本方案概述了在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）模型中，针对与肌萎缩侧索硬化症（ALS）和帕金森病相关蛋白过表达所引发的组蛋白翻译后修饰（PTM）全基因组水平变化的表征实验流程。经SDS-PAGE分离后，通过特异性识别修饰位点的抗体，利用蛋白质印迹法（Western blotting）检测各组蛋白PTM的水平。
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本文内容
摘要
摘要
神经退行性疾病（如肌萎缩侧索硬化症（ALS）和帕金森病（PD））每年导致数十万人死亡。目前尚缺乏能够阻止疾病进展的有效治疗手段。尽管已在大规模患者群体中开展了广泛的测序工作，但大多数ALS和PD病例仍无法仅通过基因突变加以解释。表观遗传机制（如组蛋白蛋白的翻译后修饰）可能参与了神经退行性疾病的病因及进展过程，并为药物干预提供新的靶点。用于研究ALS和PD的哺乳动物体内和体外模型成本高昂，且通常需要耗时且繁琐的实验流程。本文介绍了一种实用、快速且经济高效的方法，利用Saccharomyces cerevisiae作为模型系统，检测组蛋白修饰水平的全基因组变化。该实验方案可全面探究与神经退行性蛋白病相关的表观遗传改变，不仅验证了在其他模型系统中已有的发现，还显著拓展了我们对神经退行性疾病表观基因组的认识。
引言
神经退行性疾病是毁灭性的疾病，目前几乎没有有效的治疗手段。在这些疾病中，肌萎缩侧索硬化症（ALS）和帕金森病（PD）尤为严重。大约90%的ALS和PD病例属于散发性，即无家族病史，其余病例则具有家族遗传性，通常与特定的基因突变相关1,2。有趣的是，这两种疾病均与蛋白质的错误定位和聚集有关3,4,5,6。例如，肉瘤融合蛋白（FUS）和TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）是RNA结合蛋白，在ALS中会错误地定位至细胞质并发生聚集7,8,9,10,11,12，而α-突触核蛋白（α-synuclein）则是PD中被称为路易小体（Lewy bodies）的蛋白质聚集体的主要成....
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方案
1. 用与神经退行性蛋白病相关的蛋白构建体转化S. cerevisiae
- 在30 °C、200 rpm振荡条件下，于酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）液体培养基中过夜培养野生型（WT）303酵母。
- 经过12−16小时培养后，将酵母稀释至600 nm处的光密度（OD600将YPD培养基稀释至OD600为0.25。由于每次转化需要10 mL酵母液体培养物，因此共需准备50 mL酵母液体培养物，用于五组转化实验，分别对应FUS、TDP-43、a-synuclein和空载体（ccdB）构建体，以及一组不含DNA的阴性对照转化。
- 在30 °C下振荡培养酵母至OD600 达到0.60至0.80之间，通常需要4−6小时。
- 在酵母生长完成前30分钟，将质粒构建体线性化。
注意：此处使用的质粒构建体必须直接整合到基因组中，因此在转化前需要进行线性化处理。- 计算相当于1 µg的质粒储存液的体积。从44 µL中减去该体积，以计算所需无核酸酶水的量。2O 需要。
- 加入无核酸酶的 H2O，5 µL 10x 限制性内切酶缓冲液（材料表），1 µL NheI 限制性内切酶（材料表），以及步骤 1.4.1 中计算出的适量质粒加入微量离心管中。用移液器反....
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结果
为了说明该方法，我们将利用近期发表的研究结果30。野生型人源 FUS 和 TDP-43 过表达 5 小时，而野生型 α-突触核蛋白过表达 8 小时。使用 ccdB 构建体作为载体阴性对照。图 2 显示了在固体和液体培养基中生长受到抑制的情况。按照所述方法收集酵母，并使用修饰特异性抗体进行蛋白质印迹分析。抗 H3 总抗体用作上样对照。在 FUS 过表达模型中，H3S10 磷酸化（H3S10ph）和 H3K14 乙酰化（H3K14ac）水平显著降低（图 3a、b）。在 TDP-43 过表达模型中，H4K12 和 H4K16 乙酰化水平显著升高，而在 FUS 或 α-突触核蛋白过表达模型中未观察到该现象（图 3c、d）。在 α-突触核蛋白过表达模型中，H3K36 二甲基化（H3K36me.......
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讨论
本文所述方案为一种简单、快速且经济高效的方法，可用于分类与神经退行性蛋白病相关的全基因组组蛋白翻译后修饰变化。尽管还存在其他肌萎缩侧索硬化症和帕金森病模型，例如 体外 人细胞系和小鼠模型32, S. cerevisiae 因其使用简便而仍具吸引力。例如，酵母模型无需使用无菌操作台，也无需进行细胞培养工作所需的大量培训。此外，培养酵母所需的试剂也比哺乳动物细胞培养耗材更为经济实惠。酵母模型已被广泛用于揭示蛋白质聚集的结构域决定因素22,23,24,25,26，而且还推动了肌萎缩侧索硬化症（ALS）遗传风险因素的发现27以及蛋白质聚集毒性的调节因子22<.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢Royena Tanaz、Huda Yousuf和Sadiqa Taasen提供的技术帮助。我们非常感谢James Shorter教授慷慨提供试剂，并在蔗糖梯度实验设计方面给予的学术支持。酵母质粒由Aaron Gitler教授慷慨惠赠（包括303Gal-FUS；Addgene质粒# 29614）。本研究得到布鲁克林学院、高级科学研究中心（CUNY）以及美国国立卫生研究院神经疾病与中风研究所高级博士后过渡奖（K22NS09131401）对M.P.T.的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| -His DO 补充剂 | Clontech | 630415 | |
| 10x 电泳缓冲液 | 配制：141.65 g 甘氨酸（ThermoFisher BP381-1）、30.3 g Trizma 碱基（Sigma-Aldrich T6066）、10 g 十二烷基硫酸钠（Sigma-Aldrich L3771），溶于 1 L 去离子水中，调 pH 至 8.8。 | ||
| 12% 聚丙烯酰胺凝胶 | BIO-RAD | 456-1041 | |
| 2-巯基乙醇 | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| 抗乙酰化组蛋白 H3（Lys14）一抗 | MilliporeSigma | 07-353（批号 2762291） | 稀释比例：1/1000 |
| 抗乙酰化组蛋白 H4（Lys16）一抗 | Abcam | ab109463（批号 GR187780） | 稀释比例：1/2000 |
| 抗乙酰化组蛋白 H4（Lys12）一抗 | Abcam | ab46983（批号 GR71882） | 稀释比例：1/5000 |
| 抗二甲基化组蛋白 H3（Lys36）一抗 | Abcam | ab9049（批号 GR266894, GR3236147） | 稀释比例：1/1000 |
| 抗组蛋白 H3 一抗 | Abcam | ab24834（批号 GR236539, GR174196, GR3194335） | 核蛋白上样对照；稀释比例：1/2000 |
| 抗磷酸化组蛋白 H2B（Thr129）一抗 | Abcam | ab188292（批号 GR211874） | 稀释比例：1/1000 |
| 抗磷酸化组蛋白 H3（Ser10）一抗 | Abcam | ab5176（批号 GR264582, GR192662, GR3217296） | 稀释比例：1/1000 |
| BioPhotometer D30 | Eppendorf | 6133000010 | |
| 细胞培养皿（100 × 20 mm） | Eppendorf | 30702118 | |
| 96 孔细胞培养板 | Eppendorf | 30730011 | |
| Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R | Eppendorf | 22625501 | |
| 驴抗小鼠 IRDye 800 CW | LI-COR | 926-32212（批号 C60301-05, C61116-02, C80108-05） | 稀释比例：1/5000 |
| 驴抗兔 IRDye 860 RD | LI-COR | 926-68073（批号 C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07） | 稀释比例：1/2500 |
| 乙醇 | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| 加厚印迹纸（滤纸） | BIO-RAD | 1703968 | |
| 半乳糖 | Sigma-Aldrich | G0750 | 配制 20% w/v 储存液。 |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G8270 | 配制 20% w/v 储存液。 |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | G5516 | 配制 50% w/v 溶液。 |
| Immobilon-FL 转膜膜 | MilliporeSigma | IPFL00010 | |
| 乙酸锂二水合物（LiAc） | Sigma-Aldrich | L4158 | 配制 1 M 溶液。 |
| 上样缓冲液 | 配制：1.2 g 十二烷基硫酸钠、6 mg 溴酚蓝（Sigma-Aldrich B8026）、4.7 mL 甘油、1.2 mL 0.5 M Trizma 碱基（pH 6.8）、0.93 g DL-二硫苏糖醇（Sigma-Aldrich D0632），加去离子水至总体积 2.1 mL。 | ||
| 甲醇 | ThermoFisher | A412-4 | |
| Mini-PROTEAN Tetra 垂直电泳槽 | BIO-RAD | 1658004 | |
| 多通道移液器 | Eppendorf | 2231300045 | |
| NEB 限制性内切酶缓冲液 2.1，10x | New England Bio Labs | 102855-152 | |
| Nhe I 限制性内切酶 | New England Bio Labs | 101228-710 | |
| 无核酸酶水 | Qiagen | 129114 | |
| Odyssey Fc 成像系统 | LI-COR Biosciences | 2800-03 | |
| OmniTray 细胞培养处理带盖无菌聚苯乙烯培养盘（86 × 128 mm） | ThermoFisher | 165218 | |
| pAG303GAL-a-synuclein-GFP | 由 A. Gitler 惠赠 | ||
| pAG303GAL-ccdB | Addgene | 14133 | |
| pAG303Gal-FUS | Addgene | 29614 | |
| pAG303GAL-TDP-43 | 由 A. Gitler 惠赠 | ||
| 聚乙二醇（PEG） | Sigma-Aldrich | P4338 | 配制 50% w/v 溶液。 |
| Ponceau S 染色液 | Sigma-Aldrich | P3504 | 配制：0.5 g 0.1% w/w Ponceau S 染料、5 mL 1% v/v 乙酸（Sigma-Aldrich 320099），溶于 500 mL 去离子水中。 |
| PowerPac Basic 电源 | BIO-RAD | 164-5050 | |
| 棉子糖五水合物 | Sigma-Aldrich | R7630 | 配制 10% w/v 储存液。 |
| 鲑精 DNA | Agilent Tech | 201190 | |
| SD-His 平板 | 配制：20 g 琼脂（Sigma-Aldrich A1296）、0.77 g -His DO 补充剂、6.7 g 无氨基酸酵母氮源基础（ThermoFisher 291920），溶于 900 mL 去离子水中。 | ||
| SGal-His 平板 | 配制：20 g 琼脂、0.77 g -His DO 补充剂、6.7 g 无氨基酸酵母氮源基础、100 mL 半乳糖溶液，加去离子水至总体积 900 mL。 | ||
| 十二烷基硫酸钠上样缓冲液 | 于 -20 °C 保存。6X 配方：1.2 g 十二烷基硫酸钠、6 mg 溴酚蓝、0.93 g DL-二硫苏糖醇、2.1 mL 去离子水、4.7 mL 甘油、1.2 mL 0.5 M Trizma 碱基（pH 6.8）。 | ||
| 氢氧化钠 | Sigma-Aldrich | 221465 | 配制 0.2 M 溶液。 |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | 84097 | 配制 20% w/v 储存液。 |
| TBS + 0.1% Tween 20（TBST） | 配制：100 mL 10X TBS、1 mL Tween 20（Sigma-Aldrich P7949），加去离子水至总体积 900 mL。 | ||
| TBS 封闭缓冲液 | LI-COR | 927-5000 | |
| Trans-Blot SD 半干式电转移槽 | BIO-RAD | 170-3940 | |
| 转膜缓冲液 | 配制：22.5 g 甘氨酸、4.84 g Trizma 碱基、400 mL 甲醇、1 g 十二烷基硫酸钠，加去离子水至总体积 1.6 L。 | ||
| Tris 缓冲盐水（TBS） | 10X，pH 7.6：配制 24 g Trizma 碱基和 88 g 氯化钠（Sigma-Aldrich S7653），加去离子水至 1 L。 | ||
| WT 303 S. cerevisiae 酵母 | 由 J. Shorter 惠赠 | ||
| 酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基 | Sigma-Aldrich | Y1375 |
参考文献
- Landgrave-Gómez, J., Mercado-Gómez, O., Guevara-Guzmán, R. Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 58(2015).
- Paez-Colasante, X., Figueroa-Romero, C., Sakowski, S. A., Goutman, S. A., Feldman, E. L.
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