本文描述了将法卡林二醇包载于脂质包被的74 nm纳米颗粒中的方法。通过荧光和共聚焦成像技术，监测人干细胞对纳米颗粒 摄取并进入脂滴的过程。纳米颗粒采用溶剂位移快速注入法制备，并通过动态光散射技术测定其粒径。
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本文内容
摘要
摘要
纳米颗粒在癌症治疗的药物递送系统中受到越来越多的关注。脂质包被的纳米颗粒在结构和尺寸上受到低密度脂蛋白（LDLs）的启发，因为癌细胞增殖需要更多的胆固醇，这一特性已被用作将抗癌药物递送至癌细胞的机制。此外，根据药物的化学性质，将药物包封可能有助于避免其在体内循环过程中发生降解。因此，在本 研究中，采用该设计制备了抗癌药物法尔卡林二醇（falcarindiol）的脂质包被纳米颗粒，旨在为法尔卡林二醇提供一种潜在的新型递送系统，以稳定其化学结构、防止降解，并提高肿瘤对其的摄取效率。所设计的法尔卡林二醇纳米颗粒具有由磷脂和胆固醇单层包裹纯化药物核心的结构。该脂质单层包被由1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC）、胆固醇（Chol）和1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-2000]（DSPE PEG 2000）组成，并包含荧光标记DiI（摩尔比为43:50:5:2）。纳米颗粒采用快速注射法制备，该方法是一种通过良溶剂与不良溶剂交换快速沉淀纳米颗粒的简便技术，具体操作为将含有纳米颗粒组分的乙醇溶液迅速注入水相中。利用动态光散射（DLS）测得荧光纳米颗粒的粒径为74.1 ± 6.7 nm。在人源间充质干细胞（hMSCs）中检测了纳米颗粒的摄取情况，并通过荧光显微镜和共聚焦显微镜进行成像观察。结果显示hMSCs能够摄取这些纳米颗粒，表明该稳定的药物递送系统在法尔卡林二醇递送方面具有潜在应用价值。
引言
脂质包被的纳米颗粒作为癌症治疗中药物递送系统的功能正受到越来越多的关注1癌症具有改变的脂质代谢重编程2 胆固醇需求增加以促进增殖3它们过表达LDLs1 并且比正常细胞吸收更多的低密度脂蛋白（LDL），以至于癌症患者的LDL计数甚至可能下降4低密度脂蛋白摄取促进侵袭性表型5 导致乳腺癌的增殖和侵袭6大量低密度脂蛋白受体（LDLRs）是转移潜能的预后指标7受低密度脂蛋白（LDL）及其被癌细胞摄取的启发，一种新策略被提出： 让药物看起来像癌细胞的食物8因此，这些新型纳米粒子药物递送设计8,9,10 受到天然低密度脂蛋白（LDL）核心结构及脂质稳定化设计的启发11 作为一种将抗癌药物递送至癌细胞的机制。这种被动靶向递送系统特别适用于包封疏水性药物....
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方案
1. 通过快速溶剂转移技术合成纳米颗粒
- 为纳米颗粒的制备设置以下设备：块状加热器/样品浓缩仪、干燥器、配备1 mL玻璃注射器的数字移液系统、12 mL玻璃小瓶、磁力搅拌器、置于玻璃小瓶内的磁力搅拌子（15 mm × 4.5 mm，圆柱形，聚四氟乙烯[PTFE]涂层）以及旋转蒸发仪。
- 在闪烁瓶中加入2.4 mL溶于70%乙醇水溶液的250 µM法尔卡林二醇储备液。
- 使用样品浓缩仪将液体部分蒸发约4小时，以获得干燥的法尔卡林二醇。
- 将闪烁瓶插入块状加热器中；样品浓缩仪通过不锈钢针向样品输送气体，从而浓缩样品。在室温下蒸发，切勿使用加热。
- 干燥后，向上述闪烁瓶中加入脂质包衣的以下组分：31.64 mM DSPC 氯仿储备液 16.3 µL、17.82 mM DSPE-PEG2000 氯仿储备液 3.4 µL、25 mM 胆固醇氯仿储备液 24 µL，以及 4 mM DiI 氯仿储备液 6 µL。 每次添加组分后，用氯仿清洗注射器，以避免交叉污染。
警告：立即盖紧含有脂质的离心管，防止溶剂蒸发从而改变浓度。操作应在通风橱中进行。
注意：氯仿储备液的浓度可能因化学品供应商或实验室中的稀释操作而有所不同。 - 用铝箔包裹小瓶，以避光保护DiI。 将样品在干燥器中放置过夜，以蒸发氯仿。
- 将干燥的样品溶于无水乙醇中，定....
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结果
制备了两种不同类型的纳米颗粒，分别为纯法卡里二醇纳米颗粒和脂质包被的法卡里二醇纳米颗粒。测试了多种浓度的脂质和胆固醇。如表1所示，未包被的纳米颗粒在水中形成，并在PBS中测定，其直径为71 ± 20.3 nm，多分散指数（PDI）为0.571。这些参数通过动态光散射（DLS）分析仪测定。实验中使用的包载荧光染料DiI的法卡里二醇脂质包被纳米颗粒尺寸相似，为74.1 ± 6.7 nm；然而，其单分散性相对较高，PDI较低，为0.182，表明颗粒尺寸分布更窄，因为PDI用于描述纳米颗粒群体的尺寸分布情况。通常，在为药用目的制备纳米颗粒时，希望PDI低于0.3。
制备完成后，根据将纳米颗粒加入细胞培养所需的时间延迟，在3 h和24 h后测量了颗粒尺寸。24 h后未观察到聚集现象，但相关数据未在本文中展示，因其将在另一项研究中报道；建议在24 h后检测颗粒稳定性。在确认脂质包被纳米颗粒的尺寸稳定性后，按照上述方案制备了DiI标.......
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讨论
本文采用一种简单、快速、可重复且可放大的溶剂快速注入法（溶剂位移法），详细阐述了用于药物递送的脂质包被纳米颗粒的制备方案27,28，并将其应用于镰叶芹二醇（falcarindiol）。通过控制有机相注入水相的速度，并使用适当浓度的包被脂质对镰叶芹二醇核心进行包覆，成功获得了粒径在100 nm以下的纳米颗粒。仅由湍流混合引起的镰叶芹二醇沉淀过程中可能产生的多分散性问题，可通过包被脂质的存在得以控制。这些脂质包被纳米颗粒的结构类似于低密度脂蛋白，但不含天然的500,000 kDa载脂蛋白ApoB100 ，并额外含有聚乙二醇化脂质（PEG-lipids）以提供空间稳定性。这种被动靶向药物递送系统可包封多种尤其是疏水性药物和诊断材料18,19，降低免疫反应，并增加在癌组织中的蓄积16,18
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢丹麦欧登塞大学医院的 Moustapha Kassem 博士提供人源间充质干细胞。作者感谢丹麦医学生物成像中心提供显微镜使用权限。作者感谢嘉士伯基金会和维尔姆基金会提供的经费支持（资助对象：E.A.C.）。作者承认丹麦国家研究基金会尼尔斯·玻尔教授奖提供的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 12 mL 螺口小瓶（透明玻璃，15-425 螺纹，66 × 18.5 mm） | Microlab Aarhus A/S | ML 33154LP | |
| 6 孔板 | Greiner Bio One International GmbH | 657160 | |
| 无水乙醇 | EMD Millipore (VWR) | EM8.18760.1000 | |
| 氯仿 | Rathburn Chemicals Ltd. | RH1009 | |
| 胆固醇 | Avanti Polar Lipids, Inc. | 700000P | |
| 共聚焦显微镜 | Zeiss LSM510 | ||
| 盖玻片厚度 #1.5 | Paul Marienfeld GmbH & Co | 117650 | |
| 干燥器 | 自制 | ||
| DiI | Invitrogen | D282 | |
| DLS | Beckman Coulter | DelsaMAXpro 3167-DMP | |
| DSPC（氯仿储备液） | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850365C | |
| DSPE PEG 2000（氯仿储备液） | Avanti Polar Lipids, Inc. | 880120C | |
| eVol XR | SGE analytical science, Trajan Scientific Australia Pty Ltd. | 2910200 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10270-106 | |
| 荧光显微镜 | Olympus IX81 | 配备手动 TIRF 和 Andor iXon EMCCD | |
| 培养箱 | Panasonic | MCO-18AC | |
| 磁力搅拌子 | VWR Chemicals | 15 x 4.5 mm | 圆柱形，聚四氟乙烯涂层 |
| 磁力搅拌器 | IKA | RT-10 | |
| 最低必需培养基 | Gibco | 32561-029 | |
| 细胞培养用 PBS 片剂 | VWR Chemicals | 97062-732 | |
| 青霉素-链霉素溶液（Pen/strep） | VWR Chemicals | 97063-708 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4） | Thermo Fisher | 10010031 | |
| 旋转蒸发仪 | Rotavapor, Büchi Labortechnik AG | R-210 | |
| 样品浓缩仪 | Stuart, Cole-Parmer Instrument Company, LLC | SBHCONC/1 |
参考文献
- Firestone, R. A. Low-Density Lipoprotein as a Vehicle for Targeting Antitumor Compounds to Cancer Cells. Bioconjugate Chemistry. 5 (2), 105-113 (1994).
- Beloribi-Djefaflia, S., Vasseur, S., Guillaumond, F. Lipid metabolic reprogramming in cancer cells. Oncogenesis.....
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重印与许可
