本文介绍了两种转化马铃薯植株的实验方案。Agrobacterium tumefaciens 转化可获得完整的转基因植株，而 Agrobacterium rhizogenes 转化则在野生型地上部分产生可自繁殖的转基因毛状根。随后，我们通过GUS染色法检测转化根中启动子的活性。
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Agrobacterium tumefaciens 和 Agrobacterium rhizogenes 介导的马铃薯转化及通过 GUS 染色检测木栓质合成基因的启动子活性
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摘要
摘要
农杆菌 sp. 是获得转基因植物最常用的方法之一，因为它能够将其自身的T-DNA转移并整合到植物基因组中。本文介绍了两种用于遗传改良马铃薯（Solanum tuberosum）的转化系统。马铃薯（Solanum tuberosum）) 植株。在 根癌农杆菌 转化，叶片被侵染，筛选转化细胞，并利用植物激素在18周内再生出完整的转基因植株。在 A. rhizogenes 转化过程中，通过注射针将细菌注入茎部，利用红色荧光标记物检测新长出的转化毛状根，并去除未转化的根。5至6周后，所得植株由野生型地上部分与完全发育的转化毛状根组成。为增加生物量，可将转化的毛状根切下并进行自体增殖。我们应用了这两种 根癌农杆菌-介导的转化方法以获得表达目标基因的根组织 GUS 由木栓质生物合成基因启动子驱动的报告基因。提供了GUS染色步骤，可实现启动子诱导的细胞定位。在两种方法中，转化的马铃薯根均在木栓化的内皮层和外皮层中显示出GUS染色信号，此外，在 A. rhizogenes 在转化根中，GUS活性也在侧根的起始部位被检测到。这些结果表明 A. rhizogenes 可以作为一种快速替代工具用于研究基因表达 在根中。
引言
除了经济价值外，转基因植物的创制在科学研究中具有重要意义，可用于验证基因的最终功能，并加深对植物生理学和发育过程的理解。目前植物DNA插入最常用的方法是 根癌农杆菌介导的转化 根癌农杆菌 能够通过其肿瘤诱导（Ti）质粒的作用，在多种植物物种的感染组织中产生冠瘿瘤。该质粒包含一个T-DNA区域，其中含有一组基因，可整合到植物基因组中并诱导组织去分化1,2通过转基因替换T-DNA中的这些基因，可实现特定的植物遗传修饰，同时避免表型效应3. 为了促进 将外源基因克隆至T-DNA区域后，T-DNA已被切下并插入一个独立的质粒中，称为双元质粒；而Ti质粒的其余基因（即介导T-DNA转移与插入的毒力基因）则被置于辅助质粒中。在植物生物技术研究中，通过农杆菌介导的转化方法 根癌农杆菌 具有多个优点：不需要昂贵的设备，能够实现稳定的和瞬时的植物转化，并且 染色体中整合的基因拷贝数较少4然而，对于大多数植物而言，但不包括拟南芥, 稳定转化体的获得需要利用外源植物激素从单个或少数细胞再生植株，使得该过程费时且 laborious。 A. rhizogenes 也能修饰植物基因组，在感染位点处由于基因表达而产生毛状根或不定根 rol 根 位点根诱导（Ri）质粒中编码的基因5。尽管其研究程度不及 根癌农杆菌, A. rhizogenes 也用于获得转基因根系。在这种情况下， A. rhizogenes 含有 Ri 质粒中的原始 T-DNA 以及携带外源基因的双元质粒中的第二段 T-DNA。当感染部位位于茎或下胚轴时，可获得嵌合植株，即从野生型地上部分长出新的转基因毛状根。此外，转基因毛状根也可自主生长 体外 在含有碳源的培养基中。使用 A. rhizogenes 而不是 A. tumefaciens 在以根为目标器官时，产生转基因组织的方法正变得越来越重要，因为该方法无需植株再生，因而更快速且成本更低。先前的研究已证明该方法适用于根特异性基因的表型特征分析。6,7,8,9.
根据联合国粮食及农业组织（FAO）的数据，马铃薯（Solanum tuberosum）是全球第四大重要作物，因其块茎富含维生素和矿物质，具有重要的人类食用营养价值。因此，马铃薯已成为农业生物技术领域的研究重点，同时也被视为进行遗传学和发育研究的优良生物学模型10,11。马铃薯转化技术通过鉴定参与栓质和蜡质生物合成12,13,14,15,16,17、栓质单体运输18以及转录调控19的相关基因，显著促进了人们对栓化组织分子机制的理解。其中，栓质阿魏酰基转移酶基因FHT 是已鉴定的生物合成基因之一；其表达下调会导致周皮保护功能严重受损，这与马铃薯块茎中栓质和蜡质的阿魏酸酯含量显著降低密切相关14。同时，在拟南芥的根和种子中，其同源基因（ASFT/RWP1）的敲除也证实了该基因在栓质中烷基阿魏酸酯合成中的作用20,21。在马铃薯中，FHT 转录报告基因系及FHT抗体实验分别显示，该基因的启动子活性及蛋白定位于外皮层、内皮层、木栓形成层衍生物以及受伤组织中15。
在本研究中，我们详细描述了一种利用 A. rhizogenes 产生转基因毛状根，这些毛状根可保留在野生型茎中形成嵌合马铃薯植株，或被切除后独立生长 体外. 我们还提供了以下实验方案 A. tumefaciens 获得完整的转基因马铃薯植株。作为案例研究， A. rhizogenes 和 A. tumefaciens 使用相同的双元载体转化以获得具有目标性状的根 FHT 启动子驱动 GUS 报告基因表达。结果被报告并进行了比较。
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方案
A. rhizogenes 转化实验方案经 Horn 等人7 的方法改编和修改，所测试的基因型为 S. tuberosum ssp. tuberosum（品种 Désirée）。A. tumefaciens 转化实验方案经 Banerjee 等人22 的方法改编和修改，所测试的基因型为 S. tuberosum ssp. tuberosum（品种 Désirée）和 S. tuberosum ssp. andigena。两种实验流程的主要步骤分别在图1和图2中进行了总结。
注意： 在实验操作的所有步骤中执行 体外 转移时需迅速进行，条件允许时应保持培养皿或花盆处于封闭状态，从而最大限度地减少植物暴露于空气中的时间，以避免萎蔫和污染。除非另有说明，所有植物培养均在培养柜中进行，条件为12 h的 24 °C 光照/12 小时黑暗 20 °C 暗和 67 µmol m-1 s-1除非另有说明，所有细菌操作均应 体外 在超净工作台中进行植物的无菌转移。所有培养基配方用于 农杆菌 和 体外 植物培养物提供于 表 S1.
注意：将所有基因改造细菌和植物弃置于指定的废弃物容器中。
1. 农杆菌 用于转化的菌种
注意：用于 A. rhizogenes 转化的菌株为 C58C1:Pri15837（由 Inge Broer 博士惠赠），用于 A. tumefaciens 的菌株为 GV2260（由 Salomé Prat 博士惠赠）。A. rhizogenes 被转化至含有 T-DNA 的双元载体 PK7GWIWG2_II-RedRoot（根特大学植物系统生物学系 VIB 提供；http://gateway.psb.ugent.be）中，该 T-DNA 携带一个转化标记，用于监测毛状根的形成。为了比较 A. rhizogenes 和 A. tumefaciens 产生的转化根，两种菌均被转化至双元载体 pKGWFS7 中，该载体含有一个 T-DNA，其上携带由 FHT 启动子驱动的 β-葡萄糖醛酸酶（GUS） 报告基因以及作为筛选标记的卡那霉素抗性基因15。
- 挑取一单菌落 Agrobacterium，在 50 mL 离心管中加入 5 mL YEB 培养基（补充抗生素，见表 S1），于 28 °C、200 rpm 振荡培养过夜（O/N）。
- 进行 A. tumefaciens 转化时，测定菌液光密度，必须达到 OD600 = 0.6–1.0。
- 若光密度高于此范围，则用新鲜培养基进行传代培养，将菌液稀释至 OD600 = 0.3，并继续培养至菌液光密度达到 OD600 = 0.6–1.0。
- 取 1 mL Agrobacterium 菌液，在台式离心机中以 3,000 × g、室温离心 10 分钟。
- 用移液器吸除上清液，将菌体沉淀重悬于 1 mL 无抗生素的 YEB 培养基中。重复此步骤以确保抗生素完全去除。
- 进行 A. tumefaciens 转化时，在最后一次重悬时加入适量 YEB 培养基，使最终光密度达到 OD600 = 0.8。
- 在准备待感染植株期间，将菌液置于冰上保存。
2. 转化用植物材料
- 制作一个或两个节的茎段插条，可包含无菌条件下的顶端或腋芽 体外 马铃薯植株（供体植株）；将它们种植于花盆中的固体2MS培养基中，培养3至4周（图1A 和 图 2A).
3. 利用 A. rhizogenes进行植物转化（图1）
注意：本实验方案可用于获得转化的毛状根。为评估外源基因的表达，需设置阴性对照。制备阴性对照时，使用未转化的或携带空载体（含转化标记基因）的 A. rhizogenes 菌株，按相同操作步骤进行即可。
- 使用新鲜的培养基平板；或者，可将平板盖朝上置于 4 °C 保存，并用透明封口膜 tightly 密封，以避免培养基脱水。制备方形培养基平板时，将其倾斜约 15°，加入 40 mL MS 培养基，待其凝固。这将最大限度减少植物地上部分与培养基的接触。
- 将一株供体植物从 2MS 培养基中极其小心地转移至一个 120 mm × 120 mm 的方形平板中。
- 使用手术针向茎的一个节间注入 3 μL 的 A. rhizogenes 菌液，并在可能的情况下，于不同节间重复此操作两次，每株植物共注射两次。
注意：每次注射应视为一次独立的转化事件（图 1B）。 - 立即将整株植物转移至含有添加了 0.1 mM 乙酰丁香酮的固体 MS 培养基的方形平板中。每块平板放置 2 株植物。
注意：1 M 乙酰丁香酮储备液用 DMSO 配制，可于 -20 °C 保存。 - 使用外科胶带密封平板，并将其垂直放置于生长培养箱中，培养 4 天。
- 将植物转移至新的含有添加头孢噻肟钠 [500 µg/mL] 的 MS 培养基的方形平板中，以杀死 A. rhizogenes。
- 10–12 天后，毛状根开始出现（图 1C、1D）。随后切除植物的原生根，并将植物转移至新的含有添加头孢噻肟钠 [500 µg/mL] 的 MS 培养基的方形平板中。
注意：当使用 DsRed 转化标记时，可通过红色荧光检测转化成功的毛状根（图 3D）。 - 为获得复合植株（图 1E），将转基因毛状根在添加头孢噻肟钠 [500 μg/mL] 的 MS 培养基中继续培养 3–4 周（每周更换一次培养基）。
- 根据实验目的，按以下方法扩增转基因毛状根及阴性对照：
- 将整个复合植株转移至水培（表 S2）或土壤培养基中，以促进其大量生长。
- 若需单独扩增转化后的毛状根，当表达红色荧光转化标记（DsRed 蛋白）的根长至 4–8 cm 时，使用解剖刀将其切下（图 1E），并转移至含有添加 2% 蔗糖和头孢噻肟钠 [500 μg/mL] 的 Gamborg B5 固体培养基的培养皿中。用实验室塑料封口膜密封培养皿，并于 20 °C 黑暗条件下培养。
注意：可在配备荧光检测功能的体视显微镜下，在无菌条件下操作根系（参见 材料表）。 - 对于生物量生产（例如基因表达分析），切取一段 5 cm 长的毛状根，接种于含 20 mL 添加 2% 蔗糖和头孢噻肟钠 [500 µg/mL] 的 Gamborg B5 液体培养基的 150 mL 三角瓶中。于 20 °C、黑暗、60 rpm 条件下培养 6 周。
图1：利用农杆菌介导法获得马铃薯转基因毛状根的时间线 A. rhizogenes. 达到转化过程各阶段所需的累计周数以及后续培养毛状根的步骤如图所示。不同阶段的代表性图像如下：以3周龄植株开始的转化过程的起始阶段 体外 植物（A），然后通过注射感染植株 A. rhizogenes (B），增殖组织的形成（C，箭头所示为长出的毛状根（D），以及表达红色荧光转化标记 DsRed 的毛状根E). 请点击此处以查看此图的放大版本。
4. 利用 A. tumefaciens 进行植物转化（图2）
注意：本实验步骤可用于获得转基因植株。为评估外源基因的效应，需设置阴性对照。一种选择是使用携带空载体的农杆菌（A. tumefaciens）进行相同操作；另一种选择是使用野生型植株作为对照。
- 取3-4周龄植株的叶片（图2A），剪下并置于培养皿中。使用解剖刀切除叶柄，并从叶片中心向边缘做1-3个横向切割（根据叶片大小决定），注意不要将叶片完全切断（图2B）。
- 立即将叶片背面朝上漂浮于含10 mL新鲜2MS液体培养基的培养皿中，盖上皿盖。每份培养皿中可容纳最多15片Désirée品种或25片ssp. andigena的叶片（根据叶片大小而定），重复此步骤。
- 立即向液体培养基中加入80 µL的A. tumefaciens菌液（OD600 = 0.8），手动轻摇培养皿1分钟，使菌液均匀分布。
- 用封口膜小心密封，再用铝箔包裹，于24 °C培养室中暗培养2天，以完成转化过程。
- 将叶片保持背面朝上转移至CIM培养基（图2B），并在生长培养箱中培养一周。
- 用镊子轻轻刮擦CIM培养基表面，以便叶片更好地贴附于培养基上。
- 将叶片保持背面朝上转移至SIM培养基（图2C），并在生长培养箱中继续培养，每隔7-10天更换一次培养基，直至芽长至约2 cm。
- 用镊子刮擦SIM培养基，使叶片完全被培养基包围。当新生芽触及皿盖时，应使用高型培养皿（100 × 20 mm，高度 × 直径）。
注：愈伤组织通常在SIM培养基中培养2-3周后形成（图2D），芽则在6-7周后出现（图2E）。当芽从独立伤口形成的愈伤组织中长出时，视为独立的转化事件。
- 用镊子刮擦SIM培养基，使叶片完全被培养基包围。当新生芽触及皿盖时，应使用高型培养皿（100 × 20 mm，高度 × 直径）。
- 从每个愈伤组织上切下三个长出的芽（视为同一转化事件）（图2E），转移至添加头孢噻肟钠[250 mg/L]的MG培养基三角瓶中，以促进生根，将该组编号标记，并在生长培养箱中培养3-4周，或直至芽生长健壮（图2F）。
注：切割芽时需彻底去除愈伤组织，否则将影响根的形成。- 根据所需独立转化株系的数量重复此步骤。一个直径为8 cm的三角瓶中最多可放置5个不同的转化事件，以确保不同事件来源的植株不会混杂。
- 从每个转化事件中选择生长最健壮的植株，切取带有3-4个节的茎尖段，接种至添加头孢噻肟钠[250 mg/L]的新鲜2MS培养基三角瓶中。
注：3-6周内植株将高效生长，形成健壮的茎和根。- 将未被选中的芽暂时保留在培养室中，直至所选植株完全发育。
- 从植株上切取至少含有一个节或顶芽的茎段，转移至添加头孢噻肟[250 mg/L]的新鲜2MS培养基中，在生长培养箱中继续培养。
- 每3-4周继代一次，以建立稳定的in vitro转化株系。
注：为确保彻底清除A. tumefaciens，至少需连续三次在含头孢噻肟钠的2MS培养基中继代；若后续观察到A. tumefaciens过度生长，应再次将植株转移至添加头孢噻肟钠的2MS培养基中。
- 每3-4周继代一次，以建立稳定的in vitro转化株系。
- 为进行植株表型鉴定，可将植株移栽至土壤中进行完整表型分析，或转移至水培系统中观察根系。
- 保留植株在土壤中产生的块茎，用于后续繁殖和维持已建立的株系。
图2：利用马铃薯获得转基因植株的时间线 A. tumefaciens. 达到转化过程各阶段所需的累计周数以及后续植物培养步骤如图所示。不同阶段的代表性图像如下：以3周龄植株的叶片作为起始材料进行转化过程的初始阶段 体外 植物（A），将受伤且受感染的叶片转移至 CIM 培养基（B），叶片转移至SIM培养基时（C)，在SIM培养基中培养2-3周后观察伤口周围愈伤组织的形成情况（D），在SIM培养基中培养9-11周后形成芽E），以及转移到MG培养基后的芽F). 请点击此处以查看此图的放大版本。
5. 水培培养
- 在10 L的桶中配制半浓度（0.5x）的霍格兰营养液（表 S2）。
- 将一个水族泵浸入溶液中，以保持营养液的均匀性并提供适当的氧气条件。
- 用铝箔覆盖桶壁，使根系在黑暗条件下生长。
- 避免损伤根系，将in vitro植株转移至水培培养系统中。
注意：在转移过程中，将根部浸入水中并轻轻振荡，以彻底去除残留的in vitro培养基，防止培养期间微生物过度繁殖。 - 用透明薄膜覆盖植株，模拟温室环境，以促进充分的适应性驯化，并将植株置于生长室中培养。
- 3天后在薄膜上打孔，一周后完全移除薄膜。
- 每10天更换一次新鲜培养液。
6. GUS 组织化学报告基因检测
注意：在本实验中，GUS分析采用水培培养2-3周的根进行 体外.
- 用90%预冷的丙酮（v/v）固定根部，并在冰上孵育20分钟。
- 用蒸馏水清洗两次。
- 加入新鲜的GUS染色液（表1），并在-70 Pa条件下抽真空20分钟。
- 在37 °C避光孵育4小时，或直至出现蓝色。
注意：GUS染色液中的铁氰化物和亚铁氰化物可减少反应产物的扩散，从而实现更精确的定位。
警告：处理GUS染色液中的有毒氰化物衍生物（如铁氰化钾和亚铁氰化钾）时，应在通风橱中操作并穿戴防护服。GUS底物及废弃材料应安全处置。 - 移除GUS染色液，并将其弃置于适当的容器中。
- 用70%乙醇（v/v）清洗两次。
- 在明场显微镜下观察。
注意：GUS染色信号可稳定数周；但在第一周内，GUS信号清晰且向邻近细胞的扩散较少。如需长期保存，应密封管子并在4 °C下储存。
表1：GUS染色液配方。
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结果
根癌农杆菌介导的马铃薯遗传转化
在本论文中，建立了一步步获得转化根的实验流程 A. rhizogenes 被展示。 图1 介绍了整个实验流程，总共需要约5-6周时间（从注射开始） A. rhizogenes 获得完全发育的毛状根）。随后，可将植株作为嵌合体（野生型地上部分、转基因根）进行研究，或切下转基因毛状根克隆，在添加2%蔗糖的固体 Gamborg B5 培养基中独立培养。 Alternatively，也可利用液体 Gamborg B5 培养基大规模扩增毛状根。本研究所采用的方法已应用于 S. tuberosum spp. tuberosum （品种 Désirée）
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讨论
在马铃薯中，获得稳定且完整的转基因植株最常用的方法是利用Agrobacterium tumefaciens菌株进行转化，该方法需要通过外源植物激素诱导器官发生。尽管基于Agrobacterium的实验方案有可能整合非T-DNA载体序列25，但该方法仍然是目前最简便且成本最低的马铃薯转化方法。近年来，A. rhizogenes介导的转化引起了研究人员的关注，因其可在比使用A. tumefaciens更短的时间内获得转基因根系。A. rhizogenes仍保留着根诱导（Ri）质粒，该质粒携带一组编码植物激素生长素调控酶、细胞分裂素生物合成酶以及冠瘿碱合成相关蛋白的基因26。一旦Ri T-DNA插入宿主基因组DNA中，新的激素平衡将使受感染细胞的调控失常，进而在感染部位诱导形成大量增殖的根，称为毛状根27。当使用额外的双元载体来整合外源DNA时，Ri质粒的保留使得无需外源施加植物激素或器官发生过程即可获得转化的毛...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到了西班牙创新与科学部（AGL2009-13745，授予PB的FPI奖学金）、经济与竞争力部及欧洲区域发展基金（FEDER）资助（AGL2012-36725，AGL2015-67495-C2-1-R）以及赫罗纳大学（授予SF的博士奖学金和SING11/1项目资助）的支持。作者感谢德国罗斯托克大学土地利用研究所Inge Broer博士提供了A. rhizogenes菌株，西班牙马德里国家生物技术中心Salomé Prat博士提供了A. tumefaciens菌株，同时感谢图卢兹第三保罗萨巴蒂埃大学—法国国家科学研究中心植物研究实验室（LRSV）的Marçal Soler博士和Anna Plasencia博士在启动A. rhizogenes转化实验过程中提供的帮助与支持。作者还感谢赫罗纳大学生物系Sara Gómez在实验操作和植物培养方面提供的宝贵协助，以及Ferran Fontdecaba和Carla Sánchez在完成其本科毕业设计期间对部分实验的参与和支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 丙酮 | Panreac | 1.310.071.21 | |
| 乙酰丁香酮 | 阿克罗斯 | 115540050 | |
| 水族泵 | Prodac | MP350 | |
| 高压灭菌 | Ragpa Strelimatic | ||
| 细菌学琼脂 | Lab Conda | 1800 | |
| BAP | Duchefa | B0904 | |
| 牛肉浸膏 | Lab Conda | 1700 | |
| 植物生长培养箱 | Nuaire | ||
| 羧苄青霉素 | Duchefa | C0109 | |
| 头孢噻肟钠 | Duchefa | C0111 | |
| DMSO | 默克 | 1029310161 | |
| 生态箱信息 | HT | 29378 | |
| 乙醇 | 默克 | 1,009,831,011 | |
| Falcon管 | 技术控制 | CFT011500 | |
| 铁氰化物 | Sigma | 101001081 | |
| 铁氰化物 | Sigma | 100979088 | |
| 烧瓶（直径 8.06 cm，高 11.3 cm）及塑料盖 体外 培养 | Apiglass | ref16 | |
| GA3 | Sigma | G7645 | |
| Gamborg B5 培养基 | Duchefa | G0210 | |
| Gelrite | Duchefa | G1101 | |
| 葡萄糖 | Sigma | G5767 | |
| 卡那霉素 | Sigma | K1377 | |
| Leukopor 胶带 | BSN Leukopor | BDF47467 | |
| 卢佩 | Wild-Heerbrugg | M420 | |
| 磁力摇床 | Agimatic | 7000243 | |
| MES水合物 | Sigma | M2933-25G | |
MgSO₄4 | Panreac | 131404 | |
| 显微镜 | 奥林巴斯 | ||
| Minufugue centrifugue 5415R | Eppendorf | ||
| Murashige和Skoog培养基 | Duchefa | M0254.0050 | |
Na2HPO4 | Panreac | 131679 | |
| NAA | Duchefa | N0903 | |
| NaCl | Panreac | 131659 | |
NaH2PO4 | Sigma | 58282 | |
| NightSea Stereo | SFA 月球支架适配器 | ||
| Parafilm | Anorsa | PRFL-001-001 | |
| 蛋白胨 | 实验室 Conda | 1616 | |
| 培养皿（90 × 14） | Anorsa | 200200 | |
| pH计 | 克里森 | ||
| 植物培养室 | Inkoa | RFTI-R5485 | |
| 植物琼脂 | Duchefa | P1001 | |
| 冰箱 | Liebherr Medline | ||
| 利福平 | Duchefa | R0146 | |
| 壮观霉素 | Sigma | 59007 | |
| 分光光度计 | 岛津 | ||
| 方形培养皿（120 x 120） | Deltalab | 200204 | |
| 链霉素 | Sigma | S6501 | |
| 蔗糖 | Panreac | 131621 | |
| 手术刀片 | Swann-Morton | 201 | |
| 外科手术针 | NIPRO | 015/0204 | |
| 胰蛋白胨 | Lab Conda | 1612 | |
| Triton | 塞尔瓦 | 37240 | |
| Unimax 1010 摇床 | Heidolph | ||
| 真空 | Dinko | ||
| 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸钠盐（无水） | Biosynth | B-7398 | |
| 酵母提取物 | Lab Conda | 1702.00 | |
| 玉米素核苷 | Sigma | 1001042850 |
参考文献
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