高通量环境样品铁载体筛选：植物组织、原位土壤和根际土壤

摘要

我们提出了一种用于快速筛选环境样品中铁载体潜力的方案，以评估其在陆地系统中对微量营养素生物有效性和周转的贡献。

摘要

铁载体（低分子量金属螯合化合物）在多种生态现象中具有重要作用，从土壤中铁（Fe）的生物地球化学循环，到病原菌竞争、植物促生以及跨界信号传递。此外，铁载体在含金属矿物和矿石的生物浸出与生物风化方面也具有商业应用价值。快速、经济且可靠的定量评估复杂样品中铁载体产量的方法，对于揭示铁载体活性所引发的生态效应（包括发现新型产铁载体微生物）至关重要。本文所提出的方法旨在评估环境样品（如土壤或植物组织）中完整微生物组群落的铁载体活性。样品经均质化处理后，用改良M9培养基（不含铁）稀释，并进行为期3天的富集培养。采用一种新型的96孔微孔板CAS（铬天青磺酸盐-铁）琼脂测定法，在24、48和72小时（h）对样品中的铁载体产量进行评估。该方法是对传统比色法的改进，传统方法操作繁琐且耗时，仅适用于单个培养获得的微生物分离株。我们将该方法应用于四种不同基因型/品系的小麦（Triticum aestivum L.），包括Lewjain、Madsen、PI561725和PI561727，这些品系在中国台湾太平洋西北内陆地区广泛种植。铁载体的产量明显受到小麦基因型以及所观察植物组织类型的影响。我们成功利用该方法快速筛选了植物基因型对铁载体产量的影响——这是陆地和水生生态系统中的一项关键功能。实验中产生了大量技术重复，从而在土壤及植物组织内部获得了高度可靠的统计学差异。重要的是，结果表明，所提出的方法能够以高度可靠的效率快速检测复杂样品中的铁载体产量，同时可保持微生物群落完整性，以便后续开展分类群和功能基因的鉴定工作。

引言

铁载体是重要的生物分子，主要参与铁的螯合以提高其生物可利用性，同时在陆地和水生生态系统中具有多种其他功能，包括微生物群体感应、微生物与植物宿主之间的信号传递、促进植物生长，以及在复杂微生物群落中的协作与竞争^1,2。根据其活性位点和结构特征，铁载体可 broadly 分为四类：羧酸盐型、羟基酸盐型、儿茶酚盐型以及混合型^3,4。许多微生物能够分泌不止一种类型的铁载体⁵，而在复杂的群落中，绝大多数生物会合成膜受体，以吸收种类更为广泛的铁载体^1,6。近期研究表明，铁载体在群落层面尤为重要，甚至在跨界的相互作用及生物地球化学转移过程中也发挥着关键作用^7,8,9,10,11。

方案

注意：田间试验地点：华盛顿州立大学植物病理学农场（北纬46°46'38.0"，西经117°04'57.4"）。种子于2017年10月19日使用机械播种机播种。每种小麦基因型以单行种植，行距约1米，以避免根系重叠。植物和土壤样品于2018年8月9日采集，此时植株已达到收获期。样品来自四种小麦基因型的三个重复，分别为PI561727、PI561725、Madsen和Lewjain。

1. 改良M9培养基的制备

1. 使用 Na₂PO₄∙7H₂O（12.8 g/200 mL）、KH₂PO₄（0.3 g/200 mL）、NaCl（0.5 g/200 mL）和 NH₄Cl（1 g/20 mL）试剂配制 M9 盐溶液。
2. 将 18 g MgSO₄∙7H₂O 溶于 100 mL 双重去离子水（ddH₂O）中，配制 0.75 M MgSO₄∙7H₂O 溶液。
3. 将 14.7 g CaCl₂∙2H₂O 溶于 100 mL ddH₂O 中，配制 1 M CaCl₂∙2H₂O 溶液。
<....

结果

以荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）生物合成的绿脓菌素混合物作为标准品，用于解释和量化样品在420 nm处的吸光度，结果以µM为单位的绿脓菌素当量表示。图1展示了吸光度（420 nm）与绿脓菌素起始浓度（Log₁₀ 摩尔浓度，单位为µM）之间的关系。EDTA不适合作为标准品，因为样品的吸光度测量值高于绿脓菌素所能达到的范围，且R²值较低（图2）。尽管早期使用CAS-Fe法作为铁载体检测方法时在630 nm处测定吸光度，但在一项采用非常相似方法的相关研究中（将CAS-Fe-琼脂与改良M9培养基按1:1混合，制成微孔板中200 µL的柱体），观察到最大吸光度出现在665 nm，而420 nm在反映样品引起的吸光度变化方面具有更高的可重复性（图3）。

讨论

本研究的主要成果是开发出一种新方法，可用于快速富集产铁载体微生物，同时对环境样品中的铁载体产生量/活性进行定量测定。该方法快速、简便且成本低廉，结果表明其可有效检测来自复杂及新型样品类型（如., 土壤和植物组织）。该方案还可制备富集培养物的甘油菌种，便于长期保存，可用于通过基于DNA或RNA的技术研究铁缺乏期间微生物群落结构和功能的变化。对生态学研究中嗜铁素活性动力学感兴趣的人员也可能从该方法中获益。结果还表明，绿脓菌素类似物（绿脓菌素在环境中是重要的嗜铁素）²⁸ 和医学²⁹）提供了一种定量评估铁载体产生的良好方法。一个重要发现是，与在420 nm处测得的结果相比，在665 nm处的吸光度测量不足以准确反映铁载体活性。图1）。尤为重要的是，发现在665 nm处的吸光度在较宽范围的绿脓菌素浓度（Pyoverdine µM = 50–800 µM，log）内呈聚集分布₁₀（µM 吡咯喹啉醌）= 0.18–0.76），表明在此波长下存在检测上限

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖	Apex	LF451320014
铝制烤盘
铝箔
氯化铵，颗粒状	Fiesher Scientific	152315A
高压灭菌器和灭菌锅	Thermo Scientific
二水合氯化钙	Fiesher Scientific	171428
CAS（铬天青S）	Chem-Impex Int'l Inc	000331-27168
一水葡萄糖，结晶粉末	Fiesher Scientific	1521754
EDTA 二钠盐，二水合物，晶体	J.T.Baker	JI2476
甘油，无水	Baker Analyzed	C22634
HDTMA（十六烷基三甲基溴化铵）	Reagent World	FZ0941
盐酸	ACROS Organic	B0756767
Infinite M200 PRO 酶标仪	TECAN
六水合三氯化铁，99%	ACROS Organic	A0342179
实验室通风橱	Thermo Scientific
实验室培养箱	VWR Scientific
硫酸镁	Fiesher Scientific	27855
硝酸，(69-70)%	J.T.Baker	72287
PIPES 缓冲液，98.5%	ACROS Organic	A0338723
磷酸氢二钾，粉末	J.T.Baker	J48594
绿脓菌素	SIGMA-ALDRICH	078M4094V
沙子
SI-600R 摇床	Lab Companion
氯化钠，颗粒状	Fiesher Scientific	136539
氢氧化钠，片状	J.T.Baker	G48K53
磷酸氢二钠七水合物，99%	ACROS Organic	A0371705