本方案描述了一种高灵敏度、高通量的中性粒细胞胞外诱捕网（NET）检测方法，可通过免疫荧光三维共聚焦显微镜对离体NET的形成进行半自动定量分析。该方案可用于评估不同刺激条件下NET的形成与降解过程，并可用于研究潜在的靶向NET治疗策略。
方法文章
一种用于评估和定量中性粒细胞胞外诱捕网形成的高通量检测方法
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）是一类具有免疫原性的细胞外DNA结构，可在多种刺激条件下由中性粒细胞释放。研究表明，NETs是一种重要的宿主防御机制，能够捕获并杀灭微生物。另一方面，NETs也与多种系统性自身免疫性疾病相关。NETs是具有免疫原性和毒性的结构，含有多种重要自身抗原，包括抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）相关性血管炎（AAV）和系统性红斑狼疮（SLE）。不同刺激可诱导形成不同形式的NETs。NETs的数量可通过多种技术进行定量，包括测定上清液中的DNA释放量、检测与NET相关分子（如髓过氧化物酶（MPO）或中性粒细胞弹性蛋白酶（NE））结合的DNA、通过荧光显微镜检测瓜氨酸化组蛋白的存在，或通过流式细胞术检测NET组分；这些方法在特异性、敏感性、客观性和定量能力方面各有特点。本文提供一种利用三维免疫荧光共聚焦显微镜高灵敏度、高通量地定量体外NET形成的实验方案。该方案可用于研究健康与疾病状态下NET形成与降解的多种科学问题。
引言
中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的形成是指中性粒细胞释放其DNA，形成一种细胞外三维（3D）网状结构，该结构与多种抗菌性和有害分子、颗粒及胞质酶、肽和蛋白质复合在一起。这些具有免疫原性和毒性的结构在健康个体的先天免疫防御中具有重要的生理作用，可通过捕获和杀灭病原微生物来发挥功能1。然而，研究也证实它们参与了血栓形成2以及多种系统性自身免疫性疾病，包括抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）相关性血管炎（AAV）3、系统性红斑狼疮（SLE）4,5、抗磷脂综合征（APS）2,6、类风湿关节炎（RA）、银屑病和痛风7,8,9。
体外中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的形成已被广泛研究，其中常用佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯（PMA）这一化学化合物诱导大量NET形成。然而，大多数生理刺激所诱导的NET形成水平要低得多10。为了研究在自身免疫性疾病等情境下的NET诱导因素，需要一种标准化、灵敏且高通量的定量检测方法来检测并量化NET的形成。NET的定量已被证明具有挑战性，目前采用多种不同的方法进行，每种方法都有其自身的优点和局限性11。一种常用的方法是检测上清液中的DNA12，该方法具有客观性，但无法区分DNA的来源（凋亡、坏死或NETs），因此对NETs特异性较低。第二种方法是酶联免疫吸附测定（ELISA），用于检测与NET特异性蛋白（如髓过氧化物酶（MPO）或中性粒细胞弹性蛋白酶（NE））结合的DNA复合物，这种方法检测NETs更具特异性，并已被证明与瓜氨酸化组蛋白-3（CitH3）阳性的NETs具有良好相关性13。然而，尚不清楚该方法是否足够灵敏，能够检测到所有类型的NETs（例如， MPO、NE和CitH3阴性的NETs）。第三种方法是免疫荧光显微镜技术，通过检测NET相关分子（NE、MPO、CitH3）与胞外DNA的共定位来定量NETs。该方法通常对NETs具有较高特异性，但难以实现高通量应用，且由于观察者偏倚而缺乏客观性。此外，该方法未考虑那些根据所使用的NET诱导剂不同而频繁出现的MPO、NE、CitH3阴性NETs14,15。流式细胞术方法通过检测前向/侧向散射光（FSC/SSC）的变化来识别NET化中性粒细胞核的肿胀16。该方法未考虑已发现的不同形式的NET形成过程，例如不涉及细胞核肿胀的“活性NET形成”（vital NET formation）17。最后，免疫荧光共聚焦显微镜已被用于通过使用细胞不可渗透染料直接标记胞外DNA来可视化和量化NET的形成12,18。通常手动选取并分析5至10个高倍视野，仅覆盖96孔板每个孔面积的1%-5%11,17。图像的手动选择并不总是客观的，容易产生偏倚，也不适用于高通量分析。最近开发了一种自动化、高通量的NET定量检测方法，该方法通过Z轴堆叠的免疫荧光共聚焦显微镜以三维方式成像每个孔11%的区域，覆盖27 µm的Z轴范围，从而相比传统方法显著提高了NET检测的灵敏度10。本报告描述了最新的NET定量实验方案，采用自动化、高灵敏度的三维共聚焦显微镜检测技术，可实现每个孔45%总面积的成像，并覆盖27 µm的Z轴范围。该方案适用于以高灵敏度、客观且无偏倚的方式定量低水平的NET形成。
方案
所有患者和健康对照者均同意参与莱顿大学医学中心（LUMC）生物样本库项目。两项生物样本库研究均获得莱顿大学医学中心伦理委员会的批准。
1. 健康中性粒细胞的分离
- 从健康供体采集20 mL外周血，分装于两支10 mL EDTA抗凝管中。
- 将10 mL血液放入无菌50 mL离心管中，加入磷酸盐缓冲液（PBS）至终体积32.5 mL。
- 加入密度梯度液（例如.，Ficoll-泛影葡胺）置于细胞下方。
- 用10 mL移液管和移液控制器吸取14 mL密度梯度液。
- 将移液管置于50 mL离心管底部。
- 将移液控制器从移液管上取下，让密度梯度液在重力作用下自然流出，直至毛细作用达到最大（剩余1-2 mL），此过程不使用电机。
- 用拇指按住移液管顶部，防止密度梯度液在取出移液管时泄漏。
- 将管子以912 x g离心20分钟 g 室温（RT）下，无加速或制动。
注意： 红细胞（RBC）和中性粒细胞密度较高，位于50 mL离心管底部。外周血单个核细胞（PBMCs）在密度梯度液上方形成白色环状层。经PBS稀释的血浆位于PBMCs上方。如有需要，可通过将白色环状层转移至新的50 mL离心管，并用PBS进行额外洗涤步骤，以分离PBMCs。 - 首先小心移除含有外周血单个核细胞（PBMCs）的白色环状层，接着移除PBS稀释的血浆，最后尽可能去除密度梯度层。
- 通过冷的无菌蒸馏水裂解红细胞，以从中性粒细胞/红细胞混合物中分离中性粒细胞。
- 从冰箱中取出冷的无菌蒸馏水瓶和一瓶10倍浓缩的PBS溶液。
- 此步骤需迅速操作。在沉淀物上方直接加入36 mL冷的无菌蒸馏水，轻轻混匀一次。20秒后加入4 mL 10×PBS，以制成等渗溶液，再次轻轻混匀一次。
- 739 × g 离心 5 分钟 g 以及 4 °C（用于去除红细胞）。中性粒细胞将位于白色沉淀中。
- 小心弃去上清液。重复步骤1.6.2，并确保沉淀充分悬浮。
- 离心 5 分钟，328 x g g 和 4 °C。
- 小心吸除上清液，将沉淀重悬于5 mL PBS中。计数中性粒细胞并置于冰上保存。
注意： 1管血液（10 mL）的预期产量约为1500万至7500万个中性粒细胞。
2. 中性粒细胞的红色荧光细胞标记
- 在15 mL离心管中，用2 mL PBS制备含有1000万至2000万中性粒细胞的中性粒细胞悬液。
- 配制2 mL PBS溶液，加入4 µL的2 µM红色荧光细胞连接剂（参见 材料表) 加入另一个15 mL离心管中，轻轻加入中性粒细胞悬液并小心混匀。
- 在37 °C避光孵育恰好25分钟，以用红色荧光细胞连接剂标记中性粒细胞。
- 通过加入含10%热灭活胎牛血清（FCS）的RPMI 1640培养基终止标记反应 室温下定容至15 mL，轻轻混匀一次。若已形成沉淀，请确保将其充分重悬。
- 离心 5 分钟，328 × g g 以及室温（RT）。
- 移除上清液，将沉淀物在室温下重悬于5 mL不含酚红的RPMI 1640培养基中，培养基中含2% FCS和10% P/S。计数中性粒细胞。
注意： 红色荧光标记细胞后可能出现50%的细胞丢失。
3. 中性粒细胞胞外诱捕网形成的诱导
- 在不含酚红的 RPMI 1640 培养基（含 2% FCS 和 10% P/S）中制备浓度为 0.42 × 106 个细胞/mL 的细胞悬液。
- 将 37,500 个中性粒细胞溶于 90 µL 中，每孔加入至黑色 96 孔平底板中。
- 每孔加入 10 µL 目标刺激物（例如患者血清），每个样本设三个复孔，使孔中终浓度为 10%。同时始终设置阴性对照（培养基），也设三个复孔。
- 在 37 °C 避光条件下孵育所需时间，可选择 30 分钟至 2、4 或 6 小时。建议孵育 4 小时。
- 计算需加入 25 µL 浓度为 5 µM 的不可渗透 DNA 染料（见材料表）以使孔中终浓度达到 1 µM 所需的体积。如有必要，使用含 2% FCS 和 10% P/S 的 RPMI 1640 培养基对染料进行预稀释，获得 5 µM 的工作液。
- 在孵育结束前 15 分钟加入 25 µL 浓度为 5 µM 的不可渗透 DNA 染料。继续在 37 °C 避光孵育 15 分钟。
- 小心移除上清液（约 125 µL），如需保存可暂存。每孔加入 100 µL 4% 多聚甲醛（PFA）。避光保存，并立即进入步骤 4。
4. 采用三维高通量、高分辨率免疫荧光共聚焦显微镜技术对中性粒细胞胞外诱捕网（NET）进行可视化观察
- 通过点击“采集设置”来配置免疫荧光共聚焦显微镜的参数。
- 点击配置选项卡。
- 选择物镜和相机。选择10X Apo Lambda物镜，并设置采集模式为60 µm针孔的共聚焦模式。
- 点击板，并选择96孔塑料板。选择要成像的位点，并设定固定的位点数量。填写3列和3行，无重叠（0 µm），总共覆盖孔面积的45%。
- 点击采集。选中启用基于激光的聚焦。如有需要，选择采集Z序列/时间序列。
- 点击位点自动聚焦。
- 点击聚焦于板底 | 按底部厚度偏移。为初始孔定位样本时，选择首个采集的孔。对于位点自动聚焦，选择所有位点。
- 点击波长。
- 对于波长数量，选择2。对于透射光（TL）明场校正精细级别，选择2。
- 对于波长1，选择Texas Red。
- 在自动聚焦选项中，选择带Z偏移的激光，后激光偏移为1.1 µm。使用Z栈，自定义范围为200-10。
- 对于波长2，选择FITC。
- 在自动聚焦选项中，选择相对于波长1（w1）Z偏移为0 µm的激光。使用Z栈，自定义范围为200-10。
- 在采集选项中，选择Z序列和2D投影图像最大值。在采集选项中，选择明场校正 | 关闭。
- 选择Z序列。设置步数：10。设置步长：3 μm（总范围为27 µm）。
- 将板放入免疫荧光共聚焦显微镜中。
- 点击运行选项卡。
- 填写板名称和描述，并选择存储位置。
- 选择需要采集的孔。
- 点击运行选项卡。
- 设置Texas Red和FITC的曝光时间。
- 点击采集板以开始采集，每块板大约需要1小时。
5. NET 形成的分析
- 使用专为分析科学多维图像而设计的图像处理程序（参见材料表）来分析中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的形成。
- 将获取的图像数据转移至独立的硬盘驱动器。
- 选择颜色叠加工具。
- 选择 w1，并选择硬盘驱动器中存储数据的文件夹。
- 选择 w2，并选择硬盘驱动器中存储数据的文件夹。
注意：使用标准宏，该宏在文件名中使用 w1 为 Texas Red 图像添加红色，使用 w2 为 FITC 图像添加绿色。
- 选择分析宏。
- 选择 w1，设定阈值（强度阈值），通常为 10；选择所需的像素值（大小阈值，例如 100）。
- 选择 w2，设定阈值（强度阈值），通常为 10；选择所需的像素值（大小阈值，例如 500）。
- 选择电子表格文件的保存路径，运行分析，随后保存日志文件。
- 在电子表格中分析数据。
结果
通过在每个孔中从焦平面开始、以3 µm间距采集10层Z轴图像，对染色的细胞外DNA进行三维定量，从而量化中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的形成。通过测量累积面积，该检测方法的灵敏度得以提高（图1A）。分离得到的中性粒细胞平均纯度为98.7%，标准差（SD）为1.10%，数据来自14次不同分离实验的样本。红细胞的平均百分比为1.04% ± 1.1% SD，单核细胞的平均百分比为0.085% ± 0.17% SD（数据未显示）。仅在每个孔的焦平面上对染色中性粒细胞的成像总面积进行定量，其与各孔中性粒细胞总数呈显著相关，皮尔逊相关系数为0.99（95%置信区间[CI] 0.985–0.997，p < 0.0001）（图1B）。图中展示了使用AAV患者10%血清或培养基（MED）作为阴性对照刺激中性粒细胞后，NET形成的代表性定量结果，以每成像中性粒细胞在10层Z轴图像中累积的染色细胞外DNA面积表示（图1C）。同时展示了未刺激中性粒细胞（图2A）和AAV刺激后形成NET的中性粒细胞（图2B）的代表性图像截图。
图1：通过测量细胞外DNA和中性粒细胞数量定量中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的形成。（A）使用图像处理程序对未刺激的中性粒细胞（MED）以及用抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎（AAV）患者10%血清刺激的中性粒细胞（n = 4）在每孔10个Z轴堆栈中累积定量面积。每种刺激条件均设三个重复，每个数据点代表中位数值。（B）通过图像处理程序在每孔的焦平面内定量红色荧光标记的细胞面积和细胞计数（R2 = 0.99，p < 0.0001）。（C）NET形成以每成像中性粒细胞（细胞面积）的累积面积表示。每个三重复组的均值±均值标准误（SEM）按刺激条件绘制。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：NET定量测定的快照。 荧光标记的中性粒细胞显示为红色，染色的细胞外DNA显示为绿色。10x Plan Apo Lambda物镜。（A）未刺激的中性粒细胞。（B）用AAV血清刺激的中性粒细胞。请点击此处查看此图的放大版本。
讨论
该实验最关键的步骤是每次实验都必须使用新鲜分离的中性粒细胞，因为中性粒细胞寿命较短，且在冻存后会死亡。这要求每次实验均需健康供体，而供体间的个体差异可能导致实验结果出现一定变异。其中一种变异因素是中性粒细胞的活化状态。中性粒细胞在分离前可能已在体内处于活化状态。此外，在分离过程中，尤其是在红细胞裂解阶段，中性粒细胞也可能被激活，因此需要由具备丰富经验的操作人员进行处理，以最大限度地减少中性粒细胞的非特异性活化。通常情况下，应在采血后尽快进行中性粒细胞的分离，并且实验过程中不应中断，以避免发生过度的自发性活化。其次，应避免对中性粒细胞进行剧烈操作。本方案的一个显著优势在于，当中性粒细胞接种至96孔板后，几乎无需再进行移液操作。重要的是，中性粒细胞的活化状态应在未刺激条件下进行评估，而本实验方法能够灵敏地检测到低水平的中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成。另一个可能影响实验结果的因素是培养基中胎牛血清（FCS）的使用。已将FCS的浓度从10%降低至2%，以避免其抗氧化活性可能对NET形成产生的抑制作用。19,20 或尽管经过热灭活后中性粒细胞仍可能存在被激活的可能性。尚未尝试无FCS培养或使用不同类型的培养基。每次进行检测时，均需设置未刺激组或培养基对照组，以评估背景信号水平（例如, 中性粒细胞的活化状态）。与未刺激样本相比，每种刺激物的倍数增加显示出来，以确保使用相同刺激物的不同实验之间结果的一致性。
可能导致背景信号较高的一个重要因素是与NET形成过程无关的胞外DNA染色。本实验通过在15分钟的短时间孵育后立即去除胞外DNA染色，并在固定后直接分析培养板，以尽量减少这一问题。因此，必须使用具有足够速度和分析能力的高级共聚焦显微镜，以便在1至2小时内完成对96孔板的成像。建议采用自动设置曝光时间和焦距的模式。由于不同样本和实验之间在颜色强度阈值方面可能存在差异，为获得整体最佳图像质量，显微镜的设置可相应调整。该设置会直接影响后续对中性粒细胞和NETs进行准确量化的能力，因此应通过多个对照样本（例如， 健康对照者的血清）来确认最佳参数。在分析所获取图像时，分析程序中使用像素阈值和尺寸阈值可更有效地识别和筛选NET的形成情况。
来源于中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成的细胞外DNA可能由多种不同的死亡通路导致，包括NETosis、坏死性凋亡（necroptosis）、焦亡（pyroptosis）、铁死亡（ferroptosis），甚至非裂解性的活性NET形成过程1。因此，本检测方法的一个局限性在于，仅通过染色细胞外DNA无法区分NET形成与其他相关细胞死亡通路。可通过使用针对不同死亡通路的特异性抑制剂来区分驱动NET形成的各类机制，或通过独立的免疫染色验证特定NET标志物（如瓜氨酸化组蛋白H3（citH3）和中性粒细胞弹性蛋白酶（NE））与DNA的共定位，从而实现鉴别。该检测方法中细胞外DNA与citH3和NE的共定位最近已被证实10。本检测避免使用NET特异性标志物的优势在于，能够尽可能全面且客观地评估中性粒细胞释放DNA的所有形式的NET形成，具备高通量筛选的潜力。该实验方案的应用已在研究自身免疫性疾病中免疫复合物介导的低水平NET诱导过程中得到验证，在此类研究中，检测定性和定量差异的能力可能比明确具体过程类型更为重要10,21,22。这表明，这种新型NET定量检测方法可为不同研究人员探索NET形成的多个方面提供附加价值。对该检测方法进行小幅调整十分简便：可调整刺激时间、选用偏好的NET标志物以聚焦于某一特定导致NET形成的死亡通路、采用不同的放大倍数，或在定量与分析中采用不同的NET判定标准。
总之，本方案提供了一种高灵敏度、广泛适用的半自动化检测方法，用于中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成的定量分析评估 离体 不同刺激下NETs的诱导
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
Eline J. Arends 和 Y.K. Onno Teng 的工作得到了荷兰肾脏基金会（17OKG04）以及荷兰科学研究组织临床奖学金（90713460）的支持。Laura S. van Dam 的工作得到了风湿病学研究基金会（FOREUM）的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 无菌水 H2O | B. Braun, Melsungen, 德国 | 12604052 | |
| 胎牛血清（FCS） | Bodinco, Alkmaar, 荷兰 | 高浓度使用可能影响中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的形成 | |
| Ficoll 5.7% - 胺基三甲酸 9% 密度 1.077 g/mL | LUMC, Leiden, 荷兰 | 97902861 | |
| 免疫荧光共聚焦显微镜 | Image Xpress Micro 共聚焦系统（Molecular Devices, Sunnyvale, CA, 美国） | ||
| 中和用 PBS (10x) | Gibco, Paisley, 英国 | 70011-036 | |
| 青霉素/链霉素（p/s） | Gibco, Paisley, 英国 | 15070063 | |
| 无酚红 RPMI 1640 培养基 (1x) | Gibco, Paisley, 英国 | 11835-063 | 酚红可能干扰免疫荧光信号 |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | B. Braun, Melsungen, 德国 | 174628062 | |
| PKH26 2 μM 红色荧光细胞连接染料 | Sigma Aldrich, Saint-Louis, MO, 美国 | PKH26GL-1KT | PKH 是专利保护的荧光染料，是一种以发现者 Paul Karl Horan 命名的细胞标记技术 |
| 科学多维图像分析软件 | ImageJ, Research Services Branch, 国立精神卫生研究所, Bethesda, Maryland, 美国 | ||
| RPMI 1640 培养基 (1x) | Gibco, Paisley, 英国 | 52400-025 | |
| Sytox Green 5 mM 不可渗透性 DNA 染料 | Gibco, Paisley, 英国 | 57020 | |
| 0.4% 台盼蓝染液 | Sigma Aldrich, 德国 | 17942E | |
| 96 孔黑色平底组织培养处理板 | Falcon, NY, 美国 | 353219 |
参考文献
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