在三维水凝胶中测量全细胞基质金属蛋白酶及代谢活性

摘要

本文介绍了一种将细胞包封并培养在功能化聚乙二醇（PEG）水凝胶中的实验方案，该水凝胶含有可被荧光基质金属蛋白酶（MMP）降解的肽段。通过标准的微孔板读数仪，可直接从水凝胶培养物中检测细胞的MMP活性及代谢活性。

摘要

三维（3D）细胞培养系统通常比传统的二维（2D）培养系统更接近地模拟体内（in vivo）细胞的响应和功能。然而，在3D培养中检测细胞功能往往更具挑战性。许多生物学检测需要回收细胞材料，而在3D培养中这一过程可能较为困难。解决这一挑战的方法之一是开发新型材料，使细胞功能的检测能够在材料内部直接进行。本文介绍了一种在96孔板格式中检测3D水凝胶内细胞基质金属蛋白酶（MMP）活性的方法。在该系统中，聚乙二醇（PEG）水凝胶被修饰上一种可被MMP切割的荧光探针。细胞MMP活性与荧光强度成正比，可使用标准的微孔板读数仪进行检测。与先前的24孔板版本相比，将该检测微型化至96孔板格式后，每个实验条件下的操作时间减少了50%，试剂用量减少了80%。该检测还可与其他细胞功能检测兼容。例如，本文展示了代谢活性检测，可在同一水凝胶中与MMP活性检测同时进行。本方法以包封于不同接种密度下的人黑色素瘤细胞进行验证，以确定适用于该检测工作范围的细胞包封密度。细胞包封24小时后，MMP活性和代谢活性的读数均与细胞接种密度成正比。尽管本文仅使用了一种荧光可降解底物进行演示，但该检测方法可适用于多种水凝胶体系及其他荧光传感器。此类检测为多种应用提供了一个实用、高效且易于操作的3D细胞培养平台。

引言

三维（3D）培养系统通常能更真实地模拟 体内 相较于传统的二维（2D）培养系统，可参见几篇优秀的出版物^1,2,3然而，由于细胞回收和后续样品处理的困难，利用三维（3D）培养系统检测细胞功能一直面临挑战。这一难题限制了在3D培养系统中对多种细胞功能的测定。为克服这一障碍，亟需开发能够便捷检测3D环境中细胞功能的新技术。其中一种解决方案是研制既能支持3D细胞培养又可集成传感器以检测细胞功能的材料。例如，已有多种水凝胶系统引入了荧光生成型蛋白酶可裂解基团，以实现对3D环境中蛋白酶活性的可视化检测。^4,5,6,7尽管这些系统最初用于显微成像，但也可通过标准酶标仪适配用于全局基质金属蛋白酶（MMP）活性检测，从而能够在三维环境中便捷地测量细胞功能⁸.

基质金属蛋白酶（MMPs）是一类锌依赖性蛋白酶超家族，在正常组织稳态以及多种疾病中发挥关键作用。MMPs 可降解并重塑细胞外基质（EC....

方案

1. 水凝胶组分的制备

1. 按照文献所述方法合成荧光蛋白酶可降解肽⁸，使用荧光素作为荧光分子，dabcyl 作为淬灭剂。将肽溶解于 DMSO 中，浓度为 10 mM，并以小份（约 30 µL）分装后储存于 -80 °C 冰箱中，以避免反复冻融循环。
   注意：这些肽也可商业购买。本方案要求肽序列具有 C 末端半胱氨酸，以便共价整合到水凝胶聚合物网络中。
2. 按照文献所述方法制备 8 臂 40 kDa 聚乙二醇胺（PEG）-降冰片烯（NB）¹⁷。使用 ¹H NMR 验证端基官能化程度高于 90%。将 PEG-NB 溶解于无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中，浓度为 25% w/v，并以小份（约 300 µL）分装后储存于 -80 °C 冰箱中。
   注意：带有降冰片烯官能化的 PEG 也可商业购买。
3. 按照文献所述方法合成光引发剂锂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次磷酸盐（LAP）¹⁸。将 LAP 溶解于无菌水中，浓度为 68 mM，并以小份（约 300 µL）分装后储存于 -80 °C 冰箱中。
   注意：可选用 Irgacure（2-羟基-4′-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮）作为替代光引发剂。LAP 和 Irgacure 均可商业购买。
4. 将 MMP 可降解肽交联剂（....

结果

本实验方法改编自先前开发并表征的3D水凝胶培养系统，该系统功能化地结合了一种可被基质金属蛋白酶（MMP）切割的荧光传感器⁸。此处使用的荧光MMP传感器包含一段肽序列GPLAC(pMeOBzl)↓WARKDDK(AdOO)C（↓表示切割位点），该序列此前已优化，可被MMP-14和MMP-11高效切割¹⁹。该肽序列在切割位点两侧分别标记了荧光分子（荧光素）和淬灭分子（dabcyl）（图1）。当荧光传感器暴露于相应的蛋白酶时，荧光基团与淬灭基团分离，荧光信号随之增强。本研究中，实验体系从24孔板缩小至96孔板格式，省略了包封过程中的多个步骤，使实验所需时间减少了50%。此外，试剂消耗量减少了80%，因为每孔水凝胶体积从50 µL减少至10 µL。同时，使用96孔板可检测20个条件（每个条件设三个复孔），而24孔板仅能检测12个条件（每个条件设两个复孔）。细胞包封过程的示意图见图2

讨论

三维体外细胞培养可模拟体内环境的诸多重要特征。然而，三维培养也使得细胞功能与信号转导的检测面临挑战，因为许多生物学检测方法需要回收细胞并获取大量细胞样本。因此，开发一种无需额外样品处理即可直接测量细胞功能的简易三维培养系统，将显著提升三维培养系统的实用性。本文所述的三维系统可适用于多种不同应用。荧光传感器的序列可进行调整以检测其他蛋白酶。例如，此前已使用可被基质金属蛋白酶 MMP-1、-2、-3、-7、-8 和 -9 切割的荧光可裂解传感器序列（GPQG↓IWGQK）来检测黑色素瘤在化疗药物作用下的 MMP 活性。²²聚乙二醇（PEG）水凝胶系统的使用还可实现对细胞微环境的精确独立调控，包括水凝胶内的力学性能、可降解性以及基质黏附基团。本研究中所用的黏附分子RGD是一种源自纤连蛋白的序列，可介导整合素依赖性黏附。其他源自纤维蛋白原和层粘连蛋白的黏附分子，如RLD和IKVAV，也可被用于激活不同类型的整合素受体。例如，已有研究证明，改变黏附分子会影响主动脉瓣间质细胞（VIC）的伸长，这可能对主动脉瓣狭窄产生影响¹⁵水凝胶交联剂序列可调控水凝胶的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1× 磷酸盐缓冲液	Fisher Scientific	10-010-049
活性炭	Sigma-Aldrich	C3345
黑色圆底 96 孔板	Brand-Tech	89093-600
细胞黏附肽（CRGDS）	GenScript USA Inc.	定制合成
Ⅰ型胶原酶	Life Technologies	17100-017
葡聚糖	Sigma-Aldrich	D4876
DMEM 高糖培养基	Invitrogen	11965118
胎牛血清（FBS）	Seradigm	1500-500
荧光酶标仪	BioTek	Cytation 3
血细胞计数板	Hausser Scientific Co.	3200
L-谷氨酰胺	Life Technologies	25030-081
MMP 可降解肽交联剂（KCGPQG↓IWGQCK）	GenScript USA Inc.	定制合成
NaOH	Fisher Scientific	S318500
青霉素/链霉素	Life Technologies	15140-122
刃天青（Alamar Blue）	Life Technologies	DAL1100
紫外灯	UVP	95-0006-02