本文以小鼠颅面组织为例，详细介绍了一种通过免疫染色检测和定量颅面形态发生/病理发生过程中蛋白质水平的实验方案。此外，我们还描述了一种针对幼鼠未脱钙硬组织进行制备及冷冻切片以用于免疫染色的方法。
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本文内容
摘要
摘要
组织免疫染色可对特定组织中目标蛋白进行高特异性和可靠的检测。本文以小鼠颅面组织为例，介绍了一套完整且简便的检测颅面形态发生/病理发生过程中蛋白表达的实验方案。该方案包括组织制备与冷冻切片、间接免疫荧光染色、图像采集及定量分析。此外，本文还描述了未脱钙硬组织用于免疫染色的制备与冷冻切片方法，以颅面组织和长骨为例进行说明。这些方法对于研究颅面形态发生/病理发生过程中多种组织内蛋白表达及形态学/解剖学变化至关重要，经适当调整后也可适用于其他组织。组织学知识和高质量切片是基于实验结果得出科学结论的关键。本方法的潜在局限性包括但不限于抗体特异性问题以及定量分析的困难，本文亦对此进行了讨论。
引言
面部是人类身份的关键部分，由多种不同类型的组织构成，例如上皮、肌肉、骨骼、软骨和牙齿。这些组织来源于全部三个胚层：外胚层、内胚层和中胚层1,2。为了颅面组织的正常图式形成和发育，细胞增殖、死亡和分化必须通过特定的信号通路（如Wnt、Fgf、Hh和Bmp通路）进行高度协调和调控3,4,5。细胞增殖、存活或分化过程中的缺陷将导致颅面畸形，这是最常见的先天性出生缺陷之一。转基因小鼠是研究颅面形态发生和疾病发生机制的有用工具1,2,3,4,5。了解颅面结构在发育和疾病发生过程中的变化，有助于阐明关键的发育原理以及颅面畸形的发生机制1,2,3
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方案
所有小鼠实验均按照密歇根大学关于实验动物人道护理与使用的指南进行。本研究中所有动物实验程序均已获得密歇根大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准（方案编号 #PRO00007715）。
1. 组织制备
- 胚胎组织的制备
- 为每只怀孕小鼠准备一个10 cm培养皿和若干3.5 cm培养皿，内含磷酸盐缓冲液（PBS），以及一个12孔培养板，每孔加入2 mL含4%多聚甲醛（PFA）的PBS。将所有培养皿和培养板置于冰上。
注意：操作4% PFA时应在通风橱中进行。 - 使用镊子和剪刀在冰上预冷的PBS中解剖怀孕小鼠的胚胎，方法如前所述14。
- 首先，用CO2处死怀孕小鼠，用镊子夹住腹部中线下方的皮肤并仅切开皮肤，然后轻轻拉起皮肤使其与下方腹肌分离。
- 接着，沿皮肤切口方向切开腹腔，取出含有成串胚胎的子宫，并通过轻轻剪开子宫壁分离出各个胚胎。去除卵黄囊和羊膜等胚外组织。
- 将每个胚胎的头部剪下并分离。
- 使用塑料移液管或镊子将每个头部转移至含有4% PFA的12孔板的各孔中。在4 °C条件下用4% PFA固定样本4小时，随后在4 °C条件下用PB....
- 为每只怀孕小鼠准备一个10 cm培养皿和若干3.5 cm培养皿，内含磷酸盐缓冲液（PBS），以及一个12孔培养板，每孔加入2 mL含4%多聚甲醛（PFA）的PBS。将所有培养皿和培养板置于冰上。
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结果
胚胎颅面组织切片
按照上述步骤，于胚胎发育第16.5天（E16.5）或第18.5天（E18.5）从对照组（P0-Cre）或突变组（神经嵴细胞中Bmpr1a持续激活，P0-Cre; caBmpr1a）胚胎中分离头部组织。经4%多聚甲醛固定4小时后，样品包埋于OCT中，并进行冠状面冷冻切片。所得切片根据实验方案使用抗pSmad1/5/9抗体（BMP信号通路下游因子）或抗Ki67抗体（细胞增殖标志物）进行免疫染色，无需抗原修复。如图所示，对照组胚胎的额骨中pSmad1/5/9（图1A）和Ki67（图1C）呈阳性。在突变组胚胎中，额骨内的pSmad1/5/9水平升高（图1B），而Ki67水平降低（图1D）。同时根据实验方案检测了这些样本中的细胞死亡情况。结果显示，与对.......
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讨论
本文提供了小鼠头部及未脱钙骨组织的制备以及免疫荧光染色用冷冻切片的详细实验方案，可用于检测细胞增殖、细胞死亡及BMP信号通路相关标志物。同时，我们详细阐述了从免疫荧光图像中获取定量数据的策略。这些方法经适当调整后，也可适用于其他组织。
组织制备的条件因组织的大小和类型而异。固定和冷冻保护的时间通常需要数小时至过夜。固定后，组织也可包埋于石蜡中，并用切片机进行切片16。尽管石蜡和OCT包埋均适用于免疫染色，但两者之间存在一些差异。石蜡包埋块可在室温下保存多年，而OCT包埋块需在-80 °C下保存，保存期限约为1年。石蜡能较好地保存组织形态，而OCT包埋过程中形成的冰晶可能对组织结构产生不利影响。石蜡有时会遮蔽抗原的表位，而OCT则能更好地保留酶活性和抗原表位。因此，若组织仅用4% PFA固定4小时或更短时间并包埋于OCT中，则大多数抗体无需进行抗原修复。然而，若阳性对照在冷冻切片中未显示良好的染色结果，仍可通过抗原修复获得更优的染色效果。
Hoechst 染料和 DAPI 均可用于.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了美国国立卫生研究院（R01DE020843，资助对象：Y.M.）、国际进行性骨化性纤维发育不良协会（Y.M.）以及中国国家自然科学基金资助项目（31500788，资助对象：J.Y.）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胶带 | Leica | #39475214 | |
| Alexa Fluor 488山羊抗兔二抗 | Invitrogen | A-11034 | |
| 含DAPI的抗荧光淬灭封片剂 | Invitrogen | P36931 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | A2153 | |
| 盖玻片 | Fisher Brand | 12-545-E | |
| 冷冻切片机 | Leica | CM1850 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| 荧光显微镜 | Olympus | BX51 | |
| 明胶 | Sigma | G1890 | |
| 原位 细胞死亡检测试剂盒 | Millipore | S7165 | |
| 显微镜载玻片 | Fisher Brand | 12-550-15 | |
| OCT包埋剂 | Fisher Healthcare | 23-730-571 | |
| 多聚甲醛（PFA） | Sigma | P6148 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma | P4417 | |
| 聚乙二醇 叔辛基苯基醚 | Sigma | T9284 | Triton X-100 |
| 蛋白酶K | Invitrogen | AM2542 | |
| 兔抗Ki67抗体 | 细胞信号技术公司 | 9129 | 批号：3；RRID:AB_2687446 |
| 兔抗pSmad1/5/9抗体 | Cell Signaling Technology | 13820 | 批号：3；RRID:AB_2493181 |
| 柠檬酸钠 | Sigma | 1613859 | |
| 蔗糖 | Sigma | S9378 | |
| Tris | Sigma | 10708976001 |
参考文献
- Trinh, L. eA., Fraser, S. E. Imaging the cell and molecular dynamics of craniofacial development: challenges and new opportunities in imaging developmental tissue patterning. Current Topics in Developmental Biology. 115, 599-629 (2015).
- Marcucio, R., et al.
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重印与许可
