通过染后染色法在聚丙烯酰胺凝胶中对芒果标记的RNA进行荧光可视化

摘要

本文介绍一种灵敏、快速且具有高分辨能力的凝胶后染色方法，可用于对带有RNA Mango适体I、II、III或IV标记的RNA进行成像，适用于天然或变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）凝胶。在完成标准PAGE电泳后，可使用TO1-Biotin对带有Mango标签的RNA进行简便染色，并利用常见的荧光成像仪进行分析。

摘要

天然聚丙烯酰胺凝胶和变性聚丙烯酰胺凝胶分别常规用于表征核糖核蛋白（RNP）复合物的迁移行为以及测定RNA的大小。由于许多凝胶成像技术依赖非特异性染料或昂贵的荧光探针，因此亟需灵敏、具有分辨能力且经济的凝胶成像方法。RNA Mango核心序列是一类较小的（19–22 nt）序列基序，当被任意RNA茎结构封闭时，可简便且低成本地添加至目标RNA上。这些Mango标签能够以高亲和力和特异性结合一种称为TO1-Biotin的噻唑橙类荧光配体，该配体在结合后荧光信号可增强数千倍。本文展示了Mango I、II、III和IV可用于在凝胶中以高灵敏度特异性成像RNA。在含有钾离子和20 nM TO1-Biotin的成像缓冲液中浸泡30分钟，即可检测到天然凝胶中低至62.5 fmol的RNA以及变性凝胶中低至125 fmol的RNA。我们通过在复杂的总细菌RNA混合物背景下对带有Mango标签的6S细菌RNA进行成像，验证了Mango标记系统的特异性。

引言

Mango 是一种RNA标记系统，由四个小型荧光RNA适体组成，这些适体可紧密（纳摩尔级结合）结合噻唑橙的简单衍生物（TO1-生物素，图1A）^1,2,3。结合后，该配体的荧光强度根据具体适体的不同可增强1,000至4,000倍。Mango系统的高亮度（其中Mango III的亮度超过增强型绿色荧光蛋白eGFP）结合RNA Mango适体的纳摩尔级结合亲和力，使其既可用于RNA复合物的成像，也可用于其纯化^2,4。

Mango I⁵、II⁶ 和 III⁷ 的X射线结构已获得高分辨率解析，这三种适体均利用RNA四链体结构结合TO1-生物素（图1B–D）。这三种适体的紧凑核心均通过紧凑的衔接基序与外部RNA序列隔离。Mango I和II均采用一种柔性的类似GNRA环的衔接结构，将其Mango....

方案

1. 试剂的准备

1. TO1-生物素后染色溶液（凝胶染色溶液）
   1. 通过将342 mL的1 M Na₂HPO₄与158 mL的1 M NaH₂PO₄混合，配制1 L pH 7.2（25 °C）的1 M磷酸盐缓冲液。通过加入适量磷酸盐溶液，将pH调整至50 mM条件下的7.2。使用0.2 µm滤器进行无菌过滤，并将溶液储存于塑料器皿中，室温保存。
   2. 按如下方法配制5x凝胶染色溶液（不含TO1-生物素）：将247.5 mL ddH₂O、700 mL的1 M KCl、50 mL的1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.2）和2.5 mL Tween 20混合，定容至1 L。使用0.2 µm滤器进行无菌过滤，并将溶液储存于塑料器皿中。可室温保存。
      注：如有需要，可向该溶液中添加MgCl₂，因其可能有助于稳定RNA复合物。这将对荧光信号产生轻微影响²。
   3. 使用步骤1.1.2中的5x凝胶染色溶液配制1x凝胶染色溶液，并在使用前立即加入TO1-生物素荧光染料（见材料表），使其终浓度为20 nM。例如，将20 mL的5x凝胶染色溶液加入80 mL去离子水中，制成100 mL的1x凝胶染色溶液，然后加入2 µL以二甲基甲....

结果

短芒果标记的RNA的制备方法如方案部分所述。假设在变性条件下由于凝胶中含有尿素，荧光信号最难观测，因此我们首先研究了芒果适配体对尿素的耐受性，尿素是一种核酸变性剂。我们发现，芒果适配体在尿素浓度高达约1 M时仍具有显著的抗变性能力（图2A）。在向变性凝胶中添加染色液之前，凝胶中尿素的终浓度为6 M。因此，加入足量的染色液将尿素浓度降低至1 M，将最有利于四种适配体均呈现完全的芒果荧光。实际操作中，染色方案所达到的效果略低于此最优状态，但若需要，可通过增加染色液体积或在染色过程中更换一次染色液的简便方法加以纠正。

将Mango标记的RNA构建体在变性凝胶中电泳后，通过在8%变性凝胶中加入三种不同量的Mango III来优化染色时间，以获得最大凝胶荧光信号（图2B）。时间进程显示，染色液浸泡5分钟后即可清晰观察到荧光信号。Mango III构建体的最大荧光信号在染色20–40分钟后达到，此.......

讨论

Mango 荧光标记的一个显著优势在于，单个标记可实现多种用途。这些适配体具有高亮度和高亲和力，不仅可用于细胞内成像²，还可用于体外 RNA 或核糖核蛋白复合物（RNP）的纯化⁴。因此，凝胶成像以一种直接的方式进一步拓展了 Mango 标记的多功能性。Mango 凝胶成像的灵敏度略低于 Northern 印迹法¹⁴，但无需耗时且繁琐的膜转移和探针杂交步骤，即可轻松检测到 60–120 fmol 的 RNA 样品。该检测效率与先前报道的小 RNA 在凝胶中基于杂交探针的检测效率相当¹⁵。尽管其他荧光生成型适配体技术——特别是 RNA Spinach——具有更高的灵敏度和特异性⁹，但目前尚无其他方法能同时具备 Mango 适配体系统所拥有的高亮度和高亲和力，这使得单一 RNA 标记可用于细胞成像、RNP 纯化，以及现在的凝胶成像。

该凝胶染色实验方案.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
用于30 mL PAGE凝胶的0.8 mm厚14孔梳子	LabRepCo	11956042
101-1000 µL  提示	Fisher	02-707-511
20-200 µL 低保留率  提示	Fisher Scientific	02-717-143
丙烯酰胺:N,N'-亚甲基双丙烯酰胺（40%，19:1）	生物试剂	BP1406-1	急性毒性
丙烯酰胺:N,N'-亚甲基双丙烯酰胺（40%，29:1）	Fisher	BP1408-1	急性毒性
琼脂	Anachemia	02116-380
铝箔背衬的薄层色谱板	Sigma-Aldrich	1164840001
Amersham Imager 600	GE Healthcare Lifesciences	29083461
过硫酸铵	伯乐（Bio-Rad）	161-0700	有害的
BL21细胞	NEB	C2527H
硼酸	酸性磷酸酶	B-2940
溴酚蓝钠盐	Sigma	B8026-25G
氯仿	酸性磷酸酶	C3300
二硫苏糖醇	Sigma Aldrich 醇类	D0632-5G
DNase I	赛默飞世尔科技	EN0525
EDTA 二钠盐	酸性磷酸酶	E-4320
乙醇	商业	P016EAAN
平胶加样提示	Costar	CS004854
甲酰胺 99%	Alfa Aesar	A11076
凝胶电泳装置安装好间隔条和梳子	LabRepCo	41077017
带塑料盖的玻璃培养皿	Pyrex	1122963	应足够大以容纳你的胶块
甘油	Anachemia	43567-540
HCl	Anachemia	464140468
ImageQuanTL	GE Healthcare Lifesciences	29000605
IPTG	Invitrogen	15529-019
KCl	酸性磷酸酶	P-2940
MgCl2	坩埚	4903-01
MgSO4	Sigma-Aldrich	M3409
NaCl	酸性磷酸酶	S-2830
NaOH	BDH	BDH9292
轨道旋转器	Lab-Line
苯酚	Invitrogen	15513-039
圆形凝胶上样吸头	Costar	CS004853
磷酸氢二钠	坩埚	8120-1
磷酸二氢钠	坩埚	8180-01
SYBRGold	赛默飞世尔科技	S11494
T7 RNA 聚合酶	ABM	E041
TEMED	Sigma-Aldrich	T7024-50 ml
TO1-3PEG-Biotin 氟染料	ABM	G955
Tris碱	Fisher	BP152-500
胰蛋白胨	Fisher	BP1421-500
Tween-20	Sigma	P9496-100
尿素	Fisher	U15-3
二甲苯青	Sigma	X4126-10G
酵母提取物	Bioshop	YEX401.500