本文介绍了一种基于微流控芯片化学发光系统的血清特异性免疫球蛋白E检测方法，并评估了其在过敏诊断中的应用价值。
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方法文章
生物芯片微流控技术在血清特异性免疫球蛋白E（sIgE）过敏原检测中的应用
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
过敏性疾病在成人和儿童中均较为常见。明确致敏过敏原对于疾病的管理和预防具有重要意义。然而，目前中国大陆地区，尤其是在基层医疗机构，尚缺乏性价比高的特异性免疫球蛋白E（IgE）检测系统。本文介绍了基于微流控芯片的化学发光系统检测血清中过敏原特异性IgE的原理及操作流程，并将检测结果与行业标准方法ImmunoCAP（系统1）进行比较，同时评估该系统对常见过敏原致敏患者检测的重复性。结果表明，与ImmunoCAP（系统1）相比，BioIC系统（系统2）在检测针对多种吸入性和食物过敏原的血清特异性IgE时具有良好的精密度和灵敏度，且成本显著降低。该系统可作为中国大陆经济承受能力较弱的基层医疗机构中替代系统1的良好选择。
引言
过去几十年中，过敏的患病率持续上升，已影响全球20%至30%的人口1。明确致敏过敏原对于疾病管理具有重要意义。在中国，由于缺乏注册的体内皮肤点刺试验，体外检测血清特异性IgE是I型过敏诊断最重要且最常用的工具2。这一做法与西方国家类似；然而，尽管ImmunoCAP系统（System 1）——一种基于荧光酶联免疫吸附的检测系统——被视为体外过敏诊断的金标准3，但由于其设备和试剂价格昂贵，在中国的应用极为有限。因此，亟需一种性价比高的新型替代性过敏诊断系统。
BioIC系统（系统2）是一种基于化学发光原理的微流控芯片系统，用于血清特异性IgE的多重检测。该微流控芯片尺寸为7 cm × 4 cm，由三层注塑成型塑料构成。上层为3 mm厚的透明聚碳酸酯，具有良好的热组装稳定性；下层为3 mm厚的丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物（ABS）材料；中间层为0.5 mm厚的硅橡胶，夹在上下两层之间。中间层呈黑色，可在化学发光检测过程中降低背景信号。在硅胶层上方，于反应区对应位置喷涂有一层薄硝酸纤维素膜（NC膜），可用于点样多种不同的变应原蛋白。本研究旨在评估该微流控系统在血清中变应原特异性IgE多重检测中的临床性能。
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方案
本研究及人血清样本的使用已获得广州医科大学附属第一医院伦理委员会（GYYY-2016-73）的批准。所有参与者均独立签署书面知情同意书，或由其父母代为签署（针对儿童参与者）。
1. 研究组的基本信息
注意：国家呼吸系统疾病临床医学研究中心过敏信息库（AIR-SKLRD）是建于广州呼吸健康研究院（GIRH）内部的一个大型血清样本库。该样本库于十年前启动，已开始系统收集和储存过敏性疾病患者的血清样本及其临床资料（表1）4,5。本研究使用的血清样本均来自AIR-SKLRD。
- 在 AIR-SKLRD 数据库中检索 2015 年 1 月至 2018 年 6 月期间采集的血清样本，筛选出对该地区常见过敏原敏感的过敏性疾病患者。
- 确认所有入选患者均患有过敏相关疾病，例如过敏性鼻炎和/或哮喘、过敏性皮炎和/或荨麻疹，并且通过系统 1 检测发现这些患者的血清中含有针对该地区常见过敏原的多种血清特异性免疫球蛋白 E（sIgE）致敏反应。
- 排除病历资料不完整、失访、拒绝签署关于其血清样本用于科研目的知情同意书、已确诊存在免疫缺陷、正在接受免疫治疗或免疫调节药物治疗，或被发现患有寄生虫感染的患者。
- 确保在采集血清前未给予任何治疗或药物处方，以尽量减少对实验室检测结果的干扰。所有不符合上述标准的血清样本均被剔除。
2. 研究流程与关注的测量指标
注意：微流控系统检测19种过敏原需要100 µL血清。使用含分离胶的真空采血管从每位患者采集静脉血5 mL。在1,000 × g条件下离心10分钟后，收集上层液体用于检测。未使用的血清储存于-80 °C。检测前，将血清在室温放置30分钟，并用涡旋混合器振荡混匀。避免反复冻融。
- 主要检测血清样本中针对以下完整变应原的特异性IgE（sIgE）：粉尘螨（Dermatophagoides pteronyssinus，d1）、屋尘螨（Dermatophagoides farinae，d2）、热带无爪螨（Blomia tropicalis，d201）、猫皮屑（e1）、狗皮屑（e5）、百慕大草（g2）、梯牧草（g6）、蟑螂（i6）、烟曲霉（Aspergillus fumigatus，m3）、白色念珠菌（Candida albicans，m5）、豚草（w1）、蛋清（f1）、牛奶（f2）、小麦（f4）、花生（f13）、大豆（f14）、杏仁（f20）、蟹（f23）和虾（f24）。操作步骤遵循第3节中的说明。
注意：sIgE检测使用变应原特异性IgE检测试剂盒（见材料表），并通过化学发光分析仪进行测定。 - 从血清量充足（至少900 µL）的样本中随机选取三个样本，用于重复性研究。在所有条件保持不变的情况下，连续9天每天测定这三份血清样本的变应原sIgE水平（即总共消耗 100 × 9 = 900 µL 血清）。
3. 微流控系统的半自动化测试流程
注意：系统2集成了自动微流控技术、蛋白质微阵列、冷光分析、并行IgE分析和图像处理技术。检测流程分为四个部分：仪器准备、加样、孵育和检测。
- 设备准备
- 打开电脑和分析仪电源。
注意：电源开关位于底座左侧。 - 在电脑上启动 LabIT 程序。如果弹出暗场警告窗口，请点击确定以运行LEAK 测试。随后，点击中央标志进入操作界面。
注意：若系统闲置超过 24 小时，将提示用户运行LEAK 测试。 - 检查屏幕右下角的反应温度和 CCD（电荷耦合器件）温度。反应温度应在约 10 分钟内升至 37 °C ± 1 °C，CCD 温度应降至 -15 °C ± 1 °C。
- 当 CCD 温度降至 -15 °C ± 1 °C 后，运行LEAK 测试。在运行 LEAK 测试前，确保仪器内部无其他物品残留，并关闭门。点击工具 | 系统测试 | LEAK 测试。测试过程中请勿打开门。测试完成后，报告窗口将自动弹出。
- 打开电脑和分析仪电源。
- 加样
- 向微流控芯片的相应试剂槽中加入 620 µL 洗涤缓冲液、120 µL 封闭缓冲液、60 µL 共轭物 A 和 B、60 µL 底物 A 和 B，以及 100 µL 血清样本。
- 孵育
- 点击芯片 ID，使用条形码扫描仪扫描芯片序列号，输入样本 ID，将芯片放入分析仪中并关闭门，然后点击分析仪和运行以开始分析。
- 检测
- 检测完成后，将结果导出至统计软件（例如 Excel）。
注意：孵育 30 分钟后，分析仪将自动进行检测并报告结果。
- 检测完成后，将结果导出至统计软件（例如 Excel）。
- 关闭分析仪
- 常规维护时，测试结束后取出芯片，并用 75% 酒精轻轻擦拭分析仪内部加热板和电磁铁。
注意：请勿用力按压或晃动电磁铁。 - 关闭 LabIT 窗口。温度监控窗口将弹出，当 CCD 升温至 5 °C 保护模式时，该窗口将自动关闭。此时方可安全关闭分析仪和电脑的电源。
注意：在 CCD 温度升至 5 °C 前，请勿手动关闭温度监控窗口，且在 CCD 升温过程中不得关闭分析仪或电脑电源。
- 常规维护时，测试结束后取出芯片，并用 75% 酒精轻轻擦拭分析仪内部加热板和电磁铁。
4. sIgE 反应性的定义
注意：对于未稀释的血清样本，System 2 的检测范围为 0.21–100 IU/mL。
- 根据 0.35 IU/mL 的阈值，若 sIgE 水平超过 0.35 IU/mL，则视为阳性6,7。将 sIgE 检测的反应性分为以下等级8：1 级（≥0.35 且 <0.70 IU/mL）、2 级（≥0.70 且 <3.50 IU/mL）、3 级（≥3.50 且 <17.50 IU/mL）、4 级（≥17.50 且 <50.00 IU/mL）、5 级（≥50.00 且 <100.00 IU/mL）和 6 级（≥100.00 IU/mL）。
5. 统计分析
- 使用直方图显示19种过敏原的阳性率（图1），并使用Levey-Jennings曲线展示检测系统的重复性（图2）9。
- 选择最常见的三种吸入性过敏原和三种食物过敏原（共六种过敏原），将其检测结果与I System 1进行比较，以评估其临床诊断性能10,11。评估指标包括符合率、灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值，以及受试者工作特征曲线（ROC曲线）下的面积（AUC）。
- 采用Spearman相关性分析12描述两种系统之间的相关性，并使用kappa值评估一致性。将kappa值分为几乎完全一致（0.8–1.0）、实质性一致（0.6–0.8）、中等程度一致（0.4–0.6）、一般一致（0.2–0.4）或一致性差（<0.2）13。使用SPSS 23.0和MedCalc 11.0进行统计分析，并将P < 0.05定义为具有统计学意义。
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结果
19种常见过敏原的阳性率
293份血清的结果如图3所示。在所有吸入性过敏原中，D. farinae的阳性率最高（80.89%，273/293），其次为D. pteronyssinus（78.84%，231/293）。在食物过敏原中，螃蟹的阳性率最高（20.48%，60/293），其次为虾（13.65%，40/293）。吸入性过敏原的总阳性率高于食物过敏原。
微流控系统的重复性
基于九轮测试，猫皮屑、狗皮屑和蟑螂的重复性结果分别为 32.98 ± 8.94、1.61 ± 0.48 和 0.76 ± 0.18，一致性水平分别为 100%（9/9）、100%（9/9）和 67%（6/9）。结果分布情况通过 图2 中的Lev...
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讨论
与许多其他研究的结果相似15,16,17，基于293例过敏患者血清的微流控系统检测结果显示，尘螨（包括D. pteronyssinus、D. farinae和B. tropicalis）是中国南方地区导致过敏性疾病的主要吸入性过敏原，而在食物过敏原中，牛奶、花生、虾和蟹是最常见的引起过敏症状的过敏原。针对三种过敏原进行的重复性研究均显示出良好结果，总体重复率达到88.89%，表明其符合最大允许误差范围。
以系统1为参考，本研究评估了系统2的临床诊断效能。以血清sIgE水平0.35 IU/mL作为临界值2，若样本sIgE > 0.35 IU/mL，则提示患者对该过敏原敏感，且滴度越高，与患者症状的相关性越好18。结果显示，三种吸入性过敏原的一致...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢姜梅教授在统计分析方面的帮助，以及崔锤先生在稿件撰写过程中的协助。本研究由广州市科技计划项目（201804020043）和国家自然科学基金（NSFC 81572063 和 NSFC 81802076）资助。资助机构同意本研究的设计、数据分析、稿件撰写及发表决定。本研究未获得其他资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Agnitio BioIC 分析仪 | Agnitio Science & Technology(中国台湾) | BA-G2000 | |
| BioIC 过敏原特异性IgE检测试剂盒 | Agnitio Science & Technology(中国台湾) | DR17A12 | |
| BioIC 芯片放置板 | Agnitio Science & Technology(中国台湾) | T20SET | |
| BioIC 试剂分配仪 | Agnitio Science & Technology(中国台湾) | DS-1 | |
| 二维条形码图像扫描仪 | Agnitio Science & Technology(中国台湾) | NLS-HR200 | |
| 软件包，LabIT | Agnitio Science & Technology(中国台湾) | 版本 2.4.12 | |
| VORTEX-5 涡旋混合器 | 海门市麒麟贝尔实验室仪器有限公司 | VORTEX-5 |
参考文献
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