酵母神经退行性蛋白病模型中组蛋白后转化修饰改变的表征

Summary

该协议概述了实验程序, 以描述全基因组的变化, 在与 ALS 和帕金森病相关的蛋白质过度表达的情况下, 组蛋白翻译后修饰 (PTM) 的水平发生。酿酒酵母模型。SDS-PAGE 分离后, 通过西方印迹, 通过修正特异性抗体检测单个组蛋白 PTM 水平。

Abstract

神经退行性疾病, 如肌萎缩侧索硬化症 (ALS) 和帕金森病 (PD), 每年造成数十万人丧生。缺乏能够阻止疾病进展的有效治疗方案。尽管在大量患者中进行了广泛的测序工作, 但大多数 ALS 和 PD 病例仅由于基因突变就无法解释。表观遗传学机制, 如组蛋白的翻译后修饰, 可能参与神经退行性疾病的病因和进展, 并导致药物干预的新目标。哺乳动物在体内和体外模型 als 和 PD 是昂贵的, 往往需要长期和费力的实验方案。在这里, 我们概述了一种实用、快速和具有成本效益的方法, 利用酿酒酵母作为模型系统, 确定组蛋白修饰水平的全基因组变化。该协议允许对与神经退行性蛋白病有关的表观遗传变化进行全面调查, 证实了以前在不同模型系统中的发现, 同时显著扩大了我们对神经退行性疾病表观基因组。

Introduction

神经退行性疾病是毁灭性的疾病, 几乎没有或根本没有治疗选择。其中, 肌萎缩侧索硬化症 (ALS) 和帕金森病 (PD) 尤其可怕。大约90% 的 als 和 pd 病例被认为是零星的, 没有家族病史, 而其余病例在家庭中运行, 一般与特定的基因突变^1,2有关。有趣的是, 这两种疾病都与蛋白质错位和聚集^3,4,5,6有关。例如, 融合肉瘤 (fus) 和 tar dna 结合蛋白 43 (tdp-43) 是 rna 结合蛋白, 在 als^{7、8、9、10}、 ^11,12, 而α-合核蛋白是蛋白质聚集物的主要组成部分, 称为 le七烯体^在pd^5,13,14,15。

尽管在大量患者中进行了广泛的全基因组关联工作, 但绝大多数 ALS 和 PD 病例在基因上仍无法解释。表观遗传学能在神经退行性疾病中发挥作用吗？表观遗传学包括基因表达的变化, 在不改变基础 DNA 序列¹⁶的情况下发生。一个主要的表观遗传机制涉及组蛋白16的翻译后修饰 (Ptm).在真核细胞中, 遗传物质紧紧地包裹在染色质中。染色质的基本单位是核糖体, 由146个基对 dna 组成, 包裹在一个组蛋白八分体上, 由四对组蛋白组成 (分别为两个组蛋白 H2A、H2A、H3 和 H4)¹⁷。每个组蛋白都有一个 n 端的尾巴, 从核糖体中伸出来, 可以通过添加各种化学分子来修饰, 通常是在赖氨酸和精氨酸残留物¹⁸上。这些 Ptm 是动态的, 这意味着它们可以很容易地添加和删除, 并包括乙酰化、甲基化和磷酸化等群体。Ptm 控制 DNA 对转录机制的可访问性, 从而有助于控制基因表达¹⁸。例如, 组蛋白乙酰化降低了高度基本的组蛋白蛋白和负电荷 DNA 主干之间的静电相互作用的强度, 使乙酰化组蛋白包装的基因更容易获得, 从而更高表示¹⁹。最近, 特定组蛋白 ptm 及其组合的显著生物学特异性导致组蛋白编码假说^20, 21, 其中写、擦除和读取组蛋白 ptm 的蛋白质都协同作用调节基因表达。

酵母是研究神经退行性变的一个非常有用的模型。重要的是, 许多神经元细胞通路从酵母保存到人类^22,23,24。酵母重述 fus、tdp-43 或α-共核蛋白 22^{、23、24、25、26}的过度表达后的细胞毒性表型和蛋白质夹杂物^.事实上,酿酒酵母的 als 模型已被用来识别遗传危险因素在人类²⁷。此外, 酵母过度表达人α-共核蛋白允许将 rsp5 网络定性为可吸毒的靶点, 以改善 28^,29神经元^中α-共核蛋白的毒性。

在这里, 我们描述了一个利用酿酒酵母检测全基因组组蛋白 PTM 变化与神经退行性蛋白病变相关的协议 (图 1)。与其他体外和动物神经退行性模型相比, 酿酒酵母的使用具有很强的吸引力, 因为它使用方便、成本低、速度快。利用以前开发的 als 和 pd 模型^22,23,25, 26, 我们在酵母中过度表达了人类 fus、tdp-43 和α-合核蛋白, 并发现了明显的组蛋白 ptm 变化发生在与每个蛋白病30的连接。我们在这里描述的协议可以在从转换到数据分析的不到两周的时间内完成。

Protocol

1. 用神经退行性蛋白质与病理相关的蛋白质结构转化酿酒酵母

1. 在30°c 晃动 (200 转/分) 的酵母提取物肽葡萄糖 (YPD) 肉汤中生长野生型 (WT) 303 酵母。
2. 经过12-16小时的生长, 用 YPD 将酵母稀释到600纳米 (OD₆₀₀) 的光学密度。由于每次转化都需要10毫升的酵母液体培养, 因此为5个转化制备50毫升的酵母液体培养, 这些转化与 FUS、TDP-43、a-synuclein 和向量仅 (ccdB) 结构相对应, 以及负控制转化没有 DNA
3. 在30°c 下搅拌酵母, 直到达到0.60 至0.60 之间的 OD₆₀₀ 。这通常需要4-6 小时。
4. 酵母生长完成前 30分钟, 对质粒结构进行线性化。
   注: 此处使用的质粒结构必须直接集成到基因组中, 因此在转换之前需要进行线性化。
   1. 计算为1微克的质粒存量, 从44微克减去该体积, 以计算所需的无核核酸酶无核武器区 h2o的数量。
   2. 在微离心管中加入无核酸酶的 h2o、5μl 的10倍限制酶缓冲液 (材料表)、1Μl 的 NheI 限制性酶 (材料表) 和适当数量的质粒 (按步骤计算 1.4.1).通过上下移液彻底混合, 在37°c 孵育15分钟。质粒现在已经线性化, 可以转换了。
5. 酵母培养达到 0.6-0.8 的 OD₆₀₀后, 在50毫升锥形管中收获细胞, 在4°c 下在 850 x 克的温度下旋转3分钟。
6. 在4°C 的情况下, 在 850 x 克的10毫升中清洗细胞颗粒, 在4°c 下清洗细胞颗粒3分钟。重复 3倍, 共进行四次清洗。
7. 在第三次清洗开始时, 在加热块上, 每次转化反应解冻10μl 三文鱼精子 DNA 5分钟。
8. 在每次转化100μl 的 Dh2o_中重新杀剂细胞颗粒, 并分裂成适当数量的微离心管。对于五个转变, 将颗粒重新悬浮到500Μl 的 Dh2o_中, 并均匀地分裂成五个独立的微离心管。
9. 在室温 (RT) 下, 以 850 x g 离心 5分钟, 并去除所有剩余的水。
10. 按以下顺序添加50Μl 无菌 h2 o、240Μl 的50% 聚乙二醇 (peg)、36μl 的 1 m liac、10μl 的鲑鱼精子 dna、20Μl 的线性化质粒 dna (或无核酸酶的无核酸水, 无 dna 控制转化)。每次添加后, 在添加所有转化成分后, 应进行短暂的混合和旋涡。
11. 在42°c 下培养转化反应20分钟。
    注: 在水浴中进行此孵育, 以实现更一致的温度控制。
12. 在 RT 以 470 x克离心 5分钟, 丢弃上清液, 并在200μl 无菌 H2o 中重新悬浮每个细胞颗粒.
13. 板酵母悬浮在选择性介质板上, 并与滚动珠子或摊铺机一起传播。在30°c 下将板材孵化2-3天。
    注: 合成定义 (SD)-他的盘子用于此处描述的质粒。

2. 调查菌落生长抑制和储存在甘油库存中

1. 在5毫升的选择性培养基中从转化板中接种单菌落, 辅以2% 的松糖。在30°c 的振动台上过夜。每次转换至少选择12个菌落。
   注: 在 "无 DNA" 转化控制板中不存在菌落。
2. 用乙醇消毒引脚霜, 然后是燃烧。
3. 对于每种培养物, 96 孔板的第一排都有100μl 的饱和细胞悬浮液。在相邻井柱的所有井中加入200μl 无菌 h2o。对于 1: 5 串行稀释, 用多通道管道将第一列的50Μl 添加到后面的相邻柱中。通过移液彻底混合。然后将第二列的50Μl 添加到第三列, 然后通过移液进行混合。对盘子的其他部分重复这一点。
4. 板材酵母, 方法是将青蛙放入96孔板中, 然后轻轻地均匀地压在有半乳糖和不含有半乳糖的选择性介质板上冲压。在30°c 下孵化2-3天。
   注: Sd-her 和 Sgal-hed。
5. 对于 FUS、TDP-43 和 a-sy核能转化, 识别在半乳糖存在的情况下表现出最大生长抑制的菌落。从 Sd-hed 的平板中选择这个群体, 并接种10毫升的选择性培养基, 辅以2% 的松糖, 以实现隔夜生长。对于矢量控制, 选择一个在半乳糖存在的情况下没有抑制生长的菌落。
6. 制备甘油库存时, 将饱和液体培养的0.5 毫升与50% 甘油的0.5 毫升结合。通过上下移液和在-80°c 下冻结进行混合。
   注: 甘油库存可在-80°c 下储存长达一年。

3. 神经退行性蛋白病相关蛋白在酿酒酵母中的过度表达

1. 从冷冻甘油库存, 在组氨酸上的再条纹酵母, 2% 葡萄糖琼脂选择性培养基板和孵育在 30°c 2-3天。
2. 在5毫升的组氨酸选择性液体介质中, 再加上2% 的松糖, 对每种过度表达模型进行接种单菌落和对照。在30°c 下连夜晃动 (200 转/分)。
3. 为每个过度表达模型和控制 (FUS、TDP-43 和矢量控制; a-sy核苷和矢量控制) 增加100毫升液体培养。
   1. 在选择性培养基中制备100毫升培养物, 辅以2% 的半乳糖。
   2. 测量隔夜培养物_{的 od 600} , 并计算出在0.3 的开始 od₆₀₀上呈现过度表达文化所需的隔夜培养量。通常情况下, 隔夜文化将达到 0.9-10 的 OD₆₀₀ , 需要约5毫升的隔夜文化来启动100毫升的新鲜文化。
   3. 在半乳糖介质上生长酵母 (见步骤 3.3.1), 在30°c 下晃动 5小时 (FUS 和 TDP-43) 或 8 h (a-sy核能), 从而产生蛋白质过度表达。
4. 在诱导期结束时测量每种文化的 OD₆₀₀ 。将所有单元计数标准化为最低 OD₆₀₀值。在50°c 的温度下, 在 850 x g的离心下进行5分钟的离心, 在50毫升管中收获培养物。放弃上清液。
   注: 如果在诱导结束时测量的 OD 600 值分别为 100 mL 的 a-sy知 ronin 培养和 100 mL 的控制_培养, 则收获 95 ml 的 a-syronin 培养和 67.1 ml 的控制培养。
5. 每培养10毫升, 在1毫升无菌 Dh2o_中再利用颗粒。通过引用细胞重新悬浮到微离心管中的1毫升, 均匀地拆分颗粒。例如, 如果从100毫升培养开始, 将颗粒重新悬浮在无菌_{Dh2o 的}10 毫升中, 并将其划分为10微离心管。
6. 在4°C 下, 以 850 x g 离心 5分钟, 然后去除上清液。在液氮中捕捉冷冻细胞颗粒, 并在-80°c 下储存。
   注: 电池颗粒可在-80°c 下存储长达一年。

4. 细胞裂解和西部印迹检测组蛋白翻译后修饰

1. 细胞裂解
   1. 在冰上解冻酵母细胞颗粒, 并在100μl 的 Dh2o_中重新悬浮细胞颗粒。
   2. 在细胞再悬浮液中, 加入 300Μl 0.2 M NaOH 和 20μl 2-硫代乙醇。通过上下移液进行重新扫描。
   3. 在冰上加生细胞 10分钟, 然后在桌面离心机上离心 30分钟, 丢弃上清液。
   4. 在100μl 的1X 加载染料中重新使用细胞颗粒, 并在加热块上煮沸10分钟。
      注: 6个加载染料的配方可在材料表中找到。
2. 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和膜转移
   1. 准备凝胶室, 将两个凝胶放在凝胶支架中, 用运行的缓冲液将内腔填充到顶部, 并将外腔填充到两个凝胶线标记中。
   2. 将每口井4.1.4 步骤中的15μl 样品加载到10井12% 的聚丙烯酰胺凝胶中。对于蛋白质阶梯通道, 加载5μl。
   3. 在 150 V 处运行凝胶约 45分钟, 或直到加载染料前到达凝胶底部。
   4. 在凝胶运行过程中, 通过将纤维垫 (每凝胶 2个) 浸泡在转移缓冲液中 (材料表) 和将聚偏氟乙烯 (pvdf) 膜浸泡在甲醇中进行膜转移做好准备。在转移前在转移缓冲液中冲洗膜。
      注: PVDF 膜应切割成凝胶的大小, 并使用一个 PVDF 膜的每一个被转移的凝胶。
   5. 组装, 在半干转移设备电池上, 转移 "三明治": 从底部电极, 地方 (1) 预涂纤维垫, (2) 预置和冲洗 PVDF 膜, (3) 凝胶从步骤 4.2.3, 和 (4) 第二压覆纤维垫。
      注: 请务必避免转移 "三明治" 中的气泡。用血清学上的移液轻轻滚动 "三明治", 以迫使气泡。一旦凝胶被放置在 PDVF 膜的顶部, 一定不要移动它。
   6. 通过将功率包设置为 150 mA 1小时 (对于一个 "三明治") 进行蛋白质转移。
3. 组蛋白 Ptm 的修饰特异性抗体检测
   1. 从转移装置中取出膜。用_{Dh2o 短暂}冲洗。
      1. (可选) 用 Ponceau-S 染色检查蛋白质的转移, 将足够的 Ponceau-S 染色覆盖一个小塑料盒中的膜, 并在 RT 中轻轻晃动 30-60 s. 去除 Ponceau-S 染色,用 dh2o 冲洗直到背景染色消失, 蛋白质带是可见的肉眼。继续用 Dh2o_冲洗,直到从膜上去除所有污渍。
   2. 用三分体缓冲盐 (TBS) 阻滞缓冲液 (材料表) 在一个小的染色盒中用温和的摇摇作用, 用孵育片在 Rt 孵育膜1小时的块膜。使用足够的阻塞缓冲区来覆盖印迹。
      注意: 请注意将膜直立放置在染色盒中, 以便蛋白质所在的膜侧不会朝下。
   3. 在4°C 时, 用组蛋白修饰特异性抗体对酵母进行反应, 在染色盒中隔夜培养印迹。根据制造商的规格稀释 TBS 阻滞缓冲液中的抗体。还包括适当的核负荷控制, 例如在不同宿主物种中提出的反总量 H3 与改性特异性抗体不同。例如, 如果使用在兔体内培养的抗 H3S10ph 抗体探测 H3S10ph, 请使用在小鼠体内培养的抗总 H3 抗体作为负载控制。根据需要对每个污点重复此操作。
      注: 抗体稀释可在一个月内总共重复使用三次。将它们存放在4°c。
   4. 将膜4x 在自制 TBS + 0.1% 聚山梨酸盐 20 (TBST) 中清洗 5分钟, 并在 RT 摇晃。
   5. 在制造商指定的稀释剂 (驴抗兔680和驴抗鼠) 下, 用荧光二级抗体在 RT 中培养1小时的荧光二次抗体。
      注: 在储存和使用过程中, 必须保护荧光二级抗体不受光线照射。在深色塑料盒或铝箔盖中孵育。
   6. 用 TBST 清洗膜 4x 5分钟, 在 RT 摇晃时用 TBS 清洗5分钟。
   7. 可视化荧光西方印迹成像系统上的印迹 2分钟, 分别在800纳米和700纳米通道中可视化抗兔680和抗鼠800次抗体。
      注: 从第1节开始独立执行复制。为了在这些实验中进行适当的数据解释, 有必要验证抗体信号响应是否在信号响应是线性的范围内。

5. 数据分析和统计

1. 在成像软件 (材料表) 中打开印迹的图像。通过绘制一个矩形, 在分析模式下对波段进行框架, 获取矢量控制、TDP-43 和 FUS (或矢量控制和 a-sy核能) 样本中修改特定波段的原始密度。
2. 对加载控制频段重复步骤5.1。
   注: 每个示例中将有一个加载控制带和一个特定于修改的波段。
3. 通过将每个波段除以矢量控制样本中相应波段的密度来计算修改特定波段的相对密度。这将数据规范化到矢量控制。
4. 通过将每个波段除以矢量控制样本中相应加载控制带的密度来计算加载控制带的相对密度。
5. 通过将修改特定波段的相对密度除以每个样本的加载控制带的相对密度来计算每个波段的调整相对密度。现在, 数据可以以直方图的形式可视化。
   注: 为了便于处理, 步骤5.3–5.5 可以在电子表格中完成 (补充文件)。
6. 在多次独立复制后, 在两个对照样本和适当的蛋白质病模型 (对照与 FUS、对照与 TDP-43、对照与 A-SY核素) 之间进行 Welch 的 t-测试, p = 0.05 作为意义上的截止点.

Results

为了说明这个方法, 我们将利用最近发布的结果³⁰。WT 人 FUS 和 TDP-43 被过度表达 5小时, 而 WT α-合核蛋白被过度表达8小时。将 ccdB 构造用作矢量负控制。图 2显示了固体和液体培养物中的生长抑制。酵母被收获了, 并且西部印迹与修改特异性抗体被执行。采用抗总 H3 作为加载控制。在 FUS 过度表达模型中, H3S10ph 和 H3S10ph 的水平明显下降 (图 3a, b)。TDP-43 过度表达模型中 H4K12 和 H4K12 的乙酰化水平显著增加, 在 FUS 或α-合核蛋白过度表达模型中都没有观察到 (图 3c, d)。α-核蛋白过度表达模型中 H3K36me2 和 H2BT129ph 的水平也显著下降 (

Discussion

这里描述的协议提供了一种简单、方便和具有成本效益的方法, 可对与神经退行性蛋白病变相关的全基因组蛋白组蛋白 PTM 变化进行分类。虽然 als 和 PD 还有其他模型, 如体外人类细胞系和小鼠模型³², 但由于其易用性,酿酒酵母仍然很有吸引力。例如, 酵母模型不需要使用无菌罩, 也不需要在细胞培养工作的同时进行强化培训。此外, 酵母的培养试剂也比哺乳动物细胞培养用品更实惠。酵母模型不仅揭示了蛋白质聚集^{22、23、24、25、26的领域}决定因素, 而且还揭示了遗传风险在 ALS²⁷中的因素, 以及蛋白质聚集毒性的改性^{剂 22}。此外, 还发现...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
-His DO 补充剂	Clontech	630415
10x 跑步缓冲液			混合物：141.65 g 甘氨酸 （ThermoFisher BP381-1）、30.3 g Tizma 碱 （Sigma-Aldrich T6066）、10 g 十二烷基硫酸钠 （Sigma-Aldrich L3771） 和 1 L 去离子水，pH 8.8。
12% 聚丙烯酰胺凝胶	BIO-RAD	456-1041
2-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M3148
抗乙酰组蛋白 H3 （Lys14） 一抗	MilliporeSigma	07-353（批号 2762291）	稀释度：1/1000
抗乙酰组蛋白 H4 （Lys 16） 一抗	Abcam	ab109463（批号GR187780）	稀释度：1/2000
抗乙酰组蛋白 H4 （Lys12） 一抗	Abcam	ab46983（批号）GR71882）	稀释度：1/5000
抗二甲基组蛋白 H3 （Lys36） 一抗	Abcam	ab9049（批号）GR266894、GR3236147）	稀释度：1/1000
抗组蛋白 H3 一抗	Abcam	ab24834（批号。GR236539、GR174196、GR3194335）	核负载控制;稀释度：1/2000
抗磷酸化组蛋白 H2B （Thr129） 一抗	Abcam	ab188292（批号）GR211874）	稀释度：1/1000
抗磷酸化组蛋白 H3 （Ser10） 一抗	Abcam	ab5176（批号）GR264582、GR192662、GR3217296）	稀释度：1/1000
生物光度计 D30	Eppendorf	6133000010
细胞培养皿 （100 x 20 mm）	Eppendorf	30702118
细胞培养板，96 孔	Eppendorf	30730011
离心机 5804/5804 R/5810/5810 R	Eppendorf	22625501
驴抗小鼠 IRDye 800 CW	LI-COR	926-32212（批号C60301-05、C61116-02、C80108-05）	稀释度：1/5000
驴抗兔 IRDye 860 RD	LI-COR	926-68073（批号C60217-06、C70323-06、C70601-05、C80116-07）	稀释度：1/2500
乙醇	Sigma-Aldrich	E7023
超厚印迹纸（滤纸）	BIO-RAD	1703968
半乳糖	Sigma-Aldrich	G0750	制备 20% w/v 储备液。
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270	制备 20% w/v 储备溶液。
甘油	Sigma-Aldrich	G5516	制备 50 % w/v 溶液。
Immobilon-FL 转移膜	MilliporeSigma	IPFL00010
乙酸锂二水合物 （LiAc）	Sigma-Aldrich	L4158	制备 1 M 溶液。
上样染料			混合物：1.2 g 十二烷基硫酸钠、6 mg 溴酚蓝 （Sigma-Aldrich B8026）、4.7 mL 甘油、1.2 mL 0.5M Trizma 碱 pH 6.8、0.93 g DL-二硫苏糖醇 （Sigma-Aldrich D0632） 和 2.1 mL 去离子水。
甲醇	ThermoFisher	A412-4
Mini-PROTEAN Tetra 垂直电泳槽	BIO-RAD	1658004
多通道移液器	Eppendorf	2231300045
NEB 限制性内切酶缓冲液 2.1,10x	New England Bio Labs	102855-152
Nhe I 限制性内切酶	New England Bio Labs	101228-710
无核酸酶水	Qiagen	129114
Odyssey Fc 成像系统	LI-COR Biosciences	2800-03
OmniTray 细胞培养物，带盖无菌，PS （86 x 128 mm）	ThermoFisher	165218
pAG303GAL-a-突触核蛋白-GFP	来自 A. Gitler
pAG303GAL-ccdB	Addgene	14133
的礼物pAG303Gal-FUS	Addgene	29614
pAG303GAL-TDP-43	来自 A. Gitler
聚乙二醇 （PEG）	Sigma-Aldrich	P4338	的礼物 准备 50% w/v 溶液。
丽春红 S 染色	Sigma-Aldrich	P3504	混合物：0.5 g 0.1% w/w 丽春红 S 染料、5 mL 1% v/v 乙酸（Sigma-Aldrich 320099）和 500 mL 去离子水。
PowerPac 基本电源	BIO-RAD	164-5050
棉子糖五水合	Sigma-Aldrich	R7630	准备 10% w/v 储备溶液。
鲑鱼精子 DNA	Agilent Tech	201190
SD-His 板			混合物：20 g 琼脂 （Sigma-Aldrich A1296）、0.77 g -His DO 补充剂、6.7 g 酵母氮碱（不含氨基酸）和 900 mL 去离子水。
SGal-His 板			混合物：20 g 琼脂、0.77 g -His DO 补充剂、6.7 g 不含氨基酸的酵母氮碱、100 mL 半乳糖溶液和 900 mL 去离子水。
十二烷基硫酸钠上样缓冲液			储存在 -20 oC。6X，混合：1.2 g 十二烷基硫酸钠、6 mg 溴酚蓝、0.93 g DL-二硫苏糖醇、2.1 mL 去离子水、4.7 mL 甘油和 1.2 mL 0.5 M Trizma 碱，pH 6.8。
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	221465	制备 0.2 M 溶液。
蔗糖	Sigma-Aldrich	84097	制备 20% w/v 储备液。
TBS + 0.1% 吐温 20 （TBST）			混合物：100 mL 10X TBS、1 mL 吐温 20 （Sigma-Aldrich P7949） 和 900 mL 去离子水。
TBS 封闭缓冲液	LI-COR	927-5000
Trans-Blot SD 半干电泳转移槽	BIO-RAD	170-3940
转移缓冲液			混合物：22.5 g 甘氨酸、4.84 g Tizma 碱、400 mL 甲醇、1 g 十二烷基硫酸钠和 1.6 L 去离子水。
Tris 缓冲盐水 （TBS）			10X，7.6 pH 值，溶液：混合 24 g Trizma 碱和 88 g 氯化钠 （Sigma-Aldrich S7653）。用去离子水填充至 1 L。
WT 303 酿酒酵母酵母	J. Shorter
酵母提取物蛋白胨葡萄糖 （YPD）	Sigma-Aldrich	Y1375