小鼠颅面组织和未切除骨骼的组织制备及免疫染色

Summary

在这里,我们提出了一个详细的协议,以小鼠颅面组织为例,通过免疫染色来检测和量化颅面形态形成/发病机制期间的蛋白质水平。此外,我们描述了一种制备和冷冻方法,从幼鼠的未分化硬组织免疫染色。

Abstract

组织免疫染色提供对给定组织内感兴趣的蛋白质的高度特定和可靠的检测。在这里,我们描述了一个完整和简单的协议,以小鼠颅面组织为例,用于检测颅面形态形成/发病过程中的蛋白质表达。该方案包括组织制备和冷冻、间接免疫荧光、图像采集和定量。此外,还介绍了一种制备和冷冻未分化的硬组织进行免疫染色的方法,以颅面组织和长骨为例。这些方法是确定颅面形态形成/发病过程中各种组织中的蛋白质表达和形态/解剖变化的关键。它们也适用于具有适当修改的其他组织。组织学知识和各节的高质量对于从实验结果中得出科学结论至关重要。该方法的潜在局限性包括但不限于抗体的特异性和定量困难,这里还讨论了这些缺陷。

Introduction

面部是人类身份的关键部分,由几种不同的组织组成,如上皮、肌肉、骨骼、软骨、牙齿。这些组织来自所有三个生殖层、内皮和中代1、2。为了正确形成颅面组织,细胞增殖、死亡和分化需要高度协调和由特定的信号通路调节,如Wnt、Fgf、Hh和Bmp通路3、4 ^{, 5}.细胞增殖、存活或分化的缺陷会导致颅面畸形,这是最常见的先天性先天缺陷之一。转基因小鼠是研究颅面形态形成和发病机制的有用工具,^{其作用是1、2、3、4、5。}了解颅面结构在发育和发病过程中的变化将有助于澄清关键的发育原理以及颅面畸形^{的机制1,2,3 ,}

Protocol

所有小鼠实验都按照密歇根大学关于人道护理和动物在研究中使用的指导方针进行。这项研究中使用的所有动物程序都通过了密歇根大学(协议#PRO00007715)的机构动物护理和使用委员会(IACUC)。

1. 组织准备

1. 胚胎组织制剂
   1. 为每个怀孕的小鼠准备一个 10 厘米的盘子和几个含有磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 的 3.5 厘米菜,以及一个含有 2 mL 4% 甲醛 (PFA) 的 12 孔培养板。将所有培养皿和盘子放在冰上。
      注:在烟罩中处理 4% PFA。
   2. 从冰冷的PBS中用钳子和剪刀从怀孕的老鼠身上解剖胚胎,如前文14所述。
      1. 简单地说,用CO2安乐死怀孕的老鼠,用钳子抓住腹部中心下方的皮肤,只切过皮肤,然后轻轻地拉在皮肤上,将其与腹部肌肉壁的底层分离。
      2. 接下来,按照皮肤切口的同一条线切入腹腔。取出含有一串胚胎的子宫,轻轻切掉子宫壁,取出胚胎。外胚胎组织,如蛋黄囊和羊年将被移除。
      3. 从每个胚胎中切割和分离头部。
   3. 将每个头转移到包含 4% PFA 的 12 孔板的每个孔中,带有塑料转移移液器或钳子。将4%PFA中的样品固定在4°C4小时,在4°C下冲洗PBS中的样品,....

Results

胚胎颅面组织部分
按照上述步骤,在胚胎日(E)16.5或18.5时,从对照(P0-Cre)或突变体(神经峰细胞中形成激活的Bmpr1a,P0-Cre;caBmpr1a)胚胎中解剖头部。 在4%PFA中固定4小时后,样品嵌入OCT和低温分度。结果部分被免疫染色的抗体对pSmad1/5/9(下游BMP信号因子)或Ki67(细胞增殖标记)没有抗原检索根据协议。如图所示,pSmad1/5/9(图1A)和Ki67(图1C)在对照胚胎的前骨骼中呈阳性。在突变胚胎中,pSmad1/5/9水平增加(图1B),而Ki67的水平低(图1D)在前骨中减少。这些样本中的细胞死亡也按照协议进行了检查。如图所示,在突变胚胎的前骨中观察到的凋亡细胞比对照胚胎的细胞多(图1E,F)。

Discussion

在这里,我们提供了一个详细的协议,用于制备小鼠头和未去切骨组织,以及用于细胞增殖、细胞死亡和BMP信号标记的免疫染色的冷冻切片。我们还详细介绍了从免疫荧光图像获取定量数据的策略。这些方法也适用于具有适当修改的其他组织。

组织制备的条件因组织的大小和类型而异。固定和冷冻保护时间通常需要几个小时到一夜之间。固定后,组织也可以嵌入石蜡和切片与微托^姆16。虽然石蜡和OCT在免疫染色方面都很好,但它们之间还是有一些区别的。石蜡块可在RT处保存多年,而OCT块在-80°C下可保存1年。石蜡可保留组织形态,而在OCT嵌入期间形成的冰晶可能对组织结构产生负面影响。石蜡有时掩盖抗原的表征,而OCT保留酶活动和抗原表位。因此,如果固定在4%PFA中,只需4小时或更少,并嵌入OCT中,则大多数抗体无需抗原检索。然而,如果阳性对照在冷冻科没有显示出良好的染色效果,通过抗原检索仍有可能获得更好的结果。

Hoechst 染料和 DAPI 都可用于核反染色。它们有相似之处,因为 (1) 是紫外线激发、微小的凹.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
胶带	Leica	#39475214
Alexa fluor 488-山羊抗兔二抗	Invitrogen	A-11034
抗淬灭封片剂与 DAPI	Invitrogen	P36931
牛血清白蛋白	Sigma	A2153
盖玻片	Fisher 品牌	12-545-E
低温恒温器	Leica	CM1850
EDTA	Sigma	E6758
荧光显微镜	Olympus	BX51
明胶	Sigma	G1890
原位 细胞死亡检测试剂盒	Millipore	S7165
显微镜载玻片	Fisher Brand	12-550-15
OCT化合物	Fisher Healthcare	23-730-571
聚甲醛（PFA）	Sigma	P6148
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Sigma	P4417
聚乙二醇 叔辛基苯醚	Sigma	T9284	Triton X-100
蛋白酶 K	Invitrogen	AM2542
兔抗 Ki67 抗体	细胞信号技术	9129	批次#：3;RRID：AB_2687446
兔抗 pSmad1/5/9 抗体	Cell Signaling Technology	13820	批次#：3;RRID：AB_2493181
柠檬酸钠	Sigma	1613859
蔗糖	Sigma	S9378
Tris	Sigma	10708976001