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方法文章

高通量环境样品铁载体筛选：植物组织、原位土壤和根际土壤

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DOI：

10.3791/59137

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2019年2月9日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Crop and Soil Sciences, Washington State University, 2Department of Plant Pathology, Washington State University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们提出了一种用于快速筛选环境样品中铁载体潜力的方案，以评估其在陆地系统中对微量营养素生物有效性和周转的贡献。

摘要

铁载体（低分子量金属螯合化合物）在多种生态现象中具有重要作用，从土壤中铁（Fe）的生物地球化学循环，到病原菌竞争、植物促生以及跨界信号传递。此外，铁载体在含金属矿物和矿石的生物浸出与生物风化方面也具有商业应用价值。快速、经济且可靠的定量评估复杂样品中铁载体产量的方法，对于揭示铁载体活性所引发的生态效应（包括发现新型产铁载体微生物）至关重要。本文所提出的方法旨在评估环境样品（如土壤或植物组织）中完整微生物组群落的铁载体活性。样品经均质化处理后，用改良M9培养基（不含铁）稀释，并进行为期3天的富集培养。采用一种新型的96孔微孔板CAS（铬天青磺酸盐-铁）琼脂测定法，在24、48和72小时（h）对样品中的铁载体产量进行评估。该方法是对传统比色法的改进，传统方法操作繁琐且耗时，仅适用于单个培养获得的微生物分离株。我们将该方法应用于四种不同基因型/品系的小麦（Triticum aestivum L.），包括Lewjain、Madsen、PI561725和PI561727，这些品系在中国台湾太平洋西北内陆地区广泛种植。铁载体的产量明显受到小麦基因型以及所观察植物组织类型的影响。我们成功利用该方法快速筛选了植物基因型对铁载体产量的影响——这是陆地和水生生态系统中的一项关键功能。实验中产生了大量技术重复，从而在土壤及植物组织内部获得了高度可靠的统计学差异。重要的是，结果表明，所提出的方法能够以高度可靠的效率快速检测复杂样品中的铁载体产量，同时可保持微生物群落完整性，以便后续开展分类群和功能基因的鉴定工作。

引言

铁载体是重要的生物分子，主要参与铁的螯合以提高其生物可利用性，同时在陆地和水生生态系统中具有多种其他功能，包括微生物群体感应、微生物与植物宿主之间的信号传递、促进植物生长，以及在复杂微生物群落中的协作与竞争1,2。根据其活性位点和结构特征，铁载体可 broadly 分为四类：羧酸盐型、羟基酸盐型、儿茶酚盐型以及混合型3,4。许多微生物能够分泌不止一种类型的铁载体5，而在复杂的群落中，绝大多数生物会合成膜受体，以吸收种类更为广泛的铁载体1,6。近期研究表明，铁载体在群落层面尤为重要，甚至在跨界的相互作用及生物地球化学转移过程中也发挥着关键作用7,8,9,10,11。

铬天青S（Chrome azurol sulphonate, CAS）作为螯合剂用于结合铁（Fe）已有30多年的历史，其原理是当加入配体（如铁载体）时，可导致CAS-Fe复合物解离，从而在培养基中产生易于识别的颜色变化12。当CAS与Fe结合时，染料呈深蓝色；随着CAS-Fe复合物的解离，培养基的颜色会根据用于夺取Fe的配体类型而发生变化13。自1987年Schwyn和Neilands建立最初的液体培养基以来，该方法已被多次改良，以适应不同微生物的研究目标14、生长特性与限制条件15，以及除Fe之外的多种金属元素，包括铝、锰、钴、镉、镍、锂、锌16、铜17，甚至砷18。

许多人类病原体以及促进植物生长的微生物（PGPM）已被鉴定为产铁载体的生物体3,19,20，而重要的根际和内生PGPM通常在铁载体产生检测中呈阳性4。传统的基于铁的液体方法已被改进用于微孔板培养中对分离株进行铁载体产生的高通量检测21。然而，这些技术未能充分认识到整个微生物群落（即微生物组）在土壤和植物系统中铁载体产生方面的协同作用及潜在调控的重要性22。因此，我们开发了一种基于传统CAS测定法的高通量群落水平铁载体产生评估方法，该方法具有重复性好、测量简便、结果可靠且可在微孔板中重复操作的优点。

本研究介绍了一种经济高效、高通量的CAS-Fe检测法，用于检测铁载体的产生，以评估从复杂样品（如土壤和植物组织匀浆）中富集铁载体生成的能力。研究采集了四种不同小麦（Triticum aestivum L.）基因型——Lewjain、Madsen、PI561725和PI561727——的根际土壤（包括大量、松散结合和紧密结合的根际土壤，依据土壤与根系结合的紧密程度划分）以及籽粒、地上茎和根组织。我们假设，不同小麦基因型之间的基本差异可能导致其对产铁载体微生物群落的招募和选择存在差异。特别关注的是PI561725近等基因系相关的微生物群落，该品系因携带ALMT1（铝激活苹果酸转运蛋白1）而具有耐铝性，与之对比的是对铝敏感的PI561727近等基因系，其携带的是对该金属无响应的基因形式almt123,24,25,26。本研究的主要目标是建立一种简便、快速的方法，用于定量评估复杂样品类型中铁载体富集培养物中的铁载体产量，同时保留培养物以供后续研究使用。

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方案

注意：田间试验地点：华盛顿州立大学植物病理学农场（北纬46°46'38.0"，西经117°04'57.4"）。种子于2017年10月19日使用机械播种机播种。每种小麦基因型以单行种植，行距约1米，以避免根系重叠。植物和土壤样品于2018年8月9日采集，此时植株已达到收获期。样品来自四种小麦基因型的三个重复，分别为PI561727、PI561725、Madsen和Lewjain。

1. 改良M9培养基的制备

  1. 使用 Na2PO4∙7H2O（12.8 g/200 mL）、KH2PO4（0.3 g/200 mL）、NaCl（0.5 g/200 mL）和 NH4Cl（1 g/20 mL）试剂配制 M9 盐溶液。
  2. 将 18 g MgSO4∙7H2O 溶于 100 mL 双重去离子水（ddH2O）中，配制 0.75 M MgSO4∙7H2O 溶液。
  3. 将 14.7 g CaCl2∙2H2O 溶于 100 mL ddH2O 中，配制 1 M CaCl2∙2H2O 溶液。
  4. 在搅拌条件下，将 6.048 g PIPES 溶解于 156 mL ddH2O 中，配制缓冲液，并用 5 M NaOH 调节 pH 至 6.8。
  5. 将 20 g 葡萄糖（右旋糖一水合物）溶于 100 mL ddH2O 中，配制 20% 葡萄糖溶液。
  6. 分别配制各溶液，并对除葡萄糖外的所有溶液进行单独高压灭菌。葡萄糖溶液需经滤膜除菌（0.22 µm），待 M9 培养基高压灭菌后加入。
  7. 在生物安全柜中，采用无菌操作技术，将 156 mL PIPES 缓冲液、40 mL M9 盐溶液、20 μL CaCl2·2H2O 溶液、266 μL MgSO4·7H2O 溶液和 4 mL 20% 葡萄糖溶液混合，配制改良 M9 培养基。
  8. 为保存改良 M9 培养基，需密封容器，用铝箔包裹以避紫外线，并置于 4 °C 保存。

2. CAS-Fe-琼脂培养基的制备

  1. 在使用玻璃器皿进行CAS检测前，需用100 mM HCl/100 mM HNO3酸洗至少2小时。
  2. 准备一个装有实验级沙子的铝制烤盘，并用铝箔覆盖。在121 °C下高压灭菌30分钟，然后放置一旁备用。
  3. 通过将0.0365 g HDTMA（十六烷基三甲基溴化铵）加入20 mL ddH2O中配制HDTMA溶液，并将溶液置于37 °C以促进溶解。
  4. 配制10 mM HCl，并用该溶液溶解FeCl3·6H2O制成1 mM的溶液。在持续轻柔搅拌下，将0.0302 g CAS加入25 mL ddH2O中。随后，在继续轻柔搅拌的同时，向25 mL CAS溶液中加入5 mL用10 mM HCl配制的1 mM FeCl3·6H2O溶液（溶液变为深红黑色）。
  5. 在持续轻柔搅拌下，缓慢将20 mL HDTMA溶液加入Fe-CAS溶液中（得到深蓝色溶液）。
  6. 将15.12 g PIPES溶于375 mL ddH2O中，轻柔搅拌溶解，用5 M NaOH调节pH至6.8，再加水定容至450 mL。向溶液中加入5 g琼脂糖。将PIPES缓冲液和CAS-Fe溶液分别在121 °C下高压灭菌30分钟。
  7. 在生物安全柜中，待PIPES缓冲液和CAS-Fe溶液均完成高压灭菌后，小心地将全部CAS-Fe溶液加入全部PIPES缓冲液中。
  8. 将混合溶液置于50 °C水浴中。
    注意：每次检测前均需新鲜配制CAS-Fe-琼脂培养基中的所有试剂，因在50 °C长期储存会导致CAS-Fe复合物沉淀，而冷却则会使培养基凝固。
  9. 在生物安全柜中，将无菌试剂舟置于无菌沙中并加热至50 °C。将CAS-Fe-琼脂转移至试剂舟中，然后迅速向透明、平底、无菌的96孔微孔板的每孔中分装100 µL。

3. 吡咯喹啉醌/EDTA 标准品制备

  1. 绿脓菌素制备
    1. 在先前配制的改良M9培养基中，制备800 μM的绿脓菌素标准品（包含琥珀酸、2-羟基戊二酰胺和琥珀酰胺形式的绿脓菌素混合物——见材料表）。
    2. 将该溶液稀释为400、200、100、50、25、12.5和6.25 μM的系列溶液。
  2. EDTA标准品制备
    1. 将0.594 g乙二胺四乙酸二钠（EDTA：C10H14N2Na2O8·2H2O）加入500 mL先前配制的改良M9培养基中，配制3200 μM的EDTA标准溶液。
    2. 将该溶液稀释为1600、800、400、200、100、50、25、12.5和6.25 μM的系列溶液。
  3. 标准曲线生成
    1. 将每种浓度的绿脓菌素和EDTA各100 μL分别加入含有100 μL CAS-Fe琼脂培养基的96孔微孔板的不同孔中。每种浓度设两个技术重复。同时设置仅含M9培养基（不含EDTA或绿脓菌素）的空白孔。
    2. 使用微孔板读数仪，在22 °C孵育1、6和24小时后测定吸光度（420 nm和665 nm），并利用吸光度数据生成标准曲线。
      注：在420 nm处测定时，用含绿脓菌素或EDTA孔的吸光度减去空白孔的吸光度；在665 nm处测定时，用空白孔的吸光度减去含绿脓菌素或EDTA孔的吸光度。然后以log10(μM绿脓菌素或EDTA)对吸光度值进行回归分析。为便于解释样品结果，建议以吸光度为x轴，log10(μM绿脓菌素或EDTA)为y轴作图。

4. 环境样品的采集：土壤和植物组织

  1. 使用 0.22 µm 过滤的 ddH2O 清洗采样设备（铲子和剪刀），然后用 70% 乙醇冲洗，并在采样前及样品之间用纸巾擦拭，以维持无菌操作并减少交叉污染。
  2. 从田间植株上切取植物组织（籽粒和茎叶），放入已标记的塑料储存袋中，保留足够的茎秆残茬以便于挖取所需的土壤和根系样品。
  3. 挖掘一个约 15 cm 深、23 cm 宽的小型根团，将其放入另一个已标记的塑料袋中，用于后续在实验室环境中进行样品处理。此步骤与 McPherson 等人27 所述方法类似。
  4. 将所有样品（籽粒、茎叶、原位土壤和根团，分别装袋）立即置于冰上，并在 4 °C 下保存，直至进行铁载体产生测定实验。
  5. 将与根系相关的土壤样品分为原位土壤、松散结合的根际土壤和紧密结合的根际土壤。
    1. 从袋中取出根团，轻轻摇晃以使土壤脱落。脱落的土壤以及袋中残留的土壤共同构成“原位”土壤。
    2. 使用橡胶锤进一步敲打根团以去除土壤，这部分为松散结合的根际土壤。
    3. 取带有紧密结合土壤的根系放入离心管中，加入 30 mL ddH2O，涡旋振荡 2–3 分钟，然后移除根系，获得紧密结合的根际土壤悬液稀释液。

5. 铁载体富集培养物的制备及CAS-Fe铁载体产生测定实验

注意：所有玻璃器皿在开始检测前均应进行酸洗。

  1. 土壤样品制备（针对三种土壤样品类型中的每一种）
    1. 在样品袋内充分混合并翻动土壤，尽可能在不打开袋子的情况下使每份土壤样品均质化。
      注意：此步骤有助于减少土壤天然的空间变异性，并符合常规的土壤采样程序。可根据实验设计选择其他适当的方法对环境样品进行均质化处理。
    2. 每份样品充分混匀后，取2.0 g土壤加入20 mL改良M9培养基中悬浮，然后在无菌的50 mL离心管中用无菌泡沫塞封口，用改良M9培养基稀释至10-3，最终体积为20 mL，以允许通气。
    3. 对于紧密结合的根际样品，将2 mL根际土壤悬液加入20 mL改良M9培养基中，然后在无菌的50 mL离心管中用无菌泡沫塞封口，用改良M9培养基稀释至10-3，最终体积为20 mL，以允许通气。
  2. 组织样品（根、茎和籽粒）制备
    1. 用70%乙醇对样品进行表面灭菌。取2.0 g新鲜组织，在20 mL改良M9培养基中使用搅拌机高速匀浆30秒。将样品转移至无菌50 mL离心管中，然后在无菌50 mL离心管中用无菌泡沫塞封口，用改良M9培养基稀释至10-3，最终体积为20 mL，以允许通气。
  3. 通过铁限制富集嗜铁素的产生
    1. 将50 mL离心管置于室温下，在160 rpm条件下振荡培养。

6. 用于检测环境样品中铁载体产生的CAS-Fe琼脂检测法

  1. 在富集培养开始后的 24、48 和 72 小时，采用无菌操作技术从富集管中取出 1 mL 子样品，于 2 mL 离心管中以 10,000 × g 离心 1 分钟，使细胞沉淀。
  2. 收集分离后的上清液。采用无菌操作技术，将 100 μL 上清液加入 96 孔微孔板中，与 100 μL CAS-Fe-琼脂溶液平行或三重复混合。同时加入 100 μL 无菌 M9 培养基作为空白对照。随后将微孔板置于 28 °C 培养。
  3. 将每份样品（未加入微孔板的）剩余的上清液和沉淀分别重悬于各自独立的无菌 2 mL 离心管中。向每个含样品上清液的离心管中加入 400 μL 无菌甘油，并重悬沉淀以制备甘油保存菌种。将菌种保存于 -80 °C 冷冻，用于后续分析。
    注意：此步骤可根据实验室内部偏好的任意方案进行调整以制备甘油保存菌种。
  4. 在 6、24、48 和 72 小时，于 420 nm 波长下测定吸光度。
  5. 利用由绿脓菌素（pyoverdine）或 EDTA 绘制的标准曲线，将样品的吸光度测定值换算为绿脓菌素当量。
    注意：与 EDTA 相比，绿脓菌素被确定为更优的标准品（见下文），因此本研究未使用 EDTA 对结果进行解释。

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结果

以荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）生物合成的绿脓菌素混合物作为标准品，用于解释和量化样品在420 nm处的吸光度，结果以µM为单位的绿脓菌素当量表示。图1展示了吸光度（420 nm）与绿脓菌素起始浓度（Log10 摩尔浓度，单位为µM）之间的关系。EDTA不适合作为标准品，因为样品的吸光度测量值高于绿脓菌素所能达到的范围，且R2值较低（图2）。尽管早期使用CAS-Fe法作为铁载体检测方法时在630 nm处测定吸光度，但在一项采用非常相似方法的相关研究中（将CAS-Fe-琼脂与改良M9培养基按1:1混合，制成微孔板中200 µL的柱体），观察到最大吸光度出现在665 nm，而420 nm在反映样品引起的吸光度变化方面具有更高的可重复性（图3）。

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讨论

本研究的主要成果是开发出一种新方法，可用于快速富集产铁载体微生物，同时对环境样品中的铁载体产生量/活性进行定量测定。该方法快速、简便且成本低廉，结果表明其可有效检测来自复杂及新型样品类型（如., 土壤和植物组织）。该方案还可制备富集培养物的甘油菌种，便于长期保存，可用于通过基于DNA或RNA的技术研究铁缺乏期间微生物群落结构和功能的变化。对生态学研究中嗜铁素活性动力学感兴趣的人员也可能从该方法中获益。结果还表明，绿脓菌素类似物（绿脓菌素在环境中是重要的嗜铁素）28 和医学29）提供了一种定量评估铁载体产生的良好方法。一个重要发现是，与在420 nm处测得的结果相比，在665 nm处的吸光度测量不足以准确反映铁载体活性。图1）。尤为重要的是，发现在665 nm处的吸光度在较宽范围的绿脓菌素浓度（Pyoverdine µM = 50–800 µM，log）内呈聚集分布10（µM 吡咯喹啉醌）= 0.18–0.76），表明在此波长下存在检测上限

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢 Kalyani Muhunthan 在实验操作方面的协助，感谢 Lee Opdahl 进行小麦基因型收获，感谢华盛顿州康科德葡萄研究委员会以及华盛顿州立大学可持续农业与自然资源中心提供 BIOAg 项目资助以支持本研究工作。额外资金由美国农业部/国家食品与农业研究所通过 Hatch 项目 1014527 提供。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂糖ApexLF451320014
铝制烤盘
铝箔
氯化铵，颗粒状Fiesher Scientific152315A
高压灭菌器和灭菌锅Thermo Scientific
二水合氯化钙Fiesher Scientific171428
CAS（铬天青S）Chem-Impex Int'l Inc000331-27168
一水葡萄糖，结晶粉末Fiesher Scientific1521754
EDTA 二钠盐，二水合物，晶体J.T.BakerJI2476
甘油，无水Baker AnalyzedC22634
HDTMA（十六烷基三甲基溴化铵）Reagent WorldFZ0941
盐酸ACROS OrganicB0756767
Infinite M200 PRO 酶标仪TECAN
六水合三氯化铁，99%ACROS OrganicA0342179
实验室通风橱Thermo Scientific
实验室培养箱VWR Scientific
硫酸镁Fiesher Scientific27855
硝酸，(69-70)%J.T.Baker72287
PIPES 缓冲液，98.5%ACROS OrganicA0338723
磷酸氢二钾，粉末J.T.BakerJ48594
绿脓菌素SIGMA-ALDRICH078M4094V
沙子
SI-600R 摇床Lab Companion
氯化钠，颗粒状Fiesher Scientific136539
氢氧化钠，片状J.T.BakerG48K53
磷酸氢二钠七水合物，99%ACROS OrganicA0371705

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