Actinia equina（刺胞动物门）、Harmothoe sp.（环节动物门）和Xenoturbella japonica（异无腔动物门）的微焦点X射线CT（microCT）成像

摘要

本文详细介绍了对三种海洋无脊椎动物进行微焦点X射线计算机断层扫描（microCT）成像的实验方案。本研究描述了样本固定、染色、安装、扫描、图像重建及数据分析等步骤，并提供了该方案如何针对不同样本进行调整的建议。

摘要

传统上，生物学家不得不依赖切片等破坏性方法来研究不透明生物体的内部结构。由于样本染色技术的进步以及微焦点X射线计算机断层扫描（microCT）设备、处理计算机和数据分析软件的不断创新，无损的microCT成像已成为生物学中一种强大且日益重要的研究方法。然而，与医学和工业领域相比，该技术在生物学中的应用尚不普遍。其应用受限的原因之一是缺乏一份涵盖所有必要步骤——包括样本采集、固定、染色、安装、扫描和数据分析——的简明易懂的操作手册。另一个原因是后生动物，尤其是海洋无脊椎动物的高度多样性。由于海洋无脊椎动物在体型、形态和生理上的巨大差异，在每一步骤中都必须根据具体样本调整实验条件和硬件配置。本文以三种系统发育关系相距较远的海洋无脊椎动物为例，详细阐述了microCT成像方法：Actinia equina（刺胞动物门，珊瑚纲）、Harmothoe sp.（环节动物门，多毛纲）和Xenoturbella japonica（异涡虫纲，异无腔动物门）。同时，也提供了对多种动物进行microCT成像的操作建议。

引言

生物研究人员通常需要制作薄切片，并通过光学显微镜或电子显微镜观察，以研究不透明生物体的内部结构。然而，这些方法具有破坏性，在处理稀有或珍贵标本时存在明显问题。此外，该方法中的多个步骤（如包埋和切片）耗时较长，具体观察样本所需时间依实验方案不同可能长达数天。再者，在处理大量切片时，总存在部分切片受损或丢失的风险。目前已有适用于某些标本的组织透明化技术^1,2,3,4,5，但尚不适用于许多动物物种。

为解决这些问题，一些生物学家已开始使用微焦点X射线计算机断层扫描（microCT）成像^{6,7,8,9,10,11,....}

方案

1. 固定

1. 对于赤疣海葵（Actinia equina），在室温下用10% MgCl₂海水处理约15分钟以使其放松。转移至70%乙醇中，并在室温下保存。
2. 对于哈氏鳞虫属（Harmothoe sp.）动物，将其置于冰冻海水中约15分钟以进行麻醉。随后转移至含海水的10% (v/v) 甲醛溶液中，并在室温下保存。
3. 对于日本 Xenoturbella（Xenoturbella japonica），使用含7% MgCl₂的淡水使动物放松。在过滤海水中含4%多聚甲醛（PFA）的溶液中固定过夜。随后转移至70%乙醇中，并在4 °C下保存。
   注意：PFA具有危害性，必须小心操作。

2. 染色

1. 将样品转移至50%乙醇中，室温下保存15小时。随后用25%乙醇替换50%乙醇，室温下保存2小时。
   注意：使用海水配制的10%（v/v）甲醛溶液保存的Harmothoe sp. 样品无需执行此步骤。
2. 将溶液替换为蒸馏水（DW），在室温下用蒸馏水保存样品2小时。重复此步骤三次。
3. 通过将原液（见下文）用蒸馏水稀释至25%，配制25%卢戈氏碘液。原液（100%卢戈氏碘液）包含10 g KI和5 g I₂，用....

结果

我们对经25%卢戈氏碘液染色的 A. equina（珊瑚纲，刺胞动物门）、Harmothoe sp.（多毛纲，环节动物门）和 X. japonica（异涡虫纲，异无腔动物门）进行了显微CT成像。染色显著增强了所有样本内部结构的对比度，从而实现了对内部软组织的观察（图6）。结合以往的研究报道^{6,7,16,19,22,23,24,25,26}

讨论

本研究中使用的海水配制10%（v/v）甲醛溶液等含甲醛固定剂，已知可有效保存多种海洋无脊椎动物的形态结构，常用于显微计算机断层扫描（microCT）成像^{18,24,25,26,28,30,33}然而，近年来一些国家对这种化学试剂的使用限制日益严格，可使用多聚甲醛或戊二醛等替代物。如果计划在扫描后提取DNA，则最好避免使用福尔马林作为固定剂，因为已知福尔马林会导致DNA断裂。在此情况下，建议使用能够保存DNA的固定剂，例如70%乙醇。在本研究中，所用刺胞动物 A. equina 用70%乙醇固定后，从70%乙醇固定的样品中获得了清晰的显微CT图像（

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
250 毫升锥形瓶	Corning	CLS430183
5 毫升采样管 ST-500	BIO-BIK	103010
50 毫升聚丙烯管	Greiner Bio One International	227261
60 毫米未处理培养皿	IWAKI	1010-060
琼脂糖	Promega	V3125
生态级吸头（蓝色）1000 µl	BMBio	BIO1000RF
乙醇	Wako Pure Chemical Industries	057-00451
福尔马林	Wako Pure Chemical Industries	061-00416
碘	Wako Pure Chemical Industries	094-05421
六水合氯化镁	Wako Pure Chemical Industries	135-00165
OsiriX DICOM 图像浏览器	Pixmeo SARL	OsiriX MD v10.0	https://www.osirix-viewer.com
多聚甲醛	Wako Pure Chemical Industries	163-25983
柄式针	AS ONE	2-013-01
Pipetman P200 微量移液器	GILSON	F123601
Pipetman P1000 微量移液器	GILSON	F123602
碘化钾	Wako Pure Chemical Industries	166-03971
精密镊子 5 号	DUMONT	0302-5-PS
QuickRack MultI fit 吸头（黄色）200 µl	Sorenson	10660
剃须刀片	Feather	FA-10
环形镊子	NAPOX	A-26
体视显微镜	Leica	MZ95
X 射线显微计算机断层扫描成像系统	Comscantechno	ScanXmate-E090S105