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方法文章

细胞条件培养基中外泌体的流式细胞术分析

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DOI：

10.3791/59128

⸱

2019年2月12日

 ,  ,  , 
1Cellular and Molecular Cardiology Laboratory, Cardiocentro Ticino Foundation, Switzerland, 2Molecular Cardiology Institute, Dept. of Cardiology, University of Zürich, 3Faculty of Biomedical Science, Università Svizzera Italiana, Switzerland

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了一种可重复的方法，专为使用细胞培养上清液检测小细胞外囊泡（EV）表面表位而设计。该方法利用与识别表面抗原CD9、CD63和CD81的抗体偶联的磁珠，对EV进行特异性免疫沉淀。本方法已针对后续的流式细胞术分析进行了优化。

摘要

流式细胞术（FC）是半定量检测细胞表面抗原标志物的首选方法。近年来，该技术已被用于外周血及其他体液中外泌体（Exo）等细胞外囊泡（EV）的表型分析。由于EV体积微小，必须使用检测阈值约为50–100 nm的专用仪器进行检测。另一种方法是将EV结合到可被流式细胞仪检测的乳胶微珠上。通过将识别EV相关标志物/分化簇CD63、CD9和CD81的抗体与微珠偶联，可用于捕获EV。来自CM的Exo可经或不经超速离心预富集后进行分析。该方法适用于使用常规流式细胞仪进行EV分析。我们的结果表明，平均荧光强度（MFI）值与EV浓度之间存在线性相关性。通过超声处理破坏EV后，MFI显著降低，表明该方法不会检测膜碎片。我们报道了一种准确且可靠的EV表面抗原分析方法，可在任何实验室中轻松实施。

引言

细胞会分泌不同大小的细胞外囊泡（EV），包括微囊泡（MV）和外泌体（Exo）。后者可通过大小和细胞内来源区室与MV区分开来。MV（大小为200–1,000 nm）通过质膜脱落从母细胞释放。相反，Exo（30–150 nm）起源于内体膜，当多泡体（MVB）与细胞膜融合时，被释放到细胞外空间1,2。

细胞外囊泡（EV）正越来越多地被用作多种疾病领域的诊断生物标志物，并有望成为治疗工具，这些领域包括肿瘤学、神经学、心脏病学以及肌肉骨骼疾病3,4,5。目前大多数将EV作为治疗剂的研究，均采用体外培养细胞的条件培养基（CM）来分离囊泡。间充质干细胞（MSCs）在多种病理背景下具有有益作用，而来源于MSC的EV在心肌缺血/再灌注损伤6和脑损伤7模型中也显示出治疗优势。MSC来源的EV还表现出免疫调节活性，可用于治疗免疫排斥反应，这一点已在难治性移植物抗宿主病模型中得到证实8。羊水干细胞（hAFS）能够主动向条件培养基中释放微囊泡（MVs）和外泌体（Exo），其大小呈异质性分布（50–1,000 nm），并介导多种生物学效应，如促进分化细胞增殖、血管生成、抑制纤维化以及心肌保护作用4。我们近期研究表明，由人心脏来源祖细胞分泌的EV，尤其是外泌体（Exo-CPC），可减小大鼠心肌梗死面积5,9。

外泌体（Exo）表面具有一组共同的蛋白质，包括四次跨膜蛋白（CD63、CD81、CD9）和主要组织相容性复合物I类分子（MHC-I）。除了这些共有蛋白外，外泌体还含有源自产生细胞类型的特定细胞外囊泡（EV）亚群的特异性蛋白质。外泌体标志物正变得愈发重要，因为它们在细胞间通讯中发挥关键作用，从而调控多种生物学过程5,10。由于其体积微小，利用传统流式细胞术（FC）对EV进行分析仍是一项具有挑战性的任务。

本文介绍了一种利用流式细胞术（FC）进行细胞外囊泡（EV）分析的简化方案，该方法可应用于通过超速离心获得的预富集样品，也可直接用于条件培养基（CM）（图1）。该方法采用包被特异性抗体的微球，该抗体可结合典型的外泌体（Exo）相关表面表位（CD63、CD9、CD81），且无需额外洗涤步骤。流式细胞术分析可使用常规流式细胞仪进行，测量前无需仪器调整。已有其他研究小组报道了利用流式细胞仪对单个小型颗粒上的抗原进行表征的方法，并涉及多种应用11,12,13。本文中，我们采用功能化磁珠捕获小型颗粒及外泌体（Exo），随后通过流式细胞术对捕获的颗粒进行表型分析。尽管该方法可用于表征任何细胞类型在体外释放的小型囊泡的抗原组成，但本文提供了适用于人源心脏前体细胞（CPC）培养的特定细胞培养条件，以及促进这些细胞产生细胞外囊泡（EV）的最适环境。

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方案

1. 条件培养基的收集与处理

  1. 用 PBS 中含 0.02% 猪皮明胶的溶液包被 55 cm2 培养皿。
  2. 在预先包被的培养皿中接种 CPC（8,000/cm2），加入 7 mL 添加了 20% FBS（胎牛血清）和 1% 青霉素/链霉素（P/S）的 Iscove 改良 Dulbecco 培养基（IMDM）。
    注意：“CPC”指来源于人类组织块的细胞，其特性已在其他文献中描述14。可在特定培养条件下，从不同类型的细胞中收集条件培养基（CM）。操作时需佩戴手套，并在生物安全柜中进行。
  3. 当细胞融合度达到约 80% 时，移除培养基，用无钙镁的 Dulbecco 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次，随后更换为 10 mL 无血清的外泌体生产培养基（高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 [DMEM]，4.5 g/mL）。
    注意：应逐步降低培养基中的血清浓度，使细胞逐渐适应无血清（SF）条件。对于对无血清培养基敏感的细胞，可准备含有经囊泡耗尽处理的 FBS 的培养基。配制含全部营养成分并添加 10%–20%（v/v）FBS 的培养基，于 100,000 × g、4 °C 条件下离心过夜。需注意，该步骤不能确保完全去除 FBS 来源的细胞外囊泡（EV）。
  4. 7 天后，将条件培养基收集至聚丙烯离心管中。
    注意：培养基的条件化时间取决于细胞类型。对于对无血清培养基敏感的细胞，可增加初始培养基体积，并将条件培养基收集时间缩短至 24–48 小时。
  5. 在 4–10 °C 条件下，以 3,000 × g 离心 20 分钟，去除条件培养基中的细胞碎片，将上清液转移至 100 kDa 截留分子量的离心过滤管中。
  6. 在 4–10 °C 条件下，以 2,000 × g 离心 20 分钟，浓缩已去除碎片的条件培养基。
    注意：此步骤可减少条件培养基的初始体积，便于后续高速离心步骤使用小体积离心管，同时有助于去除小的蛋白聚集体。
  7. 将浓缩液转移至微量离心管中，在 4–10 °C 条件下以 10,000 × g 离心 15 分钟。
  8. 收集上清液，进入第 2 部分（EV 富集）。若无超速离心机，可直接进入第 3 部分（纳米颗粒追踪分析（NTA）定量）。
    注意：对 EV 组分进行预富集可提高荧光强度的最终检测信号（见代表性结果及 图 4）。已去除碎片的条件培养基（来自步骤 1.8）可在 4 °C 保存不超过 1–2 天，或在 −80 °C 保存数月5。在 −80 °C 冻存前应对条件培养基进行预清除，以去除任何细胞碎片，防止冻融过程中形成外泌体大小的碎片。

2. 通过超速离心法富集细胞外囊泡（可选）

  1. 将步骤 1.8 的上清液置于聚碳酸酯厚壁超速离心管中。用 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）填充离心管，直至达到最大容量（3.2 mL）。
  2. 将样品装入钛制固定角转子（8 × 3.2 mL，k 值为 13）中。将转子放入台式超速离心机。在 4–10 °C 条件下，以 100,000 × g 离心 3 小时。
  3. 弃去上清液，并将沉淀重悬于 100 µL 的 1× PBS 中。

3. 纳米颗粒跟踪分析（NTA）定量

  1. 取1 µL样品（来自步骤2.3或1.8），用999 µL的1x PBS稀释。将样品加入1 mL注射器中，避免产生气泡。将注射器装载到检测室的进样口。
  2. 打开激光器。点击采集按钮启动摄像头。调节焦距。
  3. 至少记录3个不同的视频帧，每个持续60秒。
  4. 使用软件中的批量处理选项分析这3次不同的采集数据。
    注意：若无纳米颗粒追踪分析（NTA）技术，可通过Bradford法进行蛋白定量（超速离心后，1 × 108个颗粒相当于1–2 µg总蛋白；若直接对条件培养基（CM）进行定量，则相当于50–60 µg总蛋白，因其包含非细胞外囊泡来源的蛋白污染物；见表1）5。

4. 样品制备

  1. 准备3种捕获微珠（CD9微珠、CD63微珠和CD81微珠，按1:1:1比例混合；参见材料表）的混合液，并涡旋混匀。
    注意：该混合液经测试可在1个月内保持稳定。也可单独使用某一种捕获微珠，这有助于检测无法通过混合微珠区分的EV亚群。使用单一抗原捕获微珠可同时检测四跨膜蛋白（如CD9、CD81或CD63）以及由荧光抗体识别的目标抗原。此外，市面上也可购得其他类型的醛基-硫酸酯乳胶微珠，其表面具有疏水性，可用于微囊泡（MV）和EV的吸附。
  2. 在圆底管中加入相当于1 × 108 个颗粒体积的样本，并加入1 µL微珠混合液，总计约1.2 × 105 个微珠（每个检测样本）。
  3. 准备一个仅含1 µL微珠但不含EV的对照管，作为阴性对照，下文简称“微珠对照”。
  4. 用1×PBS将体系体积调整至100 µL。将管子置于恒温混匀仪中，在4–10 °C条件下以400 rpm振荡过夜。
  5. 次日，将样品转移至圆底96孔板（或流式细胞管）中。
  6. 加入抗体（CD9_FITC终浓度为10 µg/mL，CD63_PE终浓度为10 µg/mL，CD81_PE终浓度为5 µg/mL）。
  7. 在4–10 °C条件下孵育1小时。
  8. 向每孔加入100 µL 1×PBS。
  9. 进行上机检测。

5. 采集

  1. 打开采集软件并启动仪器（流式细胞仪 > 系统启动程序）。新建一个实验。
  2. 创建实验模板，然后选择 孔板，再选择 添加孔板。选择样本在孔板上的位置，然后点击 设为样本孔。
  3. 在 命名规则 中输入样本名称（例如：CPC#1_CD9FITC）。打开 通道 选项卡，并启用 FITC 和 PE 通道。
  4. 将孔板装入仪器中。
  5. 点击 散点图，创建一个新的散点图（P1）。设置前向散射面积（FSC-A）对侧向散射面积（SSC-A）。
  6. 选择 初始化 以启动激光器和流体系统。点击 采集 开始数据采集。
  7. 调整坐标尺度，使P1图中的细胞群位于中央。在P1图中围绕整个微球群体（排除碎片）绘制“BEADS”门（图2A）。点击 停止。
  8. 点击 散点图，创建一个新的散点图（P2）。设置前向散射高度（FSC-H）对前向散射面积（FSC-A）。将该散点图设门于“BEADS”群体上。在P2图中围绕较大的细胞群绘制一个新的门，并命名为“SINGLETS”（图2A）。
    注意： 此策略旨在尽可能避免在数据采集和分析过程中包含微球聚集体。
  9. 点击 散点图，创建两个不同的散点图：一个为FITC对SSC-A，另一个为PE对SSC-A。将这两个散点图均设门于“SINGLETS”群体上。
  10. 选择要记录的 事件数（例如：20,000）。选择 记录 并开始实验。

6. 数据分析

  1. 将采集文件载入分析软件中。
    注意： 以下步骤必须应用于每个样本，包括仅含微球的样本和所有未知样本。
  2. 新建一个实验方案，并按照步骤5中描述的相同策略创建散点图。
  3. 将所有散射光轴设置为线性刻度，所有荧光轴设置为对数刻度。
  4. 显示FITC和PE通道中的荧光几何平均值（X-Gmean-MFI）。
  5. 计算样本的X-Gmean与未加外泌体但用抗体标记的微球的X-Gmean之间的比值。
  6. 比较不同EV制备物的MFI倍数变化。

7. 细胞外囊泡数量滴定

注意：第7至第10节可用于确定颗粒数量、抗体浓度及特异性，但如果细胞外囊泡（EV）来源的细胞类型和所用抗体保持不变，则可跳过这些步骤。

  1. 将步骤 2.3 获得的颗粒用 1× PBS 稀释，制备一系列颗粒浓度范围为 5 × 105 至 2.5 × 108 的悬浮液。
  2. 向每种悬浮液中加入 1 µL 捕获微球混合液至圆底管中。
  3. 按照步骤 4.3 的方案进行操作。

8. 抗体滴定

注意：抗体滴定通常通过为每根试管添加一种单一抗体来完成。

  1. 保持所有样本中外泌体（总颗粒数或蛋白质含量）的数量恒定。
    注意：合适的数量需根据上述第7节所述方法通过实验确定。
  2. 按照步骤4.1至4.5的方案操作。
  3. 在供应商推荐浓度的上下范围内测试一系列抗体浓度。例如，对于建议使用浓度为10 µg/mL的抗体，应测试1、2、5、10、20和50 µg/mL等不同浓度。同时设置一个“仅微珠”对照样本，并加入最高浓度的抗体。
  4. 在4–10 °C条件下孵育1小时。
  5. 每份样本中加入100 µL的1x PBS。
  6. 上机检测样本。

9. 孵育时间

  1. 通过在不同时间点（例如 1 h、2 h 和 5 h）进行采集，验证孵育时间。
  2. 从第 4 节开始，按照方案操作。
  3. 将样品在 4–10 °C 下孵育 1 h。
  4. 采集样品。
  5. 将样品在 4–10 °C 下孵育 3 h。
  6. 采集样品。

10. 方案验证

  1. EV 结合
    1. 在圆底管中，加入相当于 1 × 108 个颗粒或相应总量蛋白的体积。
    2. 用 1× PBS 将体积调整至 100 µL。
    3. 根据制造商说明书，通过超声处理破坏 EV 膜（也可采用热激步骤）。设定频率和强度。超声时间可通过设置时间梯度实验（例如 0 秒、30 秒、1 分钟、5 分钟等）经验性确定。
    4. 加入 1 µL 磁珠混合液。
    5. 从步骤 4.4 开始继续执行后续方案。
  2. 抗体特异性
    1. 为每种荧光染料标记的 IgG 准备一个管，并按步骤 4.6 所述加入磁珠-EV 复合物。
      注意： 荧光染料标记的同型对照必须与所用抗体的 IgG 类型相匹配。

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结果

单染色的总颗粒数

由于单个磁珠可结合多个颗粒，我们测试了不同条件，以确定达到MFI曲线早期指数相所需的最少总EV量（每管单个抗体）。实验采用固定浓度的抗体，总颗粒数从5 × 105 到 2.5 × 108 不等。如图3A所示，能够确保抗体在可接受MFI范围内发挥作用并避免过量使用EV的颗粒数量为1 × 108 颗粒/染色。

抗体滴定

我们选择了能够产生最强信号并防止非特异性抗体结合的合适抗体浓度。根据前期实验条件确定，本检...

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讨论

传统的流式细胞术（FC）仍是表征细胞外囊泡（EV）表面标志物最直接的分析方法。因此，选择最合适的实验方案对于克服仪器灵敏度限制，从而获取目标单个颗粒组分的有用信息至关重要。我们描述了一种使用磁性颗粒偶联抗体的方法，这些抗体可识别外泌体（Exo）和小型EV的表面抗原，适用于后续的流式细胞术应用。我们采用两种不同的细胞类型对该方法进行了验证：一是原代人心脏祖细胞（CPC），其作为基于外泌体治疗心脏疾病的重要细胞来源正受到广泛关注；二是HEK293细胞，这是一种永生化细胞系，因其稳定的细胞生长特性和可塑性，被广泛应用于细胞生物学研究中。

该方法可用于经超速离心富集的细胞外囊泡（EV），也可为加快分析速度，直接应用于未经超速离心预富集的体外细胞来源的条件培养基（CM）。在比较样品时，起始材料至关重要。将捕获微珠直接加入条件培养基中虽可加快操作流程，但会同时降低荧光强度，如图4A所示。在第4.4步“捕获”过程中，使用适量的磷酸盐缓冲液（PBS）混合微珠与EV也十分关键。若孵育时间保持恒定，体积增加将导致EV偶联效率降低，从而减弱荧光...

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致谢

L.B. 获得了瑞士苏黎世赫尔穆特·霍尔滕基金会（Helmut Horten Stiftung）和维卢克斯基金会（Velux Stiftung）的研究资助。G.V. 获得了瑞士国家科学基金会、卢加诺切奇莉亚-奥古斯塔基金会（Cecilia-Augusta Foundation）以及瑞士SHK心血管疾病基金会（SHK Stiftung für Herz- und Kreislaufkrankheiten）的研究资助

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
IMDMGibco12440061
Amicon Ultra-15，PLHK Ultracel-PL 膜，100 kDa MilliporeUFC910024
CytoFlex 流式细胞仪平台Beckman CoulterCytoFlex
DMEM，高糖，含 HEPES，无酚红Gibco21063045
杜氏磷酸盐缓冲液（PBS），无钙无镁LonzaBE17-512F
ExoCap CD63 捕获试剂盒JSR Life SciencesEx-C63-SP
ExoCap CD81 捕获试剂盒JSR Life SciencesEx-C81-SP
ExoCap CD9 捕获试剂盒JSR Life SciencesEx-C9-SP
外泌体耗尽型胎牛血清ThermofisherA2720801
外泌体耗尽型胎牛血清培养基补充剂SBIEXO-FBS-250A-1
FBS-胎牛血清Gibco10270106
FITC 标记抗人 CD9 抗体Biolegend312104           RRID: AB_2075894
流式细胞仪分析软件Beckman CoulterKaluza
NanoSight LM10MalvernNanoSight LM10
NanoSight 软件MalvernNTA 2.3
Optima Max-XPBeckman Coulter393315
PE 标记抗人 CD63 抗体Biolegend353004           RRID:AB_10897809
PE 标记抗人 CD81 (TAPA-1) 抗体Biolegend349505           RRID:AB_10642024
青霉素-链霉素Gibco15140122
Thermomixer CEppendorf5382 000 015
TLA-110Beckman CoulterTLA-110 转子

参考文献

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