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方法文章

Actinia equina（刺胞动物门）、Harmothoe sp.（环节动物门）和Xenoturbella japonica（异无腔动物门）的微焦点X射线CT（microCT）成像

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DOI：

10.3791/59161

⸱

2019年8月6日

 ,  ,  , 
1Mammalian Genetics Laboratory, National Institute of Genetics, 2Misaki Marine Biological Station, The University of Tokyo, 3Shimoda Marine Research Center, University of Tsukuba

本文内容

摘要

本文详细介绍了对三种海洋无脊椎动物进行微焦点X射线计算机断层扫描（microCT）成像的实验方案。本研究描述了样本固定、染色、安装、扫描、图像重建及数据分析等步骤，并提供了该方案如何针对不同样本进行调整的建议。

摘要

传统上，生物学家不得不依赖切片等破坏性方法来研究不透明生物体的内部结构。由于样本染色技术的进步以及微焦点X射线计算机断层扫描（microCT）设备、处理计算机和数据分析软件的不断创新，无损的microCT成像已成为生物学中一种强大且日益重要的研究方法。然而，与医学和工业领域相比，该技术在生物学中的应用尚不普遍。其应用受限的原因之一是缺乏一份涵盖所有必要步骤——包括样本采集、固定、染色、安装、扫描和数据分析——的简明易懂的操作手册。另一个原因是后生动物，尤其是海洋无脊椎动物的高度多样性。由于海洋无脊椎动物在体型、形态和生理上的巨大差异，在每一步骤中都必须根据具体样本调整实验条件和硬件配置。本文以三种系统发育关系相距较远的海洋无脊椎动物为例，详细阐述了microCT成像方法：Actinia equina（刺胞动物门，珊瑚纲）、Harmothoe sp.（环节动物门，多毛纲）和Xenoturbella japonica（异涡虫纲，异无腔动物门）。同时，也提供了对多种动物进行microCT成像的操作建议。

引言

生物研究人员通常需要制作薄切片，并通过光学显微镜或电子显微镜观察，以研究不透明生物体的内部结构。然而，这些方法具有破坏性，在处理稀有或珍贵标本时存在明显问题。此外，该方法中的多个步骤（如包埋和切片）耗时较长，具体观察样本所需时间依实验方案不同可能长达数天。再者，在处理大量切片时，总存在部分切片受损或丢失的风险。目前已有适用于某些标本的组织透明化技术1,2,3,4,5，但尚不适用于许多动物物种。

为解决这些问题，一些生物学家已开始使用微焦点X射线计算机断层扫描（microCT）成像6,7,8,9,10,11,12,13,14,15。在X射线CT中，样品受到来自X射线源的X射线从不同角度照射，X射线源围绕样品旋转，同时探测器也围绕样品移动以监测透射的X射线。所获得的X射线透射数据经过分析，用于重建样品的横截面图像。该方法能够在不破坏样品的情况下观察其内部结构。由于其安全性和操作简便性，该技术广泛应用于医学和牙科领域，全球的医院和牙科中心均配备了CT系统。此外，工业X射线CT也常用于工业领域中非医学样品的检测与计量观察。与医学CT中X射线源和探测器移动不同，工业CT中这两部分固定不动，样品在扫描过程中旋转。工业CT通常比医学CT具有更高的分辨率，被称为microCT（微米级分辨率）或nanoCT（纳米级分辨率）。近年来，microCT在生物学多个领域的研究应用迅速增加14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34。

最初，利用CT进行的生物学研究主要针对主要由硬组织（如骨骼）构成的内部结构。随着各种化学试剂染色技术的进步，现已能够实现对多种生物中软组织的可视化6,7,8,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34。在这些试剂中，基于碘的对比剂相对安全、成本低廉，可用于多种生物软组织的可视化7,14。关于海洋无脊椎动物，微型CT（microCT）已广泛应用于软体动物6,25,32,33、环节动物18,19,20,28以及节肢动物21,23,29,31等类群的研究。然而，对于其他动物门类（如苔藓动物6、异无腔动物26和刺胞动物24,30）的相关报道仍较少。总体而言，针对海洋无脊椎动物的microCT研究数量远少于脊椎动物。造成这一现象的主要原因之一在于这些动物具有极高的多样性。由于其在体型、形态和生理特征上的广泛差异，不同物种对各类实验操作的反应各不相同。因此，在样品制备过程中，必须为每个物种选择最合适的固定和染色试剂，并针对各步骤设定相应的处理条件。同样，也必须根据每个样品的具体情况，合理设置扫描参数，包括固定方式、电压、电流、机械放大倍数以及空间分辨率。为解决这一问题，亟需一份简明易懂的操作手册，涵盖所有必要步骤，说明各步骤如何根据样本特性进行调整，并提供来自多种样本的详细实例。

在本研究中，我们以三种海洋无脊椎动物为例，逐步描述了从样品固定到数据分析的显微CT成像实验方案。海葵Actinia equina（珊瑚纲，刺胞动物门）标本采自东京大学三崎海洋生物研究所附近海域。其身体呈球形、柔软，直径约为2 cm（图1A-C）。Harmothoe sp.（多毛纲，环节动物门）样品同样采集于三崎海洋生物研究所附近，为细长蠕虫状，体长约1.5 cm，全身分布有坚硬的刚毛（图 1D）。一例Xenoturbella japonica35（异涡虫科，异无体腔动物）标本采自筑波大学下田海洋研究中心附近海域，采集时间为第13次JAMBIO海岸生物联合调查期间。该标本为软体蠕虫，体长约0.8 cm（图1E）。本文详细说明了针对每种样品的条件和配置所作的调整。本研究为开展海洋无脊椎动物的显微CT成像提供了若干建议，希望可为生物学家将其应用于自身研究提供参考。

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方案

1. 固定

  1. 对于赤疣海葵（Actinia equina），在室温下用10% MgCl2海水处理约15分钟以使其放松。转移至70%乙醇中，并在室温下保存。
  2. 对于哈氏鳞虫属（Harmothoe sp.）动物，将其置于冰冻海水中约15分钟以进行麻醉。随后转移至含海水的10% (v/v) 甲醛溶液中，并在室温下保存。
  3. 对于日本 Xenoturbella（Xenoturbella japonica），使用含7% MgCl2的淡水使动物放松。在过滤海水中含4%多聚甲醛（PFA）的溶液中固定过夜。随后转移至70%乙醇中，并在4 °C下保存。
    注意：PFA具有危害性，必须小心操作。

2. 染色

  1. 将样品转移至50%乙醇中，室温下保存15小时。随后用25%乙醇替换50%乙醇，室温下保存2小时。
    注意：使用海水配制的10%（v/v）甲醛溶液保存的Harmothoe sp. 样品无需执行此步骤。
  2. 将溶液替换为蒸馏水（DW），在室温下用蒸馏水保存样品2小时。重复此步骤三次。
  3. 通过将原液（见下文）用蒸馏水稀释至25%，配制25%卢戈氏碘液。原液（100%卢戈氏碘液）包含10 g KI和5 g I2，用蒸馏水定容至100 mL。
    注意：卢戈氏碘液对光敏感，因此应避光保存和操作。碘的使用及废液处理须遵守各国及各机构的相关规定。
  4. 倒去样品中的蒸馏水，加入25%卢戈氏碘液，室温下染色24小时。

3. 样品台安装

  1. 在250 mL锥形瓶中，将500 mg琼脂糖溶于100 mL去离子水中，微波炉（800 W）加热约1-3分钟至完全溶解，制得0.5%琼脂糖溶液。室温冷却至约30-40 °C。
    注意：加热时切勿过热或完全密封烧瓶，以免琼脂糖沸腾溢出。
  2. 安装大型 样品，例如 A. equina 使用一个50 mL离心管。
    注意：对于无法放入1,000 μL移液器“蓝色”吸头的大样本，应使用50 mL离心管进行封片。
    1. 将染色后的样本放入盛有去离子水的60 mm培养皿中，以洗去表面多余的染色液。
    2. 将5 mL 0.5%琼脂糖轻轻倒入50 mL离心管中，并在冰上冷却使其凝固。注意避免在琼脂糖中产生气泡。
    3. 轻轻将20 mL的0.5%琼脂糖加入50 mL离心管中，并置于冰上，直至琼脂糖开始凝固。用镊子将样本放入0.5%琼脂糖中，注意避免产生气泡。
    4. 用镊子调整样品的位置和方向，并将琼脂糖置于冰上凝固。
    5. 将黏土置于微计算机断层扫描（microCT）样品台上，并将50 mL离心管放在黏土上（图2A).
  3. 安装小型 样品，例如 Harmothoe sp. 和 X. japonica 使用1,000 µL微量移液器的蓝色吸头。
    注意：对于较小的样本，可使用200 μL移液器“黄色”吸头。在此情况下，使用30 μL琼脂糖制备胶塞，并加入200 μL琼脂糖或蒸馏水。
    1. 吸取100 µL 0.5%琼脂糖至1,000 µL微量移液器“蓝色”吸头中，并将吸头悬空放置以使琼脂糖凝固 冰，使尖端形成堵塞（图2B-a).
    2. 将染色后的样品倒入60毫米培养皿中，避免使用镊子。
    3. 使用环形镊子将样本轻轻转移至另一含有去离子水的60 mm培养皿中，以洗去表面残留的染色液。
    4. 加入1,000 µL的任一溶液 0.5% 琼脂糖或 使用微量移液器将DW加入已堵塞的尖端（步骤3.3.1）。
      注意：推荐使用0.5%琼脂糖，但对于应避免使用琼脂糖的脆弱或珍贵样品，请使用去离子水（DW）。
    5. 轻轻将样品从60-mm培养皿转移至琼脂糖或 使用环形镊子从堵塞的尖端去除 DW。
    6. 用带柄针或精密镊子轻轻调整样品的位置和方向。注意避免在封片剂中产生气泡。当使用去离子水（DW）作为封片剂时，确保样品在尖端壁之间保持稳定。图 2D- b将琼脂糖凝固在冰上，如果将其用作封固介质。
    7. 剪切一个新的1,000 µL微量移液器“蓝色”吸头的尖端（图2B-b,c）并将带塞尖端的尖部插入新尖端中。
    8. 将黏土置于微计算机断层扫描（microCT）样品台，将装有样品的尖端固定在黏土上图2C，D).
      注意：样本一旦放入去离子水中，染色液将开始洗脱，因此请立即进行下一步扫描。

4. 显微CT扫描

  1. 将X射线束设置为80 kV、100 µA并开启。
  2. 在屏幕中央观察X射线透射图像时（图3A），通过点击X和Z轴按钮（图3A）并手动调节安装台上的Y轴旋钮（图3B），移动载物台，使整个样品可见。调节图像对比度条件（图3A：图像对比度），使内部结构清晰可见。
  3. 通过调整黏土中管/尖端的角度来调节样品的取向（图2A）。将旋转轴（图3A）设为90，然后点击相对移动按钮（图3A），使载物台旋转90°。重复此操作四次，完成完整的一周旋转。
    注意：每次打开样品门时，需手动关闭X射线束，除非系统自动关闭。
  4. 通过点击Z轴按钮（图3A）并手动调节安装台上的Y轴旋钮（图3B），移动载物台，使样品位于视野中心。将载物台旋转90°，重复上述操作。再将载物台旋转360°，确认样品在各个方向均位于视野中心。
  5. 通过点击X轴按钮（图3A），沿x轴方向移动载物台，使其靠近X射线源，以放大样品，并根据需要进行调节，使样品恰好充满视野（图3C）。
  6. 将载物台旋转360°，并根据需要进行调节，使 样品在各个方向均能完整呈现在视野内。
  7. 按照表1所示调整扫描条件。
  8. 开始扫描；扫描过程约需10分钟。

5. 图像重建

  1. 启动 microCT 系统的配套软件（参见材料表），并打开扫描数据。
  2. 通过点击自动偏移值计算按钮来校正样品在扫描过程中旋转轴的偏差（图 4A：绿色框）。
  3. 通过旋转橙色箭头调整图像方向（图 4B）。如果方向发生改变，请重复步骤 5.2。
  4. 点击区域选项卡（图 4C：品红色框），裁剪掉无样品存在的区域（图 4C：黄色框）。
  5. 点击重配置选项卡（图 4D：品红色框），并按以下设置应用滤波器以去除噪声：环形伪影减少滤波器：中值滤波器 -3；噪声消除滤波器：均值滤波器 -1。
  6. 点击重配置按钮执行重配置操作（图 4D：绿色框）。
  7. 通过设置黑值和白值来调整图像亮度和对比度，黑值设为 0，白值设为 250（图 4D：蓝色框）。
  8. 点击保存按钮，将重建后的 TIFF 图像数据集保存为 8 位 TIFF 格式。TIFF 文件重命名格式如下：日期_样品_分辨率(µm)_编号.tiff。
    注：本研究的原始 microCT 数据集可在 Figshare 仓储中获取，doi:10.6084/m9.figshare.767083736。

6. 数据分析

  1. 启动数据分析软件（参见材料表），通过点击数据库图标（图5A：品红色框）并关闭 图5B 中所示的复选框，启用TIFF文件的导入功能。
  2. 点击导入图标（图5C：品红色框），选择第5节中保存的数据集，然后点击打开。
  3. 点击复制链接按钮（图5D），以导入数据。
  4. 点击2D查看器图标（图5C：蓝色框），显示二维截面图像。
  5. 点击3D查看器选项卡（图5E：品红色框），输入扫描时的分辨率值（本研究中为0.018 [图5F]），以校准数据集。
  6. 点击亮度/对比度图标（图5E：绿色框），通过在显示的二维图像内移动光标并调整窗位和窗宽（图5G），调节亮度和对比度。
  7. 通过移动滚动条（图5G：框）查看其他截面图像。
  8. 点击方向图标（图5E：蓝色框）更改截面的方向，并在所有方向上检查图像（图5H）。
  9. 点击显示的图像，选择导出选项卡以保存截面图像。

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结果

我们对经25%卢戈氏碘液染色的 A. equina（珊瑚纲，刺胞动物门）、Harmothoe sp.（多毛纲，环节动物门）和 X. japonica（异涡虫纲，异无腔动物门）进行了显微CT成像。染色显著增强了所有样本内部结构的对比度，从而实现了对内部软组织的观察（图6）。结合以往的研究报道6,7,16,19,22,23,24,25,26

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讨论

本研究中使用的海水配制10%（v/v）甲醛溶液等含甲醛固定剂，已知可有效保存多种海洋无脊椎动物的形态结构，常用于显微计算机断层扫描（microCT）成像18,24,25,26,28,30,33然而，近年来一些国家对这种化学试剂的使用限制日益严格，可使用多聚甲醛或戊二醛等替代物。如果计划在扫描后提取DNA，则最好避免使用福尔马林作为固定剂，因为已知福尔马林会导致DNA断裂。在此情况下，建议使用能够保存DNA的固定剂，例如70%乙醇。在本研究中，所用刺胞动物 A. equina 用70%乙醇固定后，从70%乙醇固定的样品中获得了清晰的显微CT图像（

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢城一俊彦在本研究期间提供的协助和研究环境。感谢柳健介和泉贵人对 A. equina 的研究建议，以及田中正笃对 Harmothoe sp. 标本的指导。我们感谢筑波大学下田海洋研究中心和东京大学三崎海洋生物研究所的工作人员在样品采集过程中提供的帮助。我们感谢 Editage（www.editage.jp）提供的英文语言编辑服务。本研究得到了日本学术振兴会（JSPS）青年科学家研究资助（A）（JP26711022）以及日本海洋生物学协会（JAMBIO）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
250 毫升锥形瓶CorningCLS430183
5 毫升采样管 ST-500BIO-BIK103010
50 毫升聚丙烯管Greiner Bio One International227261
60 毫米未处理培养皿IWAKI1010-060
琼脂糖PromegaV3125
生态级吸头（蓝色）1000 µlBMBioBIO1000RF
乙醇Wako Pure Chemical Industries057-00451
福尔马林Wako Pure Chemical Industries061-00416
碘Wako Pure Chemical Industries094-05421
六水合氯化镁Wako Pure Chemical Industries135-00165
OsiriX DICOM 图像浏览器Pixmeo SARLOsiriX MD v10.0https://www.osirix-viewer.com
多聚甲醛Wako Pure Chemical Industries163-25983
柄式针AS ONE2-013-01
Pipetman P200 微量移液器GILSONF123601
Pipetman P1000 微量移液器GILSONF123602
碘化钾Wako Pure Chemical Industries166-03971
精密镊子 5 号DUMONT0302-5-PS
QuickRack MultI fit 吸头（黄色）200 µlSorenson10660
剃须刀片FeatherFA-10
环形镊子NAPOXA-26
体视显微镜LeicaMZ95
X 射线显微计算机断层扫描成像系统ComscantechnoScanXmate-E090S105

参考文献

  1. Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
  2. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23, 137-157 (2016).
  3. Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective. Journal of Biomedical Optics. 21, 081205(2016).
  4. Greenbaum, A., et al. Bone CLARITY: clearing, imaging, and computational analysis of osteoprogenitors within intact bone marrow. Science Translational Medicine. 9, (2017).
  5. Konno, A., Okazaki, S. Aqueous-based tissue clearing in crustaceans. Zoological Letters. 4, 13(2018).
  6. Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11(2009).
  7. Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
  8. Degenhardt, K., Wright, A. C., Horng, D., Padmanabhan, A., Epstein, J. A. Rapid 3D phenotyping of cardiovascular development in mouse embryos by micro-CT with iodine staining. Circulation Cardiovascular Imaging. 3 (3), 314-322 (2010).
  9. Metscher, B. D. X-ray microtomographic imaging of intact vertebrate embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 12, 1462-1471 (2011).
  10. Boistel, R., Swoger, J., Kržič, U., Fernandez, V., Gillet, B., Reynaud, E. G. The future of three-dimensional microscopic imaging in marine biology. Marine Ecology. 32, 438-452 (2011).
  11. Mizutani, R., Suzuki, Y. X-ray microtomography in biology. Micron. 43, 104-115 (2012).
  12. Merkle, A. P., Gelb, J. The ascent of 3D X-ray microscopy in the laboratory. Microscopy Today. 21, 10-15 (2013).
  13. Ziegler, A., Menze, B. H. Accelerated acquisition, visualization, and analysis of zooanatomical data. Computation for humanity. Information technology to advance society. Zander, J., Mosterman, P. J. , CRC Press. Boca Raton, USA. 233-260 (2013).
  14. Gignac, P. M., et al. Diffusible iodine-based contrast-enhanced computed tomography (diceCT): an emerging tool for rapid, high-resolution, 3-D imaging of metazoan soft tissues. Journal of Anatomy. 228 (6), 889-909 (2016).
  15. du Plessis, A., Broeckhoven, C., Guelpa, A., le Roux, S. G. Laboratory x-ray micro-computed tomography: a user guideline for biological samples. GigaScience. 6 (6), 1-11 (2017).
  16. Faulwetter, S., Vasileiadou, A., Kouratoras, M., Dailianis, T., Arvanitidis, C. Micro-computed tomography: Introducing new dimensions in taxonomy. ZooKeys. 263, 1-45 (2013).
  17. Staedler, Y. M., Masson, D., Schonenberger, J. Plant tissues in 3D via X-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS One. 8 (9), 75295(2013).
  18. Fernández, R., Kvist, S., Lenihan, J., Giribet, G., Ziegler, A. Sine Systemate Chaos? A Versatile Tool for Earthworm Taxonomy: Non-Destructive Imaging of Freshly Fixed and Museum Specimens Using Micro-Computed Tomography. PLoS One. 9 (5), 96617(2014).
  19. Paterson, G. L. J., et al. The pros and cons of using micro-computed tomography in gross and microanatomical assessments of polychaetous annelids. Memoirs of Museum Victoria. 71, 237-246 (2014).
  20. Faulwetter, S., Dailianis, T., Vasileiadou, K., Kouratoras, M., Arvanitidis, C. Can micro-CT become an essential tool for the 21st century taxonomist? An evaluation using marine polychaetes. Microscopy and Analysis. 28, 9-11 (2014).
  21. Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. Potential and limitations of X-ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: a methodological and comparative survey. Journal of Comparative Neurology. 523, 1281-1295 (2015).
  22. Landschoff, J., Plessis, A., Griffiths, C. L. A dataset describing brooding in three species of South African brittle stars, comprising seven high-resolution, micro X-ray computed tomography scans. GigaScience. 4 (1), 52(2015).
  23. Keiler, J., Richter, S., Wirkner, C. S. The anatomy of the king crab Hapalogaster mertensii Brandt, 1850 (Anomura: Paguroidea: Hapalogastridae) - new insights into the evolutionary transformation of hermit crabs into king crabs. Contributions to Zoology. 84 (2), 149-165 (2015).
  24. Holst, S., Michalik, P., Noske, M., Krieger, J., Sötje, I. Potential of X-ray micro-computed tomography for soft-bodied and gelatinous cnidarians with emphasis on scyphozoan and cubozoan statoliths. Journal of Plankton Research. 38, 1225-1242 (2016).
  25. Moles, J., Wägele, H., Ballesteros, M., Pujals, Á, Uhl, G., Avila, C. The End of the Cold Loneliness: 3D Comparison between Doto antarctica and a New Sympatric Species of Doto (Heterobranchia: Nudibranchia). PLoS One. 11 (7), 0157941(2016).
  26. Nakano, H., et al. A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella. BMC Evolutionary Biology. 17, 245(2017).
  27. Tsuda, K., et al. KNOTTED1 Cofactors, BLH12 and BLH14, Regulate Internode Patterning and Vein Anastomosis in Maize. Plant Cell. 29 (5), 1105-1118 (2017).
  28. Parapar, J., Candás, M., Cunha-Veira, X., Moreira, J. Exploring annelid anatomy using micro-computed tomography: A taxonomic approach. Zoologischer Anzeiger. 270, 19-42 (2017).
  29. Akkari, N., Ganske, A. S., Komerički, A., Metscher, B. New avatars for Myriapods: Complete 3D morphology of type specimens transcends conventional species description (Myriapoda, Chilopoda). PLoS One. 13 (7), 0200158(2018).
  30. Gusmao, L. C., Grajales, A., Rodriguez, E. Sea anemones through X-rays: visualization of two species of Diadumene (Cnidaria, Actiniaria) using micro-CT. American Museum Novitates. 3907, (2018).
  31. Landschoff, J., Komai, T., du Plessis, A., Gouws, G., Griffiths, C. L. MicroCT imaging applied to description of a new species of Pagurus Fabricius, 1775 (Crustacea: Decapoda: Anomura: Paguridae), with selection of three-dimensional type data. PLoS One. 13 (9), 0203107(2018).
  32. Machado, F. M., Passos, F. D., Giribet, G. The use of micro-computed tomography as a minimally invasive tool for anatomical study of bivalves (Mollusca: Bivalvia). Zoological Journal of the Linnean Society. , (2018).
  33. Sasaki, T., et al. 3D visualization of calcified and non-calcified molluscan tissues using computed tomography. Biomineralization. Endo, K., Kogure, T., Nagasawa, H. , Springer. Singapore. 83-93 (2018).
  34. Maeno, A., Tsuda, K. Micro-computed Tomography to Visualize Vascular Networks in Maize Stems. Bio-protocol. 8 (1), 2682(2018).
  35. Nakano, H., et al. Correction to: A new species of Xenoturbella from the western Pacific Ocean and the evolution of Xenoturbella. BMC Evolutionary Biology. 18, 83(2018).
  36. Maeno, A., Kohtsuka, H., Takatani, K., Nakano, H. MicroCT files from 'Microfocus X-ray computed tomography (microCT) imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)'. figshare. , (2019).
  37. Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).
  38. Buytaert, J., Goyens, J., De Greef, D., Aerts, P., Dirckx, J. Volume shrinkage of bone, brain and muscle tissue in sample preparation for micro-CT and light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Microscopy and Microanalysis. 20 (4), 1208-1217 (2014).
  39. Sasov, A., Liu, X., Salmon, P. L. Compensation of mechanical inaccuracies in micro-CT and nano-CT. Proceedings of SPIE. 7078, 70781(2008).

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Actinia equina（刺胞动物门）、Harmothoe sp.（环节动物门）和Xenoturbella japonica（异无腔动物门）的微焦点X射线CT（microCT）成像
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