶中加入0.5 mL超纯水，向另一样品瓶中加入0.5 mL 10倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS） 另一小瓶。每份样品取出1 mL用于粒径测量。

2. 使用DLS技术进行粒径分析

注意：粒径测量采用动态光散射（DLS）分析仪进行，该仪器可测定纳米颗粒的粒径分布。仪器配备一个功率为100 mW、波长为662.2 nm的激光器，以及一个置于入射光90°角位置的雪崩光电探测器。激光束被纳米颗粒散射后，由光电探测器检测散射光信号。

  1. 开启DLS仪器，并将温度设定为20 °C，待温度稳定。
  2. 设置仪器参数如下：数据采集时间 = 4 s，采集次数 = 30，自动衰减功能 = 开启，自动衰减时间限制 = 0。
  3. 用1 mL纳米颗粒悬浮液填充塑料比色皿，并开始测量。
  4. 根据所使用的 溶剂（水或PBS）报告测得的粒径。
    注意：在细胞处理时，使用PBS中的测量结果可大致了解介质中颗粒的尺寸。细胞处理实验将使用溶于水的纳米颗粒进行。
  5. 在合成后24小时重复测量，以检查颗粒是否发生聚集。

3. 细胞处理

  1. 在37°C、5% CO2的湿润培养箱中，使用添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的最低必需培养基（MEM）培养hMSCs。
    警告：步骤3.1、3.2和3.3需在无菌超净工作台中操作。
  2. 将约50,000个细胞接种于已用绝对乙醇灭菌的#1.5盖玻片上（置于6孔板中），使细胞密度约为30%。每孔加入MEM培养基至终体积为3 mL。在与步骤3.1相同的条件下培养24小时。在处理前24小时接种细胞。
    注意：细胞必须至少在纳米颗粒处理前24小时接种，以确保细胞达到适当的汇合度。
  3. 不更换培养基，直接加入3 µL纳米颗粒溶液，使终浓度为5 µM的法卡林二醇。在与步骤3.1相同的条件下继续培养24小时。
    注意：纳米颗粒溶液需在细胞处理当天制备，以避免颗粒聚集。
  4. 处理24小时后，用PBS洗涤细胞2次，室温下用4%多聚甲醛固定10分钟，随后将样品置于4°C的PBS中避光保存，可保存数月，直至成像。
    警告：此步骤必须在通风橱中进行。
    1. 可选：固定后可进行4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）核染色。具体操作为：细胞固定后，用0.1% Triton X-100透化30分钟，PBS洗涤2次，避光条件下用250 µL 300 nM DAPI染色5分钟。

4. 显微镜观察

  1. 荧光显微镜
    1. 使用配备电子倍增CCD相机的宽场荧光显微镜采集图像。采用150倍、数值孔径（NA）1.45的油镜，以及GFP LP通道。
  2. 共聚焦显微镜
    1. 使用63倍、数值孔径（NA）1.4的油镜，以氩离子激光（514 nm）激发DiI，双光子激光（780 nm）激发DAPI，采集共聚焦显微图像，以验证纳米颗粒被细胞摄取的情况。

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结果

制备了两种不同类型的纳米颗粒，分别为纯法卡里二醇纳米颗粒和脂质包被的法卡里二醇纳米颗粒。测试了多种浓度的脂质和胆固醇。如表1所示，未包被的纳米颗粒在水中形成，并在PBS中测定，其直径为71 ± 20.3 nm，多分散指数（PDI）为0.571。这些参数通过动态光散射（DLS）分析仪测定。实验中使用的包载荧光染料DiI的法卡里二醇脂质包被纳米颗粒尺寸相似，为74.1 ± 6.7 nm；然而，其单分散性相对较高，PDI较低，为0.182，表明颗粒尺寸分布更窄，因为PDI用于描述纳米颗粒群体的尺寸分布情况。通常，在为药用目的制备纳米颗粒时，希望PDI低于0.3。

制备完成后，根据将纳米颗粒加入细胞培养所需的时间延迟，在3 h和24 h后测量了颗粒尺寸。24 h后未观察到聚集现象，但相关数据未在本文中展示，因其将在另一项研究中报道；建议在24 h后检测颗粒稳定性。在确认脂质包被纳米颗粒的尺寸稳定性后，按照上述方案制备了DiI标...

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讨论

本文采用一种简单、快速、可重复且可放大的溶剂快速注入法（溶剂位移法），详细阐述了用于药物递送的脂质包被纳米颗粒的制备方案27,28，并将其应用于镰叶芹二醇（falcarindiol）。通过控制有机相注入水相的速度，并使用适当浓度的包被脂质对镰叶芹二醇核心进行包覆，成功获得了粒径在100 nm以下的纳米颗粒。仅由湍流混合引起的镰叶芹二醇沉淀过程中可能产生的多分散性问题，可通过包被脂质的存在得以控制。这些脂质包被纳米颗粒的结构类似于低密度脂蛋白，但不含天然的500,000 kDa载脂蛋白ApoB100 ，并额外含有聚乙二醇化脂质（PEG-lipids）以提供空间稳定性。这种被动靶向药物递送系统可包封多种尤其是疏水性药物和诊断材料18,19，降低免疫反应，并增加在癌组织中的蓄积16,18

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢丹麦欧登塞大学医院的 Moustapha Kassem 博士提供人源间充质干细胞。作者感谢丹麦医学生物成像中心提供显微镜使用权限。作者感谢嘉士伯基金会和维尔姆基金会提供的经费支持（资助对象：E.A.C.）。作者承认丹麦国家研究基金会尼尔斯·玻尔教授奖提供的经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
12 mL 螺口小瓶（透明玻璃，15-425 螺纹，66 × 18.5 mm）Microlab Aarhus A/SML 33154LP
6 孔板Greiner Bio One International GmbH657160
无水乙醇EMD Millipore (VWR)EM8.18760.1000
氯仿Rathburn Chemicals Ltd.RH1009
胆固醇Avanti Polar Lipids, Inc.700000P
共聚焦显微镜Zeiss LSM510
盖玻片厚度 #1.5Paul Marienfeld GmbH & Co117650
干燥器自制
DiIInvitrogenD282
DLSBeckman CoulterDelsaMAXpro 3167-DMP
DSPC（氯仿储备液）Avanti Polar Lipids, Inc.850365C 
DSPE PEG 2000（氯仿储备液）Avanti Polar Lipids, Inc.880120C
eVol XRSGE analytical science, Trajan Scientific Australia Pty Ltd.2910200
胎牛血清Gibco10270-106
荧光显微镜Olympus IX81配备手动 TIRF 和 Andor iXon EMCCD
培养箱Panasonic MCO-18AC
磁力搅拌子VWR Chemicals15 x 4.5 mm圆柱形，聚四氟乙烯涂层
磁力搅拌器IKART-10
最低必需培养基Gibco32561-029
细胞培养用 PBS 片剂VWR Chemicals97062-732
青霉素-链霉素溶液（Pen/strep）VWR Chemicals97063-708
磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）Thermo Fisher10010031
旋转蒸发仪Rotavapor, Büchi Labortechnik AGR-210
样品浓缩仪 Stuart, Cole-Parmer Instrument Company, LLCSBHCONC/1

参考文献

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法尔卡林二醇递送快速注射法动态光散射共聚焦显微镜荧光成像纳米颗粒摄取药物包封粒径分析
人骨髓间充质干细胞对含法尔卡林二醇的新型脂质包被纳米颗粒的摄取
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