观察木质部内的水分分布可为了解木本植物中水分流动动态提供重要信息。本研究展示了原位观察木质部水分分布的实用方法。 通过使用冷冻切片机和冷冻扫描电镜（cryo-SEM），可在样品制备过程中消除水分状态的人为假象变化。
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本文内容
摘要
摘要
安装了低温装置的扫描电子显微镜（cryo-SEM）可在低于零度的温度下对样品进行观察，并已结合液氮（LN2）冷冻固定技术用于研究植物组织中的水分分布。然而，对于木本植物，由于木材纤维的取向问题，制备用于观察木质部横切面的样品存在一定的困难。此外，木质部导管中水柱的较高张力有时会在样品固定和采集过程中引起水分分布的人为假象。在本研究中，我们展示了一种利用恒冷箱（cryostat）和 cryo-SEM 原位 观察木本植物木质部内水分分布的有效方法。首先，在采集样品时，应测定木质部水势，以判断木质部导管中是否存在高张力。当木质部水势较低（< 约 −0.5 MPa）时，需进行张力松弛处理，以在样品冷冻固定过程中更好地保持木质部导管内的水分状态。接着，在树干周围安装一个密封的环状夹具，并注入 LN2 ，以实现木质部水分状态的快速冷冻固定。样品采集后，必须确保在完成样品制备以供观察的过程中始终保持样品处于冻结状态。使用恒冷箱可清晰暴露木质部的横切面。在 cryo-SEM 观察中，需调整冷冻蚀刻时间，以去除表面霜尘并增强观察面上细胞壁边缘的可见性。我们的结果证明了 cryo-SEM 技术在细胞和亚细胞水平上观察木质部内水分分布的适用性。将 cryo-SEM 与非破坏性原位观察技术相结合，将极大地促进对木本植物水分流动动态的研究。
引言
水资源（即降水、土壤含水量）的可获得性严格决定了植物物种的死亡率和地理分布，因为植物需要从土壤中吸收水分并将其运输至叶片以进行光合作用。植物必须在水分供应波动的条件下维持其水分运输系统的正常功能。特别是木本植物在其导管中沿蒸腾流产生很高的张力，因为在某些情况下，它们需要将树冠维持在距地面超过约100米的高度。为了在如此高的负压下维持水柱的连续性，木质部导管由一系列具有坚硬且富含疏水性木质素细胞壁的管状细胞构成1。每种植物木质部导管对功能障碍的敏感性是判断该物种在水分供应波动条件下生存能力的良好指标2。此外，研究木质部导管的水分状态对于评估个体树木在非生物或生物胁迫下的健康状况具有重要意义。通过测量树液流速或水势，可以基于木质部导管的整体性水分传导功能来估算木本植物的水分状态。进一步地，对木质部细胞中水分分布进行可视化观察，有助于阐明木质部水分传导系统中各个组成部分的实际状况。
目前存在多种用于可视化木质部导管水分状况的技术3。观察木质组织中水分路径的经典且有效的方法包括：将切断枝条的末端浸入染料中，或向直立树木的茎干中注射染料，以对水柱进行染色4。软X射线摄影也可用于显示木材切片中的水分分布，其原理是基于木质部中水分对X射线吸收强度的差异5....
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方案
注意：本实验方案的示意图见图1。
1. 取样：木质部导管水柱内的张力弛豫
注意：建议在应用液氮（LN2）之前进行以下张力弛豫处理，以避免木质部水分分布中出现冻结和张力诱导的人为假象。
- 在采样前两小时以上，用黑色塑料袋包裹待采样的枝条和叶片，使木质部与叶片之间的水势达到平衡。
- 使用压力室或露点微伏计测定样品中至少两片叶片的水势。当水势高于约 −0.5 MPa（即无张力或张力极低）时，可在冷冻后采集样品（参见第2节：冷冻固定）。当水势低于 −0.5 MPa 时，则需进行如下所述的松弛处理。
- 在茎干周围安装一个防水套环，以便注水。可使用无底的塑料杯作为防水套环。 应使用胶带严密封闭茎干与套环之间的缝隙，防止后续使用的液体介质泄漏。对于柔韧的茎干（如细枝或小枝），可通过弯曲茎干将切割部位浸入盛水的桶中，并在水面以下使用修枝剪或锯子进行切割。 应尽快将样品转移至另一盛水容器中，以尽量减少切口暴露于空气的时间。
- 保持样品切口始终浸没于水中。对于阔叶树种，应确保用于扫描电镜（SEM）的冷冻样品取样位置至茎段切口的距离大于该物种导管的最大长度，以避免冷冻样品中出现张力诱导的人为假象。
- 用黑色塑料袋覆盖带有叶片的样品，....
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结果
通过冷冻扫描电镜观察到的针叶树和阔叶树木质部横切面的代表性图像如图2所示。在低倍镜下，图像中的黑色区域表示水分完全或部分消失的空腔，灰色区域则表示木质部细胞壁、细胞质以及水分（图2A）。在高倍镜下，可以明显看出三个管胞的腔体中水分并未完全丧失，表明木质部汁液中原位存在大尺度气泡（图2B）。对于阔叶树种而言，导管内的空穴现象易于检测，而纤维内部的水分则难以分辨，尤其是在低倍镜下（图2C）。通过冰晶纹理特征，可将薄壁细胞中的细胞质与管胞或导管中的水分区分开来（例如，图2B）。
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讨论
本文介绍的冷冻扫描电镜观察方法在清晰可视化细胞尺度上的水分分布方面具有实用性。通过该方法，探究木质部内水分分布的变化，有望帮助阐明树种对非生物胁迫（缺水或冰冻）或生物胁迫（树木病害）耐受性的机制。
该方法中最关键的步骤是在样品采集及后续制备过程中保持样品原有水分状态的水分分布特征。具有较长导管的物种（尤其是环孔树种的早材导管）在采收和冷冻过程中容易失水。Cochard 等人（2000 年）曾讨论过由于木质部导管中水柱处于高张力状态而导致的冷冻假象38,41。Umebayashi 等人（2016 年）通过与非破坏性的磁共振成像（MRI）观测结果进行比较，验证了张力释放样品的低温扫描电镜（cryo-SEM）观测结果的可靠性39。两种观测技术显示出相似的水分分布模式。尽管我们仍需验证不同物种在高水力张力下因冷冻引发的进气现象所表现出的特异性抗性，但为获得可靠的水分分布估算结果，特别是对于水分胁迫植物，应实施张力释放处理步骤。.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由日本学术振兴会科学研究费补助金（JSPS KAKENHI）（编号：20120009、20120010、19780129、25292110、23780190、23248022、15H02450、16H04936、16H04948、17H03825、18H02258）资助
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 包被材料 | JOEL Ltd., Japan | 金丝，0.50 × 1000 mm，纯度99.99%，货号 125000499 | |
| 冷冻扫描电子显微镜 | JOEL Ltd., Japan | JSM-6510，配备 MP-Z09085T / MP-51020ALS | |
| 恒冷箱切片机 | Thermo Scientific | CryoStar NX70 | |
| 切片机刀片 | Thermo Scientific | HP35 ULTRA 一次性切片刀片，3153735 | |
| 组织冷冻包埋介质 | Thermo Scientific | Shandon Cryomatrix 包埋树脂，6769006 |
参考文献
- Tyree, M. T., Zimmermann, M. H. Xylem structure and the ascent of sap. , Springer-Verlag Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. (2002).
- Choat, B., Jansen, S., et al. Global convergence in the vulnerability of forests to drought. Nature. 491 (7426), 752-755 (2012).
- Klein, T., Zeppel, M. J. B., et al.
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