本文以小鼠颅面组织为例，详细介绍了一种通过免疫染色检测和定量颅面形态发生/病理发生过程中蛋白质水平的实验方案。此外，我们还描述了一种针对幼鼠未脱钙硬组织进行制备及冷冻切片以用于免疫染色的方法。
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摘要
摘要
组织免疫染色可对特定组织中目标蛋白进行高特异性和可靠的检测。本文以小鼠颅面组织为例，介绍了一套完整且简便的检测颅面形态发生/病理发生过程中蛋白表达的实验方案。该方案包括组织制备与冷冻切片、间接免疫荧光染色、图像采集及定量分析。此外，本文还描述了未脱钙硬组织用于免疫染色的制备与冷冻切片方法，以颅面组织和长骨为例进行说明。这些方法对于研究颅面形态发生/病理发生过程中多种组织内蛋白表达及形态学/解剖学变化至关重要，经适当调整后也可适用于其他组织。组织学知识和高质量切片是基于实验结果得出科学结论的关键。本方法的潜在局限性包括但不限于抗体特异性问题以及定量分析的困难，本文亦对此进行了讨论。
引言
面部是人类身份的关键部分，由多种不同类型的组织构成，例如上皮、肌肉、骨骼、软骨和牙齿。这些组织来源于全部三个胚层：外胚层、内胚层和中胚层1,2。为了颅面组织的正常图式形成和发育，细胞增殖、死亡和分化必须通过特定的信号通路（如Wnt、Fgf、Hh和Bmp通路）进行高度协调和调控3,4,5。细胞增殖、存活或分化过程中的缺陷将导致颅面畸形，这是最常见的先天性出生缺陷之一。转基因小鼠是研究颅面形态发生和疾病发生机制的有用工具1,2,3,4,5。了解颅面结构在发育和疾病发生过程中的变化，有助于阐明关键的发育原理以及颅面畸形的发生机制1,2,3,4,5。
利用特异性抗体对完整组织或切片组织进行染色，是确定目的蛋白空间分布的一种极为重要的技术6。从形式上讲，组织免疫染色可依赖于免疫组织化学（IHC）或免疫荧光（IF）。与IHC使用如3,3’-二氨基联苯胺（DAB）等显色底物产生不透明反应产物相比，IF采用可在荧光显微镜下观察的荧光偶联物。因此，IF能够清晰地区分阳性细胞与背景噪声，并可通过ImageJ和Adobe Photoshop等软件对图像进行直接的定量分析和增强处理7,8。完整组织染色方法适用于较小的组织块（厚度小于5 mm），可在无需从切片重建的情况下提供蛋白/抗原定位的三维信息9,10。然而，与组织切片相比，完整组织免疫染色耗时较长，且需要大量抗体溶液。并非所有抗体都适用于基本的完整组织染色方法。此外，抗体渗透不完全会导致染色不均或出现假阴性结果。本文将重点介绍在切片组织上进行蛋白/抗原的免疫荧光检测。对于硬组织（例如头部、牙齿、长骨），在发育或病理过程中发生的钙盐沉积使得样本难以切片，并在免疫染色处理过程中容易脱落11,12。目前大多数可用的方案在包埋前对硬组织进行脱钙处理以利于切片，但该过程耗时，且若操作不当可能破坏样本的形态结构和抗原性11,12。为克服上述问题，我们优化了一种无需脱钙的硬组织冷冻切片方法，从而显著改善了组织形态及其信号蛋白分布的可视化效果。
本文所述方案用于检测BMP转基因小鼠颅面组织的形态计量学和组织学变化。具体而言，该方案包括：（1）获取并解剖头部组织；（2）对实验标志物（Ki67、pSmad1/5/9）进行切片和免疫染色，同时进行TUNEL染色；（3）使用荧光显微镜对切片成像；最后（4）分析并定量结果。本文还描述了无需脱钙处理硬组织并进行冷冻切片的制备方案13。这些方法针对颅面组织进行了优化，经适当调整后也可适用于不同年龄样本的其他组织。
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方案
所有小鼠实验均按照密歇根大学关于实验动物人道护理与使用的指南进行。本研究中所有动物实验程序均已获得密歇根大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准（方案编号 #PRO00007715）。
1. 组织制备
- 胚胎组织的制备
- 为每只怀孕小鼠准备一个10 cm培养皿和若干3.5 cm培养皿，内含磷酸盐缓冲液（PBS），以及一个12孔培养板，每孔加入2 mL含4%多聚甲醛（PFA）的PBS。将所有培养皿和培养板置于冰上。
注意：操作4% PFA时应在通风橱中进行。 - 使用镊子和剪刀在冰上预冷的PBS中解剖怀孕小鼠的胚胎，方法如前所述14。
- 首先，用CO2处死怀孕小鼠，用镊子夹住腹部中线下方的皮肤并仅切开皮肤，然后轻轻拉起皮肤使其与下方腹肌分离。
- 接着，沿皮肤切口方向切开腹腔，取出含有成串胚胎的子宫，并通过轻轻剪开子宫壁分离出各个胚胎。去除卵黄囊和羊膜等胚外组织。
- 将每个胚胎的头部剪下并分离。
- 使用塑料移液管或镊子将每个头部转移至含有4% PFA的12孔板的各孔中。在4 °C条件下用4% PFA固定样本4小时，随后在4 °C条件下用PBS轻轻振荡清洗12小时。
注意：对于胚胎发育第16.5天（E16.5）之前（不含E16.5）的胚胎，分离后直接用4% PFA固定头部；对于E16.5及之后的胚胎，需先去除头部的皮肤和脂肪组织，并在冰上预冷的PBS中多次冲洗后再进行固定。 - 对头部进行冷冻保护。
- 使用塑料移液管或镊子将每个头部转移至新的12孔板中，每孔含2 mL PBS配制的30%蔗糖溶液。在4 °C条件下轻轻振荡，直至头部沉入皿底。
- 包埋头部。
- 将经过冷冻保护的头部转移至含有最佳切割温度（OCT）包埋剂的模具中。在OCT中平衡数分钟，用镊子调整样本的位置和方向。
- 将模具置于干冰上冷冻。将制备好的冷冻模具存放在塑料袋中，于-80 °C保存，直至进行冷冻切片。
注意：样本修整后的切面必须朝向包埋模具底部。
- 为每只怀孕小鼠准备一个10 cm培养皿和若干3.5 cm培养皿，内含磷酸盐缓冲液（PBS），以及一个12孔培养板，每孔加入2 mL含4%多聚甲醛（PFA）的PBS。将所有培养皿和培养板置于冰上。
- 出生后未脱钙硬组织的制备
- 用CO2处死3周龄或3月龄小鼠，去除皮肤和脂肪组织，剪下并分离小鼠的头部或长骨。
- 按照步骤1.1.3–1.1.4所述方法对小鼠的头部或长骨进行固定和冷冻保护。
- 以与步骤1.1.5类似的方式在8%明胶中包埋。将冷冻模具置于塑料袋中，在-80 °C保存，直至进行冷冻切片。
注意：此处无需脱钙。配制8%明胶的方法：将8 g明胶加入100 mL PBS中，使用微波炉加热至溶解。注意混合液容易沸腾溢出。
2. 冷冻切片
- 将冷冻切片机温度设定为-18 °C（用于OCT包埋的软组织）或-25 °C及更低（用于明胶包埋的未脱钙硬组织）。将样本置于冷冻切片机舱内约30分钟，使其温度与冷冻切片机达到平衡。
- 将组织块从冷冻模具中推出。通过滴加一滴OCT将组织块冻结固定在样品头（组织夹持器）上。修整面应远离样品头放置（朝向操作者）。
- 将装有组织块的样品头安装到冷冻切片机的样品架上。调整刀片架，使刀片与样本之间的角度为3°–5°。
- 将10 µm厚的切片收集到经处理的载玻片上。在室温下完全干燥后，于-80 °C保存。
3. 组织学染色与显微成像
- 免疫荧光染色
- 从 -80 °C 取出载玻片，在室温下放置 1 小时以风干组织切片。用 0.1% PBST（0.1% 聚乙二醇叔辛基苯基醚溶于 PBS 中；参见 材料表）清洗载玻片三次，每次 5 分钟，以去除 OCT 包埋剂并通透组织切片。
- 可选步骤：进行抗原修复（可选）。
- 将柠檬酸盐缓冲液（10 mM 柠檬酸钠，pH 6）置于染色缸中，使用蒸锅或水浴加热至 95–100 °C。将载玻片浸入柠檬酸盐缓冲液中，孵育 10 分钟。
- 将染色缸从蒸锅或水浴中取出，置于室温冷却。在室温下冷却载玻片 20 分钟或更长时间15。
注意：作为替代方案，可使用 Tris-EDTA 缓冲液（10 mM Tris 碱，1 mM EDTA，0.05% Tween 20，pH 9.0）或 EDTA 缓冲液（1 mM EDTA，0.05% Tween 20，pH 8.0）进行热诱导抗原修复。除热蒸气外，也可使用压力锅、微波炉或水浴进行热诱导抗原修复。另一种替代方法是使用胰蛋白酶或胃蛋白酶进行酶诱导抗原修复。需优化酶处理的浓度和时间，以避免损伤组织切片。应针对每种抗体/抗原组合优化抗原修复方法。
- 每张载玻片加入 200 μL 封闭液（5% 驴血清溶于 0.1% PBST 中），在室温下孵育 30 分钟，然后去除封闭液，无需洗涤。
- 每张载玻片加入 100 μL 用封闭液稀释的一抗或多种一抗，在室温下孵育 1 小时，或在 4 °C 过夜孵育。随后在室温下用 PBS 洗涤载玻片三次，每次 10 分钟。
- 每张载玻片加入 100 μL 用封闭液稀释的二抗，在室温下孵育 1 小时。在室温下用 PBS 洗涤载玻片三次，每次 10 分钟。操作过程中需避光。
- 封片。
- 在载玻片上滴加两滴含 DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）的抗荧光淬灭封片剂，然后加盖盖玻片。
- 置于 4 °C 避光保存，待成像时取出。
注意：作为替代方案，可先用 PBS 稀释 1:2,000 的 DAPI 或 Hoechst 33324 染料在室温下对细胞核进行染色，然后用甘油封片。
- 末端脱氧核苷酸转移酶 dUTP 缺口末端标记（TUNEL）染色
注意：细胞凋亡过程中会形成带有 3'-羟基末端（3'OH DNA 末端）的双链 DNA。本实验提供一种利用商品化试剂盒（参见 材料表）通过末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）将地高辛标记的核苷酸连接至 DNA 片段，从而对游离的 3'OH DNA 末端进行原位标记的方案。- 可选步骤：在进行 TUNEL 染色前，先使用一抗和 Alexa Fluor-488 标记的二抗对组织切片进行染色。随后在室温下用 PBS 洗涤载玻片三次，每次 10 分钟。
注意：此步骤为可选，用于在同一张载玻片上同时进行蛋白与 TUNEL 的双重染色。 - 每张载玻片加入 100 μL 蛋白酶 K（10 µg/mL 溶于 10 mM Tris，pH 7.5 和 5 mM EDTA 中），在室温下孵育 5 分钟。随后在室温下用 PBS 洗涤载玻片三次，每次 10 分钟。
注意：应根据组织类型调整蛋白酶 K 的孵育时间和温度。对于经 4% 多聚甲醛固定的胚胎头部 10 µm 切片，建议在室温下孵育 5 分钟。除使用蛋白酶 K 外，可根据需要采用其他处理方法，包括：(1) 新鲜配制的 0.1% 聚乙二醇叔辛基苯基醚和 0.1% 柠檬酸钠，37 °C 孵育 10 分钟；(2) HCl（pH 2）中含 0.25%–0.5% 胃蛋白酶，或 0.25% 胰蛋白酶，37 °C 孵育 10 分钟；(3) 使用 0.1 M 柠檬酸盐缓冲液（pH 6）进行微波照射。 - 每张载玻片加入 200 μL 封闭液（5% 驴血清溶于 0.1% PBST 中），在室温下孵育 30 分钟，轻拍去除封闭液，无需洗涤。
- 每张载玻片加入 50 µL 试剂盒提供的平衡缓冲液，在室温下作用至少 10 秒。轻拍去除缓冲液，无需洗涤。
- 将试剂盒提供的 TdT 酶与反应缓冲液按 3:7 的比例混合，配制反应混合液（工作浓度 TdT 酶）。每张载玻片加入 50 µL 反应混合液，在 37 °C 孵育 1 小时。轻拍去除反应液，无需洗涤。
- 每张载玻片加入 200 µL 试剂盒提供的终止缓冲液（用 ddH2O 按 1:30 稀释），在室温下孵育 10 分钟。随后用 PBS 洗涤载玻片三次，每次 10 分钟。
- 使用罗丹明抗体进行标记。
- 每张载玻片加入 50 µL 预温至室温的抗地高辛偶联物（罗丹明）（用封闭液按 1:1 稀释），在避光条件下于室温孵育 30 分钟。
- 用 PBS 洗涤载玻片三次，每次 10 分钟。按步骤 3.1.6 进行封片。
- 可选步骤：在进行 TUNEL 染色前，先使用一抗和 Alexa Fluor-488 标记的二抗对组织切片进行染色。随后在室温下用 PBS 洗涤载玻片三次，每次 10 分钟。
4. 成像采集
- 使用阳性对照（对目标抗原呈阳性的组织）检查信号标记情况，使用阴性对照（省略一抗、同型对照或目标抗原阴性的组织）在荧光显微镜下评估图像背景。
- 根据阴性和阳性对照的信号强度设置成像设备和相机的参数条件（曝光时间及其他常规设置）。
注意：这些条件因以下因素而异：(1) 用于成像的相机和显微镜，(2) 抗体，(3) 每次实验所用的组织。颅面组织常用的条件为 ISO 200，曝光时间根据抗体的质量和特异性在 1/100 秒至 1 秒之间调整。适当的放大倍数取决于样本大小和实验目的。 - 使用常规落射荧光显微镜或共聚焦显微镜采集图像。每种颜色通道均应在相同条件下采集图像（包括相应对照的图像）。以相同格式保存图像（TIFF 格式最有利于信息保留）。
5. 荧光定量
注意：在许多情况下，对不同组之间的染色进行统计学比较会提供更有价值的信息。利用免疫荧光图像，可通过测量信号密度、计数阳性细胞或计算阳性区域面积来定量目标蛋白的相对表达水平。进行统计分析时，生物学独立样本的最低数量应为3个。常用方法是从每个样本制备至少3个切片，并对每个切片中至少3个具有代表性的区域进行成像。
- 使用 ImageJ 定量荧光强度
- 打开软件，使用 分析 > 设置测量值，确保仅选中 面积 和 积分密度。使用 文件 > 打开，载入待分析的图像。
- 使用 工具栏 选择最左侧的方形或圆形图标。使用选择工具在图像上选定待分析区域。使用 分析 > 测量，在结果窗口中获取所选区域的面积和积分密度读数。在邻近阳性细胞且无荧光信号的区域选择背景区域，以读取背景值。
- 重复步骤 5.1.2 以分析其他图像。调整待分析区域，使其与第一张图像中的区域一致。
- 完成所有分析后，将结果窗口中的所有数据复制并粘贴至电子表格中。
- 计算校正后的荧光强度（CTCF），公式为：积分密度 —（所选细胞面积 × 背景荧光平均值）。比较各样本间校正后的总细胞荧光强度差异，并绘制图表。
- 使用 ImageJ 对荧光图像中的阳性细胞数量进行定量
- 手动细胞计数。
- 使用 ImageJ > 插件 > 分析 安装 Cell Counter 插件。
- 使用 文件 > 打开 载入待分析图像。使用 插件 > 分析 > Cell counter 打开计数器窗口和结果窗口。
注意： Cell Counter 插件不适用于图像堆栈（stacks）。若需对堆栈进行计数，可使用插件 Plot Z Axis Profile，然后通过 图像 > 堆栈 > Plot Z Axis Profile，利用粒子追踪工具监测移动感兴趣区域（ROI）的强度变化。该工具可为手动或自动模式。 - 点击计数器窗口底部的任一按钮开始计数。直接在待计数的细胞或目标上点击，直至完成全部计数。
- 点击 计数 窗口中的 结果 按钮。计数的细胞总数将显示在 结果 窗口中。将结果日志保存为电子表格并进行分析。
- 自动细胞计数。
- 使用 文件 > 打开 载入待分析图像。在继续操作前，将 RGB 图像转换为灰度图像。
- 使用 图像 > 调整 > 阈值，选中所有需要计数的区域。
- 使用 分析 > 分析颗粒 获取细胞/颗粒的数量。设置有效颗粒大小范围（例如 100-无穷大），而非默认的 0-无穷大，以仅计数特定尺寸范围内的细胞/颗粒。将 结果日志保存为电子表格并进行分析。
注意： 若需从图像中获取除面积外的其他信息，请前往 分析 > 设置测量值，并勾选所需信息对应的复选框。
- 手动细胞计数。
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结果
胚胎颅面组织切片
按照上述步骤，于胚胎发育第16.5天（E16.5）或第18.5天（E18.5）从对照组（P0-Cre）或突变组（神经嵴细胞中Bmpr1a持续激活，P0-Cre; caBmpr1a）胚胎中分离头部组织。经4%多聚甲醛固定4小时后，样品包埋于OCT中，并进行冠状面冷冻切片。所得切片根据实验方案使用抗pSmad1/5/9抗体（BMP信号通路下游因子）或抗Ki67抗体（细胞增殖标志物）进行免疫染色，无需抗原修复。如图所示，对照组胚胎的额骨中pSmad1/5/9（图1A）和Ki67（图1C）呈阳性。在突变组胚胎中，额骨内的pSmad1/5/9水平升高（图1B），而Ki67水平降低（图1D）。同时根据实验方案检测了这些样本中的细胞死亡情况。结果显示，与对...
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讨论
本文提供了小鼠头部及未脱钙骨组织的制备以及免疫荧光染色用冷冻切片的详细实验方案，可用于检测细胞增殖、细胞死亡及BMP信号通路相关标志物。同时，我们详细阐述了从免疫荧光图像中获取定量数据的策略。这些方法经适当调整后，也可适用于其他组织。
组织制备的条件因组织的大小和类型而异。固定和冷冻保护的时间通常需要数小时至过夜。固定后，组织也可包埋于石蜡中，并用切片机进行切片16。尽管石蜡和OCT包埋均适用于免疫染色，但两者之间存在一些差异。石蜡包埋块可在室温下保存多年，而OCT包埋块需在-80 °C下保存，保存期限约为1年。石蜡能较好地保存组织形态，而OCT包埋过程中形成的冰晶可能对组织结构产生不利影响。石蜡有时会遮蔽抗原的表位，而OCT则能更好地保留酶活性和抗原表位。因此，若组织仅用4% PFA固定4小时或更短时间并包埋于OCT中，则大多数抗体无需进行抗原修复。然而，若阳性对照在冷冻切片中未显示良好的染色结果，仍可通过抗原修复获得更优的染色效果。
Hoechst 染料和 DAPI 均可用于...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了美国国立卫生研究院（R01DE020843，资助对象：Y.M.）、国际进行性骨化性纤维发育不良协会（Y.M.）以及中国国家自然科学基金资助项目（31500788，资助对象：J.Y.）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胶带 | Leica | #39475214 | |
| Alexa Fluor 488山羊抗兔二抗 | Invitrogen | A-11034 | |
| 含DAPI的抗荧光淬灭封片剂 | Invitrogen | P36931 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | A2153 | |
| 盖玻片 | Fisher Brand | 12-545-E | |
| 冷冻切片机 | Leica | CM1850 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| 荧光显微镜 | Olympus | BX51 | |
| 明胶 | Sigma | G1890 | |
| 原位 细胞死亡检测试剂盒 | Millipore | S7165 | |
| 显微镜载玻片 | Fisher Brand | 12-550-15 | |
| OCT包埋剂 | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
| 多聚甲醛（PFA） | Sigma | P6148 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma | P4417 | |
| 聚乙二醇 叔辛基苯基醚 | Sigma | T9284 | Triton X-100 |
| 蛋白酶K | Invitrogen | AM2542 | |
| 兔抗Ki67抗体 | 细胞信号技术公司 | 9129 | 批号：3；RRID:AB_2687446 |
| 兔抗pSmad1/5/9抗体 | Cell Signaling Technology | 13820 | 批号：3；RRID:AB_2493181 |
| 柠檬酸钠 | Sigma | 1613859 | |
| 蔗糖 | Sigma | S9378 | |
| Tris | Sigma | 10708976001 |
参考文献
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