本文介绍了两种转化马铃薯植株的实验方案。Agrobacterium tumefaciens 转化可获得完整的转基因植株，而 Agrobacterium rhizogenes 转化则在野生型地上部分产生可自繁殖的转基因毛状根。随后，我们通过GUS染色法检测转化根中启动子的活性。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
Agrobacterium tumefaciens 和 Agrobacterium rhizogenes 介导的马铃薯转化及通过 GUS 染色检测木栓质合成基因的启动子活性
本文内容
摘要
摘要
农杆菌 sp. 是获得转基因植物最常用的方法之一，因为它能够将其自身的T-DNA转移并整合到植物基因组中。本文介绍了两种用于遗传改良马铃薯（Solanum tuberosum）的转化系统。马铃薯（Solanum tuberosum）) 植株。在 根癌农杆菌 转化，叶片被侵染，筛选转化细胞，并利用植物激素在18周内再生出完整的转基因植株。在 A. rhizogenes 转化过程中，通过注射针将细菌注入茎部，利用红色荧光标记物检测新长出的转化毛状根，并去除未转化的根。5至6周后，所得植株由野生型地上部分与完全发育的转化毛状根组成。为增加生物量，可将转化的毛状根切下并进行自体增殖。我们应用了这两种 根癌农杆菌-介导的转化方法以获得表达目标基因的根组织 GUS 由木栓质生物合成基因启动子驱动的报告基因。提供了GUS染色步骤，可实现启动子诱导的细胞定位。在两种方法中，转化的马铃薯根均在木栓化的内皮层和外皮层中显示出GUS染色信号，此外，在 A. rhizogenes 在转化根中，GUS活性也在侧根的起始部位被检测到。这些结果表明 A. rhizogenes 可以作为一种快速替代工具用于研究基因表达 在根中。
引言
除了经济价值外，转基因植物的创制在科学研究中具有重要意义，可用于验证基因的最终功能，并加深对植物生理学和发育过程的理解。目前植物DNA插入最常用的方法是 根癌农杆菌介导的转化 根癌农杆菌 能够通过其肿瘤诱导（Ti）质粒的作用，在多种植物物种的感染组织中产生冠瘿瘤。该质粒包含一个T-DNA区域，其中含有一组基因，可整合到植物基因组中并诱导组织去分化1,2通过转基因替换T-DNA中的这些基因，可实现特定的植物遗传修饰，同时避免表型效应3. 为了促进 将外源基因克隆至T-DNA区域后，T-DNA已被切下并插入一个独立的质粒中，称为双元质粒；而Ti质粒的其余基因（即介导T-DNA转移与插入的毒力基因）则被置于辅助质粒中。在植物生物技术研究中，通过农杆菌介导的转化方法 根癌农杆菌 具有多个优点：不需要昂贵的设备，能够实现稳定的和瞬时的植物转化，并且 染色体中整合的基因拷贝数较少4然而，对于大多数植物而言，但不包括拟南芥, 稳定转化体的获得需要利用外源植物激素从单个或少数细胞再生植株，使得该过程费时且 laborious。 A. rhizogenes 也能修饰植物基因组，在感染位点处由于基因表达而产生毛状根或不定根 ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
A. rhizogenes 转化实验方案经 Horn 等人7 的方法改编和修改，所测试的基因型为 S. tuberosum ssp. tuberosum（品种 Désirée）。A. tumefaciens 转化实验方案经 Banerjee 等人22 的方法改编和修改，所测试的基因型为 S. tuberosum ssp. tuberosum（品种 Désirée）和 S. tuberosum ssp. andigena。两种实验流程的主要步骤分别在图1和图2中进行了总结。
注意： 在实验操作的所有步骤中执行 体外 转移时需迅速进行，条件允许时应保持培养皿或花盆处于封闭状态，从而最大限度地减少植物暴露于空气中的时间，以避免萎蔫和污染。除非另有说明，所有植物培养均在培养柜中进行，条件为12 h的 24 °C 光照/12 小时黑暗 20 °C 暗和 67 µmol m-1 s-1除非另有说明，所有细菌操作均应 体外 在超净工作台中进行植物的无菌转移。所有培养基配方用于 农杆菌 和 <....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
根癌农杆菌介导的马铃薯遗传转化
在本论文中，建立了一步步获得转化根的实验流程 A. rhizogenes 被展示。 图1 介绍了整个实验流程，总共需要约5-6周时间（从注射开始） A. rhizogenes 获得完全发育的毛状根）。随后，可将植株作为嵌合体（野生型地上部分、转基因根）进行研究，或切下转基因毛状根克隆，在添加2%蔗糖的固体 Gamborg B5 培养基中独立培养。 Alternatively，也可利用液体 Gamborg B5 培养基大规模扩增毛状根。本研究所采用的方法已应用于 S. tuberosum spp. tuberosum （品种 Désirée）
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
在马铃薯中，获得稳定且完整的转基因植株最常用的方法是利用Agrobacterium tumefaciens菌株进行转化，该方法需要通过外源植物激素诱导器官发生。尽管基于Agrobacterium的实验方案有可能整合非T-DNA载体序列25，但该方法仍然是目前最简便且成本最低的马铃薯转化方法。近年来，A. rhizogenes介导的转化引起了研究人员的关注，因其可在比使用A. tumefaciens更短的时间内获得转基因根系。A. rhizogenes仍保留着根诱导（Ri）质粒，该质粒携带一组编码植物激素生长素调控酶、细胞分裂素生物合成酶以及冠瘿碱合成相关蛋白的基因26。一旦Ri T-DNA插入宿主基因组DNA中，新的激素平衡将使受感染细胞的调控失常，进而在感染部位诱导形成大量增殖的根，称为毛状根27。当使用额外的双元载体来整合外源DNA时，Ri质粒的保留使得无需外源施加植物激素或器官发生过程即可获得转化的毛.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到了西班牙创新与科学部（AGL2009-13745，授予PB的FPI奖学金）、经济与竞争力部及欧洲区域发展基金（FEDER）资助（AGL2012-36725，AGL2015-67495-C2-1-R）以及赫罗纳大学（授予SF的博士奖学金和SING11/1项目资助）的支持。作者感谢德国罗斯托克大学土地利用研究所Inge Broer博士提供了A. rhizogenes菌株，西班牙马德里国家生物技术中心Salomé Prat博士提供了A. tumefaciens菌株，同时感谢图卢兹第三保罗萨巴蒂埃大学—法国国家科学研究中心植物研究实验室（LRSV）的Marçal Soler博士和Anna Plasencia博士在启动A. rhizogenes转化实验过程中提供的帮助与支持。作者还感谢赫罗纳大学生物系Sara Gómez在实验操作和植物培养方面提供的宝贵协助，以及Ferran Fontdecaba和Carla Sánchez在完成其本科毕业设计期间对部分实验的参与和支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 丙酮 | Panreac | 1.310.071.21 | |
| 乙酰丁香酮 | 阿克罗斯 | 115540050 | |
| 水族泵 | Prodac | MP350 | |
| 高压灭菌 | Ragpa Strelimatic | ||
| 细菌学琼脂 | Lab Conda | 1800 | |
| BAP | Duchefa | B0904 | |
| 牛肉浸膏 | Lab Conda | 1700 | |
| 植物生长培养箱 | Nuaire | ||
| 羧苄青霉素 | Duchefa | C0109 | |
| 头孢噻肟钠 | Duchefa | C0111 | |
| DMSO | 默克 | 1029310161 | |
| 生态箱信息 | HT | 29378 | |
| 乙醇 | 默克 | 1,009,831,011 | |
| Falcon管 | 技术控制 | CFT011500 | |
| 铁氰化物 | Sigma | 101001081 | |
| 铁氰化物 | Sigma | 100979088 | |
| 烧瓶（直径 8.06 cm，高 11.3 cm）及塑料盖 体外 培养 | Apiglass | ref16 | |
| GA3 | Sigma | G7645 | |
| Gamborg B5 培养基 | Duchefa | G0210 | |
| Gelrite | Duchefa | G1101 | |
| 葡萄糖 | Sigma | G5767 | |
| 卡那霉素 | Sigma | K1377 | |
| Leukopor 胶带 | BSN Leukopor | BDF47467 | |
| 卢佩 | Wild-Heerbrugg | M420 | |
| 磁力摇床 | Agimatic | 7000243 | |
| MES水合物 | Sigma | M2933-25G | |
MgSO₄4 | Panreac | 131404 | |
| 显微镜 | 奥林巴斯 | ||
| Minufugue centrifugue 5415R | Eppendorf | ||
| Murashige和Skoog培养基 | Duchefa | M0254.0050 | |
Na2HPO4 | Panreac | 131679 | |
| NAA | Duchefa | N0903 | |
| NaCl | Panreac | 131659 | |
NaH2PO4 | Sigma | 58282 | |
| NightSea Stereo | SFA 月球支架适配器 | ||
| Parafilm | Anorsa | PRFL-001-001 | |
| 蛋白胨 | 实验室 Conda | 1616 | |
| 培养皿（90 × 14） | Anorsa | 200200 | |
| pH计 | 克里森 | ||
| 植物培养室 | Inkoa | RFTI-R5485 | |
| 植物琼脂 | Duchefa | P1001 | |
| 冰箱 | Liebherr Medline | ||
| 利福平 | Duchefa | R0146 | |
| 壮观霉素 | Sigma | 59007 | |
| 分光光度计 | 岛津 | ||
| 方形培养皿（120 x 120） | Deltalab | 200204 | |
| 链霉素 | Sigma | S6501 | |
| 蔗糖 | Panreac | 131621 | |
| 手术刀片 | Swann-Morton | 201 | |
| 外科手术针 | NIPRO | 015/0204 | |
| 胰蛋白胨 | Lab Conda | 1612 | |
| Triton | 塞尔瓦 | 37240 | |
| Unimax 1010 摇床 | Heidolph | ||
| 真空 | Dinko | ||
| 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸钠盐（无水） | Biosynth | B-7398 | |
| 酵母提取物 | Lab Conda | 1702.00 | |
| 玉米素核苷 | Sigma | 1001042850 |
参考文献
- Gelvin, S. B. Traversing the Cell: Agrobacterium T-DNA's journey to the host genome. Frontiers in Plant Science. 3, 1-11 (2012).
- Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant facto....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
