方法文章

细胞调理介质细胞外囊泡的流式细胞学分析

DOI：

10.3791/59128

⸱

2019年2月12日

 ,  ,  , 
1Cellular and Molecular Cardiology Laboratory, Cardiocentro Ticino Foundation, Switzerland, 2Molecular Cardiology Institute, Dept. of Cardiology, University of Zürich, 3Faculty of Biomedical Science, Università Svizzera Italiana, Switzerland

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该协议描述了一种可重复的方法, 该方法设计用于细胞培养上清液, 以检测小细胞外囊泡 (ev) 上的表面表位。它利用特定的 ev 免疫沉淀使用珠子与抗体结合, 识别表面抗原 cd9, cd63 和 cd81。该方法对下游流式细胞仪分析进行了优化。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

流式细胞术 (fc) 是细胞表面抗原标志物半定量测量的首选方法。近年来, 该技术已被用于外周血和其他体液中的外细胞囊泡 (ev) (ev) 的表型分析。ev 体积小, 要求使用检测阈值在50-100 纳米左右的专用仪器。或者, ev 可以绑定到可由 fc 检测到的乳胶微珠。微珠, 与抗体结合, 识别与 ev 相关的标记--分化 cd63、cd9 和 cd81 的聚类可用于电动汽车捕获。从 cm 分离出的 exo 可以用超离心法进行预浓缩或不浓缩的分析。该方法适用于使用传统 fc 仪器的电动汽车分析。我们的结果表明, 平均荧光强度 (mfi) 值与 ev 浓度之间存在线性关系。通过超声破坏 ev 的 mfi 大幅减少, 表明该方法不能检测到膜碎片。我们报告了一种准确可靠的 ev 表面抗原分析方法, 可在任何实验室轻松实施。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

细胞分泌不同大小的细胞外囊泡 (ev), 包括微囊泡 (mv) 和外显子体 (exo)。后者可以通过大小和源亚细胞隔间来区别于 mv。mv (200–1000 nm 大小) 通过从质膜脱落从母细胞中释放。相反, exo (30–150 nm) 起源于子宫内膜, 当多泡体 (mvb) 与细胞膜1,2融合时, exo (30–150 nm) 会释放到细胞外空间。

ev 越来越多地被用作诊断生物标志物, 并可能被用作许多领域的治疗工具, 包括肿瘤学、神经病学、心脏病和肌肉骨骼疾病3, 4,5。绝大多数正在进行的使用 ev 作为治疗药物的研究利用从细胞条件下的细胞培养基 (cm) 的离体外培养细胞 (cm) 中分离出的小泡。间充质干细胞 (mscs) 在多种情况下发挥着有益的作用, msc 衍生的 ev 在心肌缺血再灌注损伤6和脑损伤7的模型中表现出了有益的效果。msc 衍生的 ev 还表现出免疫调节活性, 可用于治疗免疫排斥, 如治疗难治性移植物抗宿主病模型8所示。羊水干细胞 (hafs) 用 mv 和 exo 积极丰富 cm, 在大小 (50–1000 nm) 上分布不均匀, 介导了几种生物效应, 如分化细胞增殖、血管生成、纤维化抑制、心脏保护4。我们最近已经证明, ev, 特别是 exo, 由人类心源性祖细胞 (exo-cpc) 分泌减少心肌梗死大小的大鼠 5,9。

exo 在其表面共享一组常见的蛋白质, 包括四帕辛 (cd63、cd81、cd9) 和主要组织相容性复合体 i 类 (mhc-i)。除了这一组常见的蛋白质外, exo 还包含特定于生产者细胞类型的 ev 子集的蛋白质。exo 标记越来越重要, 因为它们在细胞间通信中起着至关重要的作用, 从而调节了许多生物过程5,10。由于电动汽车体积小, 找到一种使用经典流式细胞仪 (fc) 分析 ev 的简单方法仍然是一项具有挑战性的任务。

在这里, 我们提出了一个使用 fc 进行 ev 分析的简化协议, 该协议可应用于通过超离心或直接应用于 cm 获得的预浓缩样品 (图 1)。该方法使用带有特定抗体的珠子, 该抗体结合了规范的外源表面表位 (cd63、cd9、cd81), 无需额外清洗。fc 分析可以使用传统的细胞仪进行, 无需在测量前进行调整。其他群体在各种应用中描述了利用流式细胞仪对单个小颗粒进行抗原表征的方法11、12、13。在这里, 我们使用功能化磁珠捕获小颗粒和 exo, 然后由 fc 对捕获的粒子进行表型。虽然这种方法可以用来表征任何细胞在体外释放的小囊泡的抗原成分, 但在这里我们提供了适用于人类心脏祖细胞培养 (cpc) 和最多的特定细胞培养条件。适当的环境, 为这些细胞生产的 ev。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 有条件介质的收集和处理

  1. 在 pbs中涂上55厘米2培养皿, 含有0.02% 的猪皮明胶。
  2. 板 cpc (8, 000/cm 2) 在预涂层的菜肴与7毫升的 iscove 的改性 dulbecco 的培养基 (imdm) 补充 20% fbs (胎儿牛血清) 和 1% penicililin/strepmicin (p/s).
    请注意:"cpc" 一词是指其他地方所描述的人类外植体衍生细胞。cm 可以从在特定培养条件下培养的不同细胞类型中收集。戴上手套, 在生物罩下工作。
  3. 一旦细胞达到约80% 的融合, 去除培养基, 用 dulbecco 的 pbs (pbs) ca-d-和 mL 清洗细胞两次, 并以10毫升的无血清外生产介质 (dulbecco 的改性鹰的培养基 [dmem] 高葡萄糖, 4.5 gml) 取代它。
    请注意:在培养基中逐渐降低血清浓度, 使细胞逐渐适应无血清状态 (sf)。对于对无血清介质敏感的细胞, 准备一种含有 fbs 但 ev 耗尽的培养基。准备培养基补充所有营养物质, 再加上 10–20% (v/v) fbs。在 10万xg ,4°c 的温度下离心介质过夜。请注意, 此过程不能保证100% 删除 fbs 派生的 ev。
  4. 7天后, 将 cm 收集在聚丙烯离心管中。
    请注意:中等调节的时间取决于细胞类型。对于对无血清介质敏感的细胞, 增加介质的初始体积, 并将 cm 采集时间缩短到24-48。
  5. 用离心机从电池碎片中清除 cm, 在 4–10°c 下, 用 3, 000 x g 清除20分钟。收集在 100 kda 离心管中的上清液。
  6. 在4–10°c 下, 以 2, 000 x g的速度将管材中的 20分钟, 将清管浓缩。
    请注意:这一步骤将减少 cm 的初始体积, 允许使用小体积管的高速离心机步骤, 并将有助于消除小的蛋白质集合。
  7. 在微离心管中收集精矿。在4–10°c 下 , 以 10, 000 x g 离心15分钟。
  8. 收集上清液, 并继续进行第2节 (ev 浓缩)。如果没有超离心机, 请直接进入第3节 (纳米粒子跟踪分析 (nta) 定量)。
    请注意:ev 分数的预浓缩提高了荧光强度的最终读出 (参见代表性结果和图 4)。已清除的 cm (从1.8 点开始) 可以在4°c 下存储不再是 1-2天, 也可以在-80°C 储存几个月。5应预先清除 cm, 以便在储存前清除任何细胞碎片, 80°C, 以确保在冻融过程中不会形成外孔大小的碎片。

2. 超离心机对细胞外血管的浓缩 (可选)

  1. 将1.8 步中的上清液放入聚碳酸酯厚壁超离心管中。在试管中加入1x 磷酸盐缓冲盐水 (pbs), 直到其达到最大容量 (3.2 ml)。
  2. 在钛固定角转子 (8 x 3.2 ml, k 因子 13) 中加载样品。将转子装入平板超离心机。在4–10°c 条件下, 以 100, 000 x 克的速度进行3小时的超离心。
  3. 丢弃上清液, 并在100μl 的 1x pbs 中重新悬浮颗粒。

3. 纳米粒子跟踪分析 (nta) 的量化

  1. 将样品的 1μl (从2.3 步或1.8 步) 稀释为 1 x pbs 的999μl。在1毫升注射器中加载样品, 避免气泡形成。将注射器装入检查室的入口端口。
  2. 打开激光。使用"捕捉"按钮打开相机。调整焦点。
  3. 记录至少3个不同的帧, 每个帧60秒。
  4. 使用软件中的批处理选项分析3种不同的采购。
    请注意:如果没有 nta 技术, 则通过 bradford 检测 (1 x10 8粒子在超离心后相当于1–2μg 的总蛋白质, 或者如果直接对 cm 进行定量, 则为 cm 进行定量。它包括不同于 ev 的蛋白质污染物;见表 1)5。

4. 样品制备

  1. 准备3种捕获珠 (cd9 珠子、cd63 珠子和 cd81 珠子的池, 比例为 1:1; 见材料表) 和涡流。
    请注意:该池已经过测试, 稳定了1个月。可以使用一种类型的捕获珠子, 这将允许检测 ev 子种群不被识别与珠子池。通过使用单一抗原捕获珠, 将有可能在当代证明存在四帕辛蛋白, 如 cd9、cd81 或 cd63, 以及荧光抗体检测到的感兴趣的抗原。替代的硫酸醛乳胶珠也可在市场上买到。这些珠子具有疏水表面, 用于对 mv 和 ev 的吸附。
  2. 在圆底管中, 添加与 1 x 108个颗粒相乘的体积量加上1微米的珠子池, 相当于总共 1.2 x10 5珠 (每次测试)。
  3. 准备一个管含有1μl 的珠子没有 ev, 这将作为负控制, 在此被称为 "珠子"。
  4. 使用 1x pbs 将体积调整为100μl。将管材放入热混合器中, 在4–10°c 下隔夜以400转/分的速度摇晃。
  5. 第二天, 将样品移动到一个圆的底部96孔板 (或 fc 管)。
  6. 加入抗体 (CD9_FITC 10μgml、CD63_PE 10μgml 和 CD81_PE 的 5μgml)。
  7. 在4–10°c 下孵化1小时。
  8. 在每口井中加入100μl 的 1x pbs。
  9. 继续获取。

5. 收购

  1. 打开采集软件并启动仪器 (cy目仪 > 系统启动程序)。打开一个新的实验。
  2. 创建一个实验模板, 然后选择 "板" , 然后选择"添加板"。选择样品在板上的位置, 然后按"设置为样品井"。
  3. 在命名规则中输入示例名称 (即 CPC#1_CD9FITC)。打开"通道" 选项卡, 然后打开 fitc 和 pe 通道。
  4. 将板装入仪器中。
  5. 按点绘图并创建一个新的点绘图 (p1)。设置正向散射区域 (fsc-a) 与侧散射区域 (ssc-a)。
  6. 选择"初始化"启动激光和流体。按"获取"开始获取。
  7. 调整比例以显示 p1 中间的人口。在 p1 中, 围绕整个人口 (不包括碎片) 绘制 "beads" 门 (图 2a)。按stop。
  8. 按点绘图并创建一个新的点绘图 (p2)。设置正向散射高度 (fsc-h) 与 fsc-a。在 "珠子" 上打开新的点图。在 p2 中, 在更多的人口周围绘制一个新的大门, 并将其命名为 "singlets" (图 2a)。
    请注意:这一战略的设计是为了尽可能避免在采集和分析步骤中纳入珠子集料。
  9. 按点绘图并创建两个不同的点绘图;一 fitc 对 ssc-a 和一个 pe 对 ssc-a。在 "单一" 上输入新的点图。
  10. 选择要记录的事件数 (例如, 20, 000个)。选择 "记录"并开始实验。

6. 数据分析

  1. 将采集文件加载到分析软件中。
    请注意:以下步骤必须应用于每个样品, 包括仅珠子和每个未知样本。
  2. 打开一个新的协议, 并按照步骤5中描述的相同策略创建点图。
  3. 将所有散点轴设置为线性刻度, 将所有荧光轴设置为日志刻度。
  4. 显示 fitc 和 pe 通道中的荧光几何平均值 (X-Gmean-MFI)。
  5. 计算样品的 x-g平均值与没有外显物的抗体染色的珠子的 x-g平均值。
  6. 比较不同电动汽车制剂的褶皱变化 mfi。

7. 细胞外囊数滴定

请注意:第7至第10节可以用来设置颗粒的数量、抗体浓度和特异性, 但如果细胞类型 (ev 是从其派生的, 抗体保持不变), 则可以跳过。

  1. 在 1x pbs 中稀释从2.3 步获得的颗粒, 以获得从 5 x 10 5 到 2.5 x10 8 粒子的一系列悬浮液 。
  2. 对于每个悬浮液, 在一个圆的底部管添加1μl 的捕获珠池。
  3. 按照步骤4.3 中的协议进行操作。

8. 抗体滴定

请注意:抗体滴定通常是通过为每个试管添加一个单一的抗体来完成的。

  1. 保持所有样品中 ev (总颗粒物或蛋白质含量) 的数量不变。
    请注意:按照上文第7节的规定, 根据经验确定了适当的数字。
  2. 按照步骤4.1 至4.5 的协议进行操作。
  3. 测试高于和低于供应商推荐量的抗体浓度范围。例如, 对于建议每次检测浓度为10μgml 的抗体, 则测试1、2、5、10、20和50μgml。包括一个样本与 "只有珠子", 添加抗体的最高浓度。
  4. 在4–10°c 下孵化1小时。
  5. 为每个样品添加100μl 的 1x pbs。
  6. 获取样本。

9. 孵化时间

  1. 验证在不同时间点 (例如, 1小时、2小时和 5小时) 执行采集的孵化时间。
  2. 按照第4节开始的协议进行操作。
  3. 在4–10°c 下将样品孵化1小时。
  4. 获取样本。
  5. 在4–10°c 下将样品培养3小时。
  6. 获取样本。

10. 协议验证

  1. 电动汽车绑定
    1. 在圆底管中, 添加相当于 1 x 108个颗粒的体积量或相应的总蛋白质量。
    2. 使用 1x pbs 将体积调整为100μl。
    3. 根据制造商的说明, 通过超声破坏 ev 膜 (或者可以应用热冲击步骤)。设置频率和强度。可以根据经验建立设置时间过程实验 (即, 0秒、30秒、1分钟、5分钟等)。
    4. 加入1μl 的珠子池。
    5. 按照步骤4.4 开始的协议进行操作。
  2. 抗体特异性
    1. 为每个荧光铬共轭 igg 准备一个管, 并添加珠子-ev 的复合物, 如步骤4.6 中所述。
      请注意:氟铬共轭异型必须与所使用抗体的 igg 相匹配。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

单次染色的颗粒总数

由于单个珠子可以结合多个粒子, 我们测试了不同的条件, 以设置最小的总 ev (每个管的单抗体), 以达到 mfi 曲线的早期指数相。使用了固定浓度的抗体, 而粒子总数从 5 x 10 5 到 2.5 x10 8不等.如图 3a所示, 允许我们确保抗体在可接受的 mfi 中运行, 避免使用过量 ev 的粒子数量为 1 x 10 8/染色.

抗体滴定法

我们选择了适当的抗体浓度, 从而产生了防止非特异性...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

传统的 fc 技术仍然是表征 ev 表面标记的最直接的分析方法。在这方面, 选择最适当的协议对于通过避免因仪器灵敏度而造成的限制, 获取有关感兴趣的单个粒子分数的有用信息至关重要。我们描述了一种方法, 使用磁性颗粒结合抗体, 识别 exo 和小 ev 表面抗原, 适合下游 fc 应用。我们使用两种不同的细胞类型验证了这种方法: 初级人类 cpc 正在成为基于 exo 的心脏病治疗方法的主要细胞来源;hek293 细胞是一种由于细胞生长和可塑性可靠而在细胞生物学研究中广泛使用的永生细胞系。

该方法可应用于超离心富集电动汽车, 并可直接应用于超离心预浓缩的体外细胞衍生 cm 上, 以获得较快的分析速度。在比较样品时, 起始材料是至关重要的。将捕获的珠子直接添加到 cm 将加快手术速度, 但同时降低荧光强度, 如图 4 a所示。在 "捕获" 步骤4.4 期间, 使用适当数量的 pbs 混合珠子和 ev 也是至关重要的。当使用恒定的孵育时间时, 由于 ev 耦合效率低下, 体积的增加会降低荧光强度。

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致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

l. b. 得到了苏黎世 (瑞士) helmut horten stiftung 和 velux stiftung 的研究赠款的支持。g. v. 得到瑞士国家科学基金会、cecilia-奥古斯塔基金会、lugano 和 shk stiftung für herz-und kreislaufkrankheiten (瑞士) 的研究赠款的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
IMDMGibco12440061
Amicon Ultra-15、PLHK Ultracel-PL 膜、100 千达 MilliporeUFC910024
CytoFlex，流式细胞仪平台贝克曼库尔特CytoFlex
DMEM，高葡萄糖，HEPES，无酚红Gibco21063045
Dulbecco 的 PBS （PBS） 不含钙和镁LonzaBE17-512F
ExoCap CD63 捕获试剂盒JSR Life SciencesEx-C63-SP
ExoCap CD81 捕获试剂盒JSR Life SciencesEx-C81-SP
ExoCap CD9 捕获试剂盒JSR Life SciencesEx-C9-SP
去除外泌体的 FBSThermofisherA2720801
去除外泌体的 FBS 培养基补充剂SBIEXO-FBS-250A-1
FBS-胎牛血清Gibco10270106
FITC 抗人 CD9 抗体生物传奇312104          RRID： AB_2075894
流式细胞仪分析软件贝克曼库尔特Kaluza
NanoSight LM10马尔文纳米显微镜 LM10
NanoSight 软件马尔文NTA 2.3
Optima Max-XP贝克曼库尔特393315
PE 抗人 CD63 抗体生物传奇353004          RRID：AB_10897809
PE 抗人 CD81 （TAPA-1） 抗体Biolegend349505          RRID：AB_10642024
青霉素-链霉素Gibco15140122
Thermomixer CEppendorf5382 000 015
TLA-110贝克曼库尔特TLA-110 转头

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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标签

CD63 CD9 CD81

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