磁共振成像评估致癌物诱导的小鼠膀胱肿瘤

摘要

使用N-丁基-N-(4-羟丁基)亚硝胺（BBN）致癌物诱导小鼠膀胱肿瘤。由于膀胱肿瘤的生成具有异质性，因此在将动物随机分配至实验治疗组之前，需要对肿瘤负荷进行准确评估。本文介绍了一种快速、可靠的磁共振成像（MRI）方案，用于评估肿瘤大小和分期。

摘要

小鼠膀胱肿瘤模型对于评估新的治疗方案至关重要。使用N-丁基-N-(4-羟丁基)亚硝胺（BBN）致癌剂诱导的膀胱肿瘤模型相较于基于细胞系的模型具有优势，因其能更准确地模拟人类肿瘤的基因组特征，并且与细胞模型和异种移植模型不同，该模型为免疫疗法的研究提供了良好平台。然而，膀胱肿瘤的形成具有异质性，因此在将动物随机分组接受实验性治疗前，需对肿瘤负荷进行准确评估。本文所述为一种BBN诱导的小鼠模型及用于评估膀胱癌肿瘤负荷的实验方案。 体内 使用一种快速且可靠的磁共振（MR）序列（true FISP）。该方法简单且可靠，因为与超声不同，磁共振成像不受操作者影响，且便于进行直接的图像后处理与回顾。通过膀胱的轴位图像，可分析膀胱壁及肿瘤感兴趣区域，从而计算膀胱壁和肿瘤面积。该测量值与 离体 膀胱重量（r_s= 0.37，p = 0.009）和肿瘤分期（p = 0.0003）。综上所述，BBN 诱导的肿瘤具有异质性，是评估免疫疗法的理想模型，而 MRI 可在随机分组至实验治疗组之前快速、可靠地评估肿瘤负荷。

引言

膀胱癌是全球第五大常见癌症，2017年在美国导致约80,000例新发病例和16,000例死亡¹。在膀胱癌的全身治疗领域长达约30年缺乏重大进展之后²，近期针对PD-1和PD-L1的免疫检查点抑制剂临床试验在晚期尿路上皮癌患者中展现出令人鼓舞且有时持久的治疗反应^3,4,5。然而，仅有约20%的患者对这些治疗产生客观应答，仍需进一步研究以扩大免疫治疗在膀胱癌患者中的有效应用。

小鼠膀胱癌模型是评估新型治疗方法的重要临床前工具^6,7。为了在将小鼠随机分组接受不同治疗时控制肿瘤大小，必须对各治疗组之间的肿瘤负荷进行评估和控制。既往研究采用超声或生物发光技术来评估基于细胞系的原位膀胱癌模型^8,9,10,11。然而，这两种技术均存在若干缺点。超声测量结果可能受操作者技术水平影响，且缺乏三维成像特征和高空间分辨率。生物发光方法仅能对肿瘤细胞提供半定量评估，无法显示膀胱的解剖结构和形态学特征。此外，生物发光技术仅适用于表达生物发光基因的细胞系模型，且通常限于无毛小鼠或白毛小鼠。

另一方面，磁共振成像（MRI）在获取高分辨率解剖图像方面具有独特灵活性，能够呈现广泛的组织对比度，从而无需表达生物发光特性即可准确可视化并定量评估肿瘤负荷。通过适当的分析流程，MR图像更易于重复获取，并能确保膀胱的三维可视化。MRI最主要的局限性在于检查所需时间较长以及相关成本较高，这限制了其在高通量检测中的应用。然而，已有多个研究表明，MR序列可提供高质量的诊断图像，可用于有效检测和监测基于细胞系的膀胱肿瘤；因此，其可能适用于高通量分析^9,12。

本文介绍了一种基于磁共振（MR）的非侵入性方法，可稳定、高效地对小鼠中由致癌物诱导的膀胱肿瘤进行表征。为实现这一目标，我们采用了一种稳态进动快速成像磁共振技术（true FISP），该技术可在保证高图像质量与高空间分辨率（约100微米）的同时，实现较短的扫描时间，从而有效检测并测量膀胱肿瘤¹³。此外，为验证该非侵入性MRI检测方法的准确性，我们描述了MRI所得参数与离体（ex vivo）膀胱重量以及经病理学确认的肿瘤分期之间的相关性。

方案

本文所述所有方法均已获得西北大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 使用 BBN 诱导肿瘤

1. 获取每只至少6周大的雄性C57/BL6小鼠。
   注意：雄性小鼠比雌性小鼠发生膀胱癌的速度更快且一致性更高^14,15.
2. 将N-亚硝基丁基(4-羟丁基)胺（BBN）以0.05%的剂量加入饮水中。储存于不透光容器中并提供给动物使用 随意摄取 作为小鼠的饮用水¹⁶.
   注意：将 BBN 溶液储存在透明容器中会导致致癌物降解¹⁷.
3. 每周更换两次0.05% BBN水。
4. 通过检查小鼠是否出现与膀胱肿瘤相关的痛苦迹象（包括血尿、膀胱变硬和肿块）来监测动物状态。每周检查小鼠两次，或依照当地实验动物管理与使用委员会（IACUC）的指导原则进行。
5. 预计肿瘤将在暴露后16至24周内形成¹⁸.

2. MRI 设置

1. 在MRI检查前10分钟，皮下注射无菌生理盐水（使用25–27 G针头和1 mL注射器，剂量为0.1–0.2 mL），以促进膀胱充盈。
2. 用100% O₂与麻醉气体的混合气体对每只小鼠进行麻醉₂ 并根据需要使用异氟烷（2%–4%）。在继续操作前，通过测试动物的缩足反射（脚趾夹捏）确认麻醉深度足够。为动物涂抹无菌眼膏。 
3. 将小鼠转移至成像固定装置中，该装置配备有用于输送吸入式异氟烷（0.5%–3%）的鼻罩。
4. 使用连接至生理记录计算机的直肠温度探头监测体温和呼吸。
   注意：使用集成在动物磁共振固定装置中的循环热水系统维持正常体温（36–37 °C）。通过直肠传感器测量体温，并利用专用的生理监测软件在生理监测计算机上记录。同一系统也用于记录通过置于肋骨下方的气动垫采集的呼吸和心电图信号。 通过 3导联心电图电极。呼吸信号还用于触发磁共振成像采集，并减少与呼吸运动相关的伪影。

3. MRI图像采集

1. 使用正交体线圈进行激发。
2. 将四通道接收线圈放置于被扫描小鼠的下腹部，以优化对目标区域信号的检测。
3. 通过集成的成像软件启动自动调整，获取小鼠全身的三维轴向图像集。根据该参考图像集，确定感兴趣区域（本例中为膀胱区域）。
4. 使用放射学参考框架，沿轴向、冠状向和矢状向平面获取三组正交切面图像。
5. 使用集成成像软件中的真实稳态进动快速成像序列（true FISP），MR 参数如下：TR = 900 msec，TE = 2 ms，FA = 70，信号平均 14 次。
   注意：该组参数可实现具有高诊断质量的快速成像，包括T1/T2加权 <每只小鼠10分钟。
6. 空间分辨率和层厚由用户通过集成成像平台的图形界面选择的几何参数决定。最终获得覆盖整个膀胱的一系列厚度为0.5 mm、面内分辨率为0.148 mm的切片。

4. MR图像分析

1. 确定一组厚度为 0.5 mm、平面内分辨率为 0.148 mm 的切片，这些切片需覆盖整个膀胱。
2. 通过选择包含相应图像的 ANALYZE 格式文件夹，将图像导出至医学图像分析软件。
3. 在生成的图像中滚动浏览，找到膀胱中点处的切片，选择该“代表性轴向视图”用于定量分析，该视图应能清晰显示膀胱壁和腔体。
   注意：应选择直径最大的切片作为中心切片。
4. 在选定的代表性轴向视图中，手动勾画膀胱外缘边界（BLA_out）和内腔边界（BLA_in），以仔细勾勒感兴趣区域（ROI）（参见图2中的示意图和代表性图像）。
5. 用外缘面积减去内腔面积，计算膀胱壁的表面积。
   BLA_wall = BLA_out - BLA_in
   注意：无肿瘤的对照膀胱表面积应小于有膀胱肿瘤的膀胱。

5. 安乐死及膀胱解剖

1. 经过20周的BBN暴露后，根据当地IACUC指南，采用标准操作程序对小鼠实施安乐死。
2. 用70%乙醇清洁切口区域，然后用镊子夹起并提起腹壁皮肤。
3. 从耻骨联合至剑突做正中切口。
4. 用镊子夹住腹膜，用剪刀锐性切开腹腔。
5. 辨认位于中下腹部的膀胱。
6. 辨认并剪断连接膀胱顶部与脐部及腹壁的脐正中韧带。
7. 用镊子夹住膀胱顶部以提供反向牵引，将膀胱从周围结构（包括精囊、直肠和脂肪组织）中分离出来。
8. 辨认进入膀胱的输尿管，并在靠近膀胱处用剪刀剪断。
9. 将膀胱向头侧提起，用剪刀剪断尿道，取出膀胱。
10. 用PBS冲洗后立即称量膀胱重量。

6. 膀胱组织的组织学检查

1. 将膀胱组织在10%中性缓冲福尔马林中于室温（RT）固定36–48小时。
2. 将组织包埋于石蜡块中，切片后进行后续观察，并按先前所述方法对切片进行苏木精-伊红染色，以供显微镜检查^19,20.
3. 在低倍（2.5×和10×）与高倍（20×和40×）显微镜下观察小鼠膀胱，检查是否存在肉眼可见的病变、增生及癌变 原位，乳头状瘤、乳头状肿瘤和浸润性肿瘤^19,21.

结果

采用所述方案（图1），在C57/B6雄性小鼠中诱导膀胱肿瘤。在第16周进行磁共振成像（MRI），并在第20周处死小鼠。离体称量每只小鼠的膀胱重量（BW）。切片经苏木精-伊红染色，所有组织学切片均用于评估肿瘤分期。

为了利用磁共振（MR）分析肿瘤负荷，通过从膀胱壁外腔（BLA_out）中减去膀胱壁内腔（BLA_in）来计算膀胱壁的厚度（BLA_wall）（图2）。代表性的真实FISP磁共振图像、膀胱壁三维重建图像以及对照小鼠（即无肿瘤）的病理图像如图3A-F所示，具有大肿瘤的小鼠图像如图3G-...

讨论

准确的肿瘤模型成像对于实验治疗开始前的安乐死前分期和动物随机分组至关重要。通过本文介绍的方法，我们展示了（1）使用BBN致癌剂诱导膀胱肿瘤，以及（2）利用磁共振成像（MR）对膀胱肿瘤负荷进行分层的实验方法。基于磁共振成像获得的面积测量值（BLA）_壁) 与……存在显著相关性 离体 膀胱重量，并与病理肿瘤分期相关。

通过采用高空间分辨率（真实稳态进动快速成像，true FISP）、短采集时间且成像快速、诊断质量高的方法，我们可在肿瘤发育的中期阶段、治疗随机分组前对小鼠进行高通量检测。本报告与既往关于细胞系来源肿瘤移植的磁共振成像研究结果一致^9,12，并进一步证实了该技术在优化大样本量药物研究中的应用潜力。

在本 MRI 方案中，必须在小鼠膀胱充盈的状态下进行成像，以获得高质量图像并清晰区分肿瘤与膀胱腔。我们发现，在成像前 10 分钟为每只小鼠注射生理盐水，可实现膀胱的良好显影...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C57BL/6小鼠	杰克逊实验室	664	小鼠
N-丁基-N-(4-羟丁基)亚硝胺致癌物（BBN）	TCI 美国	B0938	致癌物
0.9%生理盐水	Hospira, Inc	NDC 0409-488-02
异氟烷	Piramal Healthcare	60307-120-25	麻醉剂
7Tesla ClinScan MRI	布鲁克	NA	专用小型动物成像磁共振成像
Syngo	西门子	NA	MR一体化成像软件
Model 1030 监测 &和门控系统	小型动物仪器公司（SAII）	NA	小型动物生理监测
中性缓冲福尔马林，10%	Sigma	HT501128	固定剂
伊红Y	Fisher Scientific	NC1093844	组织学染色剂
苏木精	Fisher Scientific	23-245651	组织学染色剂
Jim7	Xinapse Systems	NA	医学图像分析软件
GraphPad Prism v7.04	Graphpad	NA	绘图软件
R v3.4.2	统计计算 R 项目	NA	统计软件
R 包 pROC v1.10.0	统计计算 R 项目	NA	ROC分析