通过染后染色法在聚丙烯酰胺凝胶中对芒果标记的RNA进行荧光可视化

摘要

本文介绍一种灵敏、快速且具有高分辨能力的凝胶后染色方法，可用于对带有RNA Mango适体I、II、III或IV标记的RNA进行成像，适用于天然或变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）凝胶。在完成标准PAGE电泳后，可使用TO1-Biotin对带有Mango标签的RNA进行简便染色，并利用常见的荧光成像仪进行分析。

摘要

天然聚丙烯酰胺凝胶和变性聚丙烯酰胺凝胶分别常规用于表征核糖核蛋白（RNP）复合物的迁移行为以及测定RNA的大小。由于许多凝胶成像技术依赖非特异性染料或昂贵的荧光探针，因此亟需灵敏、具有分辨能力且经济的凝胶成像方法。RNA Mango核心序列是一类较小的（19–22 nt）序列基序，当被任意RNA茎结构封闭时，可简便且低成本地添加至目标RNA上。这些Mango标签能够以高亲和力和特异性结合一种称为TO1-Biotin的噻唑橙类荧光配体，该配体在结合后荧光信号可增强数千倍。本文展示了Mango I、II、III和IV可用于在凝胶中以高灵敏度特异性成像RNA。在含有钾离子和20 nM TO1-Biotin的成像缓冲液中浸泡30分钟，即可检测到天然凝胶中低至62.5 fmol的RNA以及变性凝胶中低至125 fmol的RNA。我们通过在复杂的总细菌RNA混合物背景下对带有Mango标签的6S细菌RNA进行成像，验证了Mango标记系统的特异性。

引言

Mango 是一种RNA标记系统，由四个小型荧光RNA适体组成，这些适体可紧密（纳摩尔级结合）结合噻唑橙的简单衍生物（TO1-生物素，图1A）^1,2,3。结合后，该配体的荧光强度根据具体适体的不同可增强1,000至4,000倍。Mango系统的高亮度（其中Mango III的亮度超过增强型绿色荧光蛋白eGFP）结合RNA Mango适体的纳摩尔级结合亲和力，使其既可用于RNA复合物的成像，也可用于其纯化^2,4。

Mango I⁵、II⁶ 和 III⁷ 的X射线结构已获得高分辨率解析，这三种适体均利用RNA四链体结构结合TO1-生物素（图1B–D）。这三种适体的紧凑核心均通过紧凑的衔接基序与外部RNA序列隔离。Mango I和II均采用一种柔性的类似GNRA环的衔接结构，将其Mango核心连接至任意RNA双链（图1B、C）。相比之下，Mango III则利用一种刚性的三链体基序将其核心连接至任意RNA螺旋（图1D，紫色残基），而Mango IV的结构目前尚未明确。由于这些适体的配体结合核心均通过螺旋衔接结构与外部RNA序列分离，因此它们很可能均可被简单地整合到多种RNA中。已有研究成功将细菌6S调控RNA（Mango I）、酵母剪接体组分（Mango I）以及人源5S RNA、U6 RNA和一种C/D型scaRNA（Mango II和IV）以这种方式标记^2，8，表明许多生物RNA均可利用RNA Mango适体系统进行标记。

变性凝胶和非变性凝胶常用于RNA研究。变性凝胶通常用于判断RNA大小或RNA加工情况，但在例如Northern印迹等情况下，通常需要多个缓慢且连续的步骤才能获得图像。尽管其他RNA荧光适体（如RNA Spinach和Broccoli）已成功用于凝胶成像⁹，但迄今为止，尚无任何荧光适体系统具备Mango系统所拥有的高亮度和高亲和力，因此探索Mango系统的凝胶成像能力具有重要意义。在本研究中，我们探讨了RNA Mango系统是否可简单地拓展应用于凝胶成像，因为TO1-Biotin的激发和发射波长（分别为510 nm和535 nm）适用于大多数荧光凝胶扫描仪器中常见的eGFP通道进行成像。

本文介绍的胶后染色方案可快速、特异性地检测天然态和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）凝胶中的Mango标记RNA分子。该染色方法包括将凝胶浸泡在含有钾离子和TO1-Biotin的缓冲液中。RNA Mango适体基于G-四链体结构，而钾离子是稳定此类结构所必需的。利用由最小Mango编码DNA模板转录的RNA（见方案部分），通过这一简单的染色流程，我们可在天然凝胶中检测到低至62.5 fmol的RNA，在变性凝胶中可检测到125 fmol的RNA。与常用的非特异性核酸染料（见材料表，下文简称SG）相比，即使样品中含有高浓度的总未标记RNA，我们仍能清晰识别出Mango标记的RNA。

方案

1. 试剂的准备

1. TO1-生物素后染色溶液（凝胶染色溶液）
   1. 通过将342 mL的1 M Na₂HPO₄与158 mL的1 M NaH₂PO₄混合，配制1 L pH 7.2（25 °C）的1 M磷酸盐缓冲液。通过加入适量磷酸盐溶液，将pH调整至50 mM条件下的7.2。使用0.2 µm滤器进行无菌过滤，并将溶液储存于塑料器皿中，室温保存。
   2. 按如下方法配制5x凝胶染色溶液（不含TO1-生物素）：将247.5 mL ddH₂O、700 mL的1 M KCl、50 mL的1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.2）和2.5 mL Tween 20混合，定容至1 L。使用0.2 µm滤器进行无菌过滤，并将溶液储存于塑料器皿中。可室温保存。
      注：如有需要，可向该溶液中添加MgCl₂，因其可能有助于稳定RNA复合物。这将对荧光信号产生轻微影响²。
   3. 使用步骤1.1.2中的5x凝胶染色溶液配制1x凝胶染色溶液，并在使用前立即加入TO1-生物素荧光染料（见材料表），使其终浓度为20 nM。例如，将20 mL的5x凝胶染色溶液加入80 mL去离子水中，制成100 mL的1x凝胶染色溶液，然后加入2 µL以二甲基甲酰胺配制的1 mM TO1-生物素储备液。
      注：TO1-生物素染料在500 nm处的消光系数为63,000 M^-1·cm^-1，在染色溶液中测得¹。
2. 变性PAGE（2x变性凝胶上样溶液及溶液A、B、C、过硫酸铵和四甲基乙二胺）
   1. 通过混合40 mL甲酰胺、0.5 mL的0.5 M乙二胺四乙酸（EDTA，pH 8.0）和9.5 mL ddH₂O，配制50 mL的2x变性凝胶上样溶液。该溶液可室温保存。此溶液中不添加上样染料，以免干扰荧光成像。
   2. 按如下方法配制2x变性凝胶上样染料：在RNA和DNA寡核苷酸纯化过程中，向步骤1.2.1所述溶液中加入0.5 mL的2.5%（w/v）溴酚蓝（BB）和0.5 mL的2.5%（w/v）二甲苯青（XC），并将ddH₂O的体积由9.5 mL调整为8.5 mL。该溶液可室温保存。
   3. 通过称取200.2 g尿素（分子量：60.06 g/mol）并加入312.5 mL的40% 19:1丙烯酰胺:N,N'-亚甲基双丙烯酰胺，配制100 mL溶液A。使用磁力搅拌器以最大速度搅拌至完全溶解（约3小时），然后用ddH₂O定容至500 mL。注意最终浓度为6.667 M尿素和25% 19:1丙烯酰胺:N,N'-亚甲基双丙烯酰胺。将溶液储存于4 °C洁净塑料器皿中。
   4. 通过称取400.4 g尿素并用ddH₂O定容至1 L，配制1 L溶液B；持续搅拌直至尿素完全溶解。溶液B可室温保存。
   5. 按如下方法配制溶液C（10x Tris-硼酸-EDTA [TBE]）：称取432 g Tris碱和220 g硼酸，加入160 mL pH 8的0.5 M EDTA（已过滤），并用ddH₂O定容至4 L，配制4 L的10x TBE。该缓冲液大量配制，因其也用作凝胶电泳运行缓冲液。
   6. 通过将1 g过硫酸铵（APS）溶解于10 mL ddH₂O中，配制10%过硫酸铵溶液。4 °C保存。
   7. 准备好四甲基乙二胺（TEMED）。与APS溶液一同在4 °C保存。
3. 非变性PAGE（2x非变性凝胶上样溶液）
   1. 通过混合25 mL的100%甘油、10 mL的5x凝胶染色溶液和15 mL的ddH₂O，配制50 mL的2x非变性凝胶上样溶液，定容至50 mL。
      注：与变性凝胶部分相同，可向该储备液中添加上样染料，但其可能干扰凝胶中的荧光信号，因此应避免添加。

2. 变性凝胶的制备与上样

1. 根据表1配制适当浓度的变性凝胶。考虑所用的具体凝胶制备系统，通常使用30 mL的凝胶。可通过表2估算合适的凝胶浓度：选择聚丙烯酰胺浓度，使溴酚蓝（BB）和二甲苯氰（XC）染料的迁移速率分别快于和慢于目标RNA，以确保在相关大小范围内实现良好的条带分离。
2. 按照表1混合溶液A、B和C，并在灌胶前立即加入APS和TEMED。使用洁净的塑料器皿充分混匀溶液。
3. 在确认所有组件均已彻底清洁后，将凝胶溶液倒入合适的凝胶制备装置中。灌胶时抬起装置的一侧，使凝胶略微倾斜，以避免凝胶内部截留气泡。
4. 插入所需的加样梳，静置使其聚合（约30分钟）。通过仔细观察凝胶加样孔周围折射率的变化来判断聚合是否完成。使用1x溶液C（1x TBE）填充电泳槽，小心移除加样梳。在上样前，用注射器抽吸清洗各加样孔。
5. 按以下步骤制备变性样品：向目标RNA样品中加入2x变性凝胶上样缓冲液，使终浓度为1x，然后在95 °C下加热变性5分钟，可使用PCR仪或水浴锅完成。
6. 上样前将样品在室温下冷却数分钟，直至触感凉爽。使用凝胶上样枪头将样品逐层加至每个加样孔底部。
   注意：对于厚度为1 mm或以上的凝胶可使用圆头枪头；较薄的凝胶应使用平头枪头。
7. 在室温下进行变性凝胶电泳。确保功率足够低，以防止凝胶装置的玻璃板破裂。
   注意：在本实验室中，20 cm × 16 cm的玻璃板使用28 W的功率即可满足要求。

3. 天然凝胶的制备与上样

1. 根据表3配制适当浓度的非变性凝胶。需考虑具体的凝胶制备系统，但需注意通常使用30 mL的凝胶。按照表3混合1×TBE、40% 29:1 丙烯酰胺:N,N’-亚甲基双丙烯酰胺和甘油溶液，并在灌胶前立即加入APS和TEMED。随后按照步骤2.3和2.4所述进行操作。
2. 通过向目标RNA样品中加入2×非变性凝胶上样缓冲液，使终浓度为1×，并在室温孵育100分钟后再进行电泳，以确保RNA完全折叠。
3. 在4 °C的冷室中进行非变性凝胶电泳，确保功率足够低，以免产生热量影响凝胶。
   注：在本实验室中，20 cm × 16 cm的电泳板使用14 W的功率即可满足要求。

4. 通过T7体外转录制备RNA

注意：用于RNA Mango结构体的加尾转录¹⁰的DNA序列通过商业途径订购。在本方法中，含有待转录序列及T7启动子的反向互补（RC）序列的DNA寡核苷酸，与T7启动子的上链序列退火后，在体外进行转录。以下每个寡核苷酸中，Mango核心序列的反向互补序列以粗体显示，T7启动子区域的反向互补序列以斜体显示。常规字体的残基对应于其他任意的互补螺旋区域，这些区域有助于Mango核心正确折叠。

芒果 I：GCA CGT ACT CTC CTC TCC GCA CCG TCC CTT CGT ACG TGC CTA TAG TGA GTC GTA TTA AAG
芒果 II：GCA CGT ACT CTC CTC TTC CTC TCC TCT CCT CGT ACG TGC CTA TAG TGA GTC GTA TTA AAG
芒果 III：GGC ACG TAC GAA TAT ACC ACA TAC CAA TCC TTC CTT CGT ACG TGC CTA TAG TGA GTC GTA TTA AAG
芒果 IV：GCA CGT ACT CGC CTC ATC CTC ACC ACT CCC TCG GTA CGT GCC TAT AGT GAG TCG TAT TAA AG
T7 上游链：CTT TAA TAC GAC TCA CTA TAG G

1. DNA寡核苷酸的制备型凝胶纯化
   1. 对于0.2 µmol规模的DNA合成，将去保护的DNA寡核苷酸重悬于100 µL ddH₂O和100 µL 2倍变性上样染料（来自步骤1.2.2）中。此时，上样溶液中的凝胶上样染料浓度应与步骤1.2.2中的浓度相同为宜。
   2. 使用适当聚丙烯酰胺浓度的50 mL制备型变性凝胶纯化DNA寡核苷酸；参考表2选择凝胶浓度。例如，对于50 nt的序列使用8%凝胶。理想情况下，溴酚蓝应比寡核苷酸迁移更快，而二甲苯青应迁移更慢。
      注意：在本实验室中，此类凝胶使用厚度为1.5 mm的灌胶间隔片和宽度为2–2.5 cm的加样梳制备。
   3. 按照步骤2.4–2.7所述，每孔加样100 µL在步骤4.1.2中制备的DNA寡核苷酸溶液至制备型凝胶孔中。
   4. 小心擦干凝胶外表面，取下玻璃板，并用保鲜膜覆盖凝胶两面。将凝胶置于荧光成像屏上（掺入荧光染料的铝背薄层色谱板是一种经济的替代方案），使用短波长紫外手持灯通过紫外阴影法观察DNA条带。
   5. 若DNA合成质量较高，应观察到清晰、界限分明的阴影。用永久性记号笔在保鲜膜上标记条带位置。
      注意：应保护皮肤和眼睛免受紫外线伤害，并尽量缩短照射时间，以避免损伤核酸样品。
   6. 将凝胶置于洁净的玻璃板上，小心切下标记的条带，将每块凝胶碎片放入400 µL 300 mM NaCl溶液中。在室温下使用旋转器过夜洗脱DNA。
   7. 将洗脱液转移至洁净的离心管中，加入2.5倍体积的乙醇以沉淀DNA。充分涡旋混匀，将离心管置于-20 °C下30分钟。
   8. 在台式离心机中于4 °C、156,000 x g离心30分钟收集沉淀。小心弃去上清液，将沉淀重悬于ddH₂O中。使用分光光度计准确测定DNA寡核苷酸浓度。为方便起见，将样品储存为10 μM储备液，置于-20 °C保存。
2. RNA样品的转录延伸反应及凝胶纯化
   1. 通过混合以下液体NTP储备液配制5倍核苷三磷酸（NTP）储备液：终浓度为40 mM三磷酸鸟苷（GTP，11,400 M^-1·cm^-1）、25 mM三磷酸胞苷（CTP，7,600 M^-1·cm^-1）、25 mM三磷酸腺苷（ATP，5,000 M^-1·cm^-1）和10 mM三磷酸尿苷（UTP，10,000 M^-1·cm^-1）；所有消光系数均在260 nm处测定。
      注意：液体或粉末状NTP储备液可商业购得。若由粉末配制母液，需使用1 M NaOH小心调节pH至终pH 7.9。将储备液分装至1.5 mL微量离心管中，于-20 °C保存。
   2. 通过混合25.6 mL 1 M Tris-HCl、14.4 mL 1 M Tris碱、26 mL 1 M MgCl₂、10 mL 10% Triton X-100和0.637 g亚精胺，配制100 mL 10倍T7转录缓冲液储备液。加入ddH₂O定容至100 mL。
      注意：应使用校准的pH计确认1倍溶液的终pH为7.9。10倍溶液应经无菌过滤后，分装保存于-20 °C。
   3. 按以下步骤进行转录反应。
      1. 加入以下试剂，使用10倍T7转录缓冲液储备液和ddH₂O（来自步骤4.2.2）配制终浓度为1倍T7转录缓冲液的体系，并包含1倍NTP、10 mM二硫苏糖醇（DTT）、1 μM T7正义链序列（序列见第4节注释）、1 μM经凝胶纯化的Mango DNA序列（步骤2.1）以及T7 RNA聚合酶（1 U/µL）。
      2. 涡旋混匀，短暂离心，于37 °C孵育2小时，或直至溶液变浑浊且管底出现白色沉淀。50 µL转录反应经凝胶纯化后应获得约50 µL ~50 µM的RNA。加入等体积2倍变性染料，于-20 °C保存，待进行凝胶纯化。
   4. 参照DNA寡核苷酸凝胶纯化部分的步骤4.1.2–4.1.8，对所得RNA进行凝胶纯化，仅将样品替换为RNA。
      注意：RNA极易被RNase降解，因此所有操作步骤中必须始终佩戴手套和洁净实验服。确保所有样品均使用一次性塑料器皿制备和储存，以防止RNase污染；使用前用热肥皂水仔细清洗玻璃板，用ddH₂O充分冲洗，并借助挤压瓶喷洒乙醇帮助干燥。
   5. 取1 μL最终RNA样品，使用液滴式分光光度计测定260 nm处的吸光度。根据最近邻法确定的消光系数计算RNA浓度，并用ddH₂O将样品浓度调整至10 μM以便使用。将RNA样品于-20 °C保存。
3. Escherichia coli 总粗提核酸提取
   注意：以下方案为示例。本方案使用在E. coli中由质粒内源表达的Mango I标记的6S RNA，该质粒的诱导表达方法在其他文献中有详细描述⁴。
   1. 本研究中，分别准备500 mL经诱导的pEcoli-RNA Mango和pEcoli-T1质粒转化的细胞（在OD_600nm为1时进行诱导）。离心收集细胞沉淀，并于-80 °C保存备用。
   2. 按以下步骤进行RNA提取。
      1. 取0.5 mL经诱导的pEcoli细胞沉淀，加入500 μL平衡酚。涡旋混匀，溶液将变为乳白色。于最大转速离心2分钟以分离各层。
      2. 吸取上层（略带黄色）液体，并通过加入等体积酚、离心和吸取上层的操作重复步骤4.3.2.1，共进行5次（或直至中间不透明的白色层消失，仅剩两层清晰液体）。
      3. 将经酚提取的水相与等体积氯仿混合，涡旋振荡，然后于最大转速离心2分钟。
      4. 吸取水相，加入NaCl至终浓度300 mM。加入2.5倍体积乙醇沉淀核酸，涡旋混匀，短暂离心，于-20 °C沉淀至少30分钟。
      5. 在台式离心机中于4 °C、15.6 x 1,000 x g离心30分钟收集沉淀。小心弃去上清液，将沉淀重悬于100 μL ddH₂O中。
      6. 在此步骤中加入DNase I消化步骤，参照引用的方案¹¹操作，以获得总RNA。
         注意：需剧烈涡旋，直至沉淀在ddH₂O中完全溶解。

5. 凝胶后染色

1. 按照步骤 1.1.3 中的配方制备 1× 凝胶染色液，并将其加入一个足够宽的洁净玻璃容器中，以便凝胶能轻松放入。
   注意：带卡扣盖的硼硅酸盐玻璃容器非常适合此用途。
2. 向容器中加入足量的 1× 凝胶染色液，确保液体完全覆盖凝胶，并在将容器置于轨道摇床上时能漫过凝胶表面。
   注意：容器必须足够大，使凝胶能够自由移动，同时容器内需有足量缓冲液以完全浸没凝胶。
3. 当天然或变性凝胶电泳完成后（分别见第 2 或第 3 部分），从电泳装置中取出凝胶并切除加样孔。为便于后续分析时确定方向，可切去凝胶的一角作为标记。
4. 小心地将凝胶转移至步骤 5.2 中准备好的 1× 凝胶染色液中。
   注意：凝胶较为脆弱，易断裂，转移时需格外小心。染色过程中应始终盖上容器盖子，以防污染凝胶。
5. 将凝胶置于轨道摇床上，以 100 rpm 的速度在室温下振荡 30 分钟。
   注意：确保凝胶不会折叠重叠，否则 RNA 可能从凝胶中扩散出来，导致凝胶其他区域被错误标记。

6. 在凝胶中成像芒果标记的 RNA

1. 小心倾去成像缓冲液。用清水快速冲洗凝胶，确保留有足够液体使凝胶在容器中保持轻微流动性。
2. 小心将凝胶转移至成像仪上。可通过轻轻提起凝胶边缘，将其放置于成像仪托盘中；或者缓慢将凝胶倒入托盘内。确保凝胶下方无气泡，且无过多液体残留。可用移液器轻轻滚压凝胶表面以去除多余液体。
   注意：使用纸巾吸除多余液体。
3. 采集凝胶图像，检测激发波长510 nm至发射波长535 nm之间的荧光信号（例如，成像仪中设置为520 nm波长的绿色荧光检测模式）。确保仪器参数已完全优化，并严格遵循所用仪器的操作说明。

结果

短芒果标记的RNA按照方案部分所述方法制备。考虑到由于凝胶中含有尿素，在变性条件下荧光最难以观察，我们首先研究了芒果适配体对作为核酸变性剂的尿素的耐受性。我们发现，芒果适配体在尿素浓度高达约1 M时仍具有显著的抗变性能力（图2A）。在向变性凝胶中添加染色液之前，凝胶中尿素的终浓度为6 M。因此，加入足够的染色液将尿素浓度降低至1 M，将最有利于确保全部四种芒果适配体均呈现完全荧光。实际操作中，染色步骤所达到的效果略低于此最优条件，但若需要，可通过增加染色液体积，或在染色过程中更换一次溶液这一简便方法轻易加以纠正。

在将Mango标记的RNA构建体上样至变性凝胶后，通过在8%变性凝胶中加入三种不同量的Mango III，优化染色时间以获得最大凝胶荧光信号（图2B）。时间进程显示，浸泡在凝胶染色液中5分钟后，荧光信号已清晰可见。Mango III构建体的最大荧光信号在染色20–40分钟后达...

讨论

Mango 荧光标记的一个显著优势在于，单个标记可实现多种用途。这些适配体具有高亮度和高亲和力，不仅可用于细胞内成像²，还可用于体外 RNA 或核糖核蛋白复合物（RNP）的纯化⁴。因此，凝胶成像以一种直接的方式进一步拓展了 Mango 标记的多功能性。Mango 凝胶成像的灵敏度略低于 Northern 印迹法¹⁴，但无需耗时且繁琐的膜转移和探针杂交步骤，即可轻松检测到 60–120 fmol 的 RNA 样品。该检测效率与先前报道的小 RNA 在凝胶中基于杂交探针的检测效率相当¹⁵。尽管其他荧光生成型适配体技术——特别是 RNA Spinach——具有更高的灵敏度和特异性⁹，但目前尚无其他方法能同时具备 Mango 适配体系统所拥有的高亮度和高亲和力，这使得单一 RNA 标记可用于细胞成像、RNP 纯化，以及现在的凝胶成像。

该凝胶染色实验方案...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
用于30 mL PAGE凝胶的0.8 mm厚14孔梳子	LabRepCo	11956042
101-1000 µL  提示	Fisher	02-707-511
20-200 µL 低保留率  提示	Fisher Scientific	02-717-143
丙烯酰胺:N,N'-亚甲基双丙烯酰胺（40%，19:1）	生物试剂	BP1406-1	急性毒性
丙烯酰胺:N,N'-亚甲基双丙烯酰胺（40%，29:1）	Fisher	BP1408-1	急性毒性
琼脂	Anachemia	02116-380
铝箔背衬的薄层色谱板	Sigma-Aldrich	1164840001
Amersham Imager 600	GE Healthcare Lifesciences	29083461
过硫酸铵	伯乐（Bio-Rad）	161-0700	有害的
BL21细胞	NEB	C2527H
硼酸	酸性磷酸酶	B-2940
溴酚蓝钠盐	Sigma	B8026-25G
氯仿	酸性磷酸酶	C3300
二硫苏糖醇	Sigma Aldrich 醇类	D0632-5G
DNase I	赛默飞世尔科技	EN0525
EDTA 二钠盐	酸性磷酸酶	E-4320
乙醇	商业	P016EAAN
平胶加样提示	Costar	CS004854
甲酰胺 99%	Alfa Aesar	A11076
凝胶电泳装置安装好间隔条和梳子	LabRepCo	41077017
带塑料盖的玻璃培养皿	Pyrex	1122963	应足够大以容纳你的胶块
甘油	Anachemia	43567-540
HCl	Anachemia	464140468
ImageQuanTL	GE Healthcare Lifesciences	29000605
IPTG	Invitrogen	15529-019
KCl	酸性磷酸酶	P-2940
MgCl2	坩埚	4903-01
MgSO4	Sigma-Aldrich	M3409
NaCl	酸性磷酸酶	S-2830
NaOH	BDH	BDH9292
轨道旋转器	Lab-Line
苯酚	Invitrogen	15513-039
圆形凝胶上样吸头	Costar	CS004853
磷酸氢二钠	坩埚	8120-1
磷酸二氢钠	坩埚	8180-01
SYBRGold	赛默飞世尔科技	S11494
T7 RNA 聚合酶	ABM	E041
TEMED	Sigma-Aldrich	T7024-50 ml
TO1-3PEG-Biotin 氟染料	ABM	G955
Tris碱	Fisher	BP152-500
胰蛋白胨	Fisher	BP1421-500
Tween-20	Sigma	P9496-100
尿素	Fisher	U15-3
二甲苯青	Sigma	X4126-10G
酵母提取物	Bioshop	YEX401.500