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方法文章

制备及髓鞘化器官型小脑切片培养物的免疫染色

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DOI：

10.3791/59163

⸱

2019年3月20日

 ,  ,  ,  , 
1Sorbonne Université, Inserm, CNRS, Institut du Cerveau et de la Moelle épinière, ICM-GH Pitié-Salpétrière

本文内容

摘要

本文介绍了一种从小鼠小脑制备脑片器官型培养物的方法，并通过免疫组织化学染色显示髓鞘，适用于研究中枢神经系统中髓鞘形成及再髓鞘化的机制。

摘要

在神经系统中，髓鞘是由髓鞘形成性胶质细胞产生的一种复杂膜结构，包裹轴突并促进快速的电传导。研究表明，在多种神经系统疾病中均出现髓鞘的改变，且与功能缺陷相关。本文详细介绍了一种离体模型，该模型由小鼠脑片切片培养系统组成，可在体外培养数周，并可进一步标记以实现髓鞘的可视化。

引言

神经元是高度极化的细胞，包含一个接收来自环境输入的胞体-树突区室，以及一个负责向其他细胞产生和传导电冲动的轴突。信息的快速传导和及时传递对于神经系统的正常功能至关重要。在脊椎动物中，髓鞘化促进了这一过程，从而提高了轴突的传导速度1。髓鞘是由髓鞘形成胶质细胞产生的质膜紧密堆叠形成的特化结构，在中枢神经系统（CNS）中为少突胶质细胞，在周围神经系统（PNS）中为施万细胞。无论是在中枢神经系统还是周围神经系统中，轴突-胶质细胞相互作用均驱动形成特化的轴突区域：郎飞结及其周围的区域，即近结区（paranodes）和旁结区（juxtaparanodes）2。由髓鞘绝缘的轴突节段（即节间段）与郎飞结交替排列，郎飞结对应于富含电压门控钠通道（Nav）的小段无髓鞘区域。Nav通道在郎飞结处的高浓度和快速激活可实现动作电位的再生，结合髓鞘的绝缘特性，确保神经冲动沿轴突高效且快速地进行跳跃式传导3。

除了在加快神经冲动传导速度方面发挥作用外，髓鞘形成性胶质细胞还为轴突提供代谢支持，维持其长期完整性并参与其存活4,5。此外，近年来的研究已明确，髓鞘在整个生命过程中会动态调节，因而可能参与调控神经系统多种功能及其可塑性。沿轴突分布的髓鞘在分布位置、数量、长度和厚度上的调整，可能代表了一种精细调控各种神经网络功能的新机制6,7,8。因此，髓鞘的进化获得是感觉、运动和认知功能的关键过程，而轴突与胶质细胞之间相互作用的紊乱， increasingly被认为与发育性或获得性神经系统疾病的发生密切相关9。

髓鞘的组成已被明确，其显著特征是脂质含量较高（占70%），而蛋白质含量较低（占30%），这与其他细胞膜的组成形成对比10。然而，与髓鞘脂质不同，大多数髓鞘蛋白是髓鞘所特有的，包括髓鞘碱性蛋白（MBP）、蛋白脂质蛋白（PLP）、2',3'-环核苷酸3'-磷酸二酯酶（CNP）、髓鞘相关糖蛋白（MAG）、少突胶质细胞髓鞘糖蛋白（MOG）、PMP-22和P010。基于髓鞘的脂质组成，已有多种组织学染色方法可用于标记髓鞘，例如Luxol快蓝11、苏丹黑B12、Baker酸性血红素法13以及银染法14。然而，这些方法并不总能提供足够的对比度和分辨率以清晰显示单根纤维。另一种检测髓鞘的方法是利用针对髓鞘蛋白的免疫组织化学技术。多种抗体可高特异性地靶向髓鞘特异性抗原，并可常规用于检测有髓结构。通过使用与荧光染料偶联的二抗识别一抗，再结合适当的荧光显微镜观察，可进一步揭示抗体-抗原反应。本文中，我们描述了一种在离体小脑切片上进行髓鞘染色的免疫化学方案，该模型能够良好地保持神经组织的结构完整性。此外，浦肯野细胞（小脑中唯一的有髓神经元）具有特定的排列方式和较大的细胞体积，使其成为电生理研究的经典模型，同样也非常适合进行固定组织或活体成像研究。

小脑切片取自出生后9至10天（P9-P10）的小鼠，该时期对应浦肯野细胞髓鞘化早期阶段，此过程在体外培养约一周（6–7天，DIV）内基本完成15。此外，该模型适用于研究多发性硬化症（MS）等脱髓鞘疾病，因为使用髓鞘毒性化合物溶血磷脂酰胆碱（lyso-phosphatidylcholine，或称lysolecithin，LPC）可在小脑切片中诱导广泛的脱髓鞘，随后发生自发性再髓鞘化16,17。内源性再髓鞘化在从培养基中去除LPC后两天开始，治疗后约一周基本完成。

完成本方案大约需要3周时间，包括半天用于制备小脑切片培养物，一周时间获得完全髓鞘化的切片，随后2天达到脱髓鞘的高峰，再经过一周实现完全再髓鞘化。此外，免疫组织化学染色可在2天内完成。此处描述的方案适用于标准的一窝6只新生小鼠，需根据计划实验所使用的动物数量进行相应调整。

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方案

所有涉及动物的操作均符合匹兹堡大学医学中心（UPMC）、法国国家健康与医学研究院（INSERM）以及法国和欧洲共同体理事会指令86/609/EEC所制定的机构政策和指导方针。

1. 培养基与培养插件的准备（实际操作时间 ≈ 10–15 分钟）

注意：在无菌条件下于流动培养罩中进行此步骤

  1. 准备 40 mL 培养基，其组成为 50% BME、25% Hank’s 平衡盐溶液（1x）、25% 热灭活马血清，并添加 2 mM 谷氨酰胺衍生物、100 IU/mL 青霉素-链霉素和 4.5 mg/mL D-葡萄糖。将 pH 调整至 7.4。
  2. 使用安装在 50 mL 塑料注射器上的 0.22 μm 滤器对培养基进行过滤除菌。
    注意：培养基可在 4 °C 下保存至少一周。
  3. 对于一窝标准数量为 6 只幼鼠的实验，使用两个无菌的 6 孔板。对于每个板，取下盖子后，每孔加入 1 mL 培养基。
  4. 用无菌镊子夹住塑料边缘，将一个培养插件放入每个单独的孔中。将盖子重新盖回板上。
    注意：从一只幼鼠（6–8 日龄）获取的 cerebellar 切片可分配至两个膜上（每个膜插件放置 3–4 个 cerebellar 切片）。

2. 解剖培养基的制备（实际操作时间 ≈ 5 分钟）

注意：在无菌条件下于流动培养罩内进行此步骤

  1. 配制100 mL解剖培养基，其成分为Gey’s平衡盐溶液，并添加4.5 mg/mL D-葡萄糖和1×青霉素-链霉素（各100 IU/mL）。
  2. 使用0.22 μm滤器对培养基进行过滤除菌。
    注意：解剖培养基可在4 °C保存至少一个月。
  3. 向60 mm细胞培养皿中加入5 mL冷的解剖培养基。每只待解剖的幼鼠准备一个60 mm细胞培养皿。
  4. 将解剖用培养皿置于冰上，直至使用。

3. 解剖材料的准备（实际操作时间 ≈ 15 分钟）

  1. 用100%乙醇清洁实验台。
  2. 用100%乙醇对所有解剖工具、刀片以及组织切片机的塑料平台进行灭菌。
  3. 将刀片和塑料平台固定在组织切片机上，并将切片厚度调整为300 µm。
  4. 开始解剖前，确保所有乙醇已完全挥发。

4. 小脑解剖与切片制备（实际操作时间 ≈ 每只动物 15–20 分钟）

  1. 将一个含有冰冷解剖液的60 mm细胞培养皿置于体视显微镜下，移除顶部盖板。
  2. 用70%乙醇擦拭头部毛发（注意避免接触动物眼睛），然后根据批准的操作程序，使用大型锋利剪刀将动物断头。
    注意： 小脑切片取自P9-P10天小鼠，无特定性别或品系偏好。
  3. 使用小剪刀从颈部开始沿头部中线剪开皮肤，一直延伸至小鼠的吻部。
  4. 为固定头部并暴露颅骨，将头部下方的皮肤向腹侧翻折，并用手指捏住两层皮肤褶。
  5. 将小剪刀轻轻插入枕骨大孔，先向一侧做一侧向切口，然后沿头部颅骨周围完全剪开。剪切时应尽量保持剪刀尖端与颅骨平行并紧贴颅骨，以避免损伤脑组织。
  6. 使用精细直镊取下颅骨的背侧部分。在小心抬起颅骨背侧部分的同时，如需要，可用小剪刀剪断附着的脑膜（包围脑组织的透明灌注膜），以避免损伤脑组织。
  7. 用精细直头镊子（或 alternatively 使用解剖刀）小心插入腹侧颅骨与脑组织之间，轻柔地将脑组织翻出，并用小剪刀切断视神经和三叉神经。
  8. 将头部倒置在装有冰上冷解剖液的60 mm细胞培养皿上方，借助重力使脑组织落入培养皿中；如有需要，可用小剪刀松解最后的黏连组织。
  9. 用精细镊子将脑组织背侧朝向研究者、腹侧朝下置于培养皿底部。
  10. 在双目显微镜下，使用精细直镊夹住前脑侧固定脑组织，避免触碰后脑，以免造成损伤。将后脑与其余脑组织（前脑和中脑，参见示意图）分离 图1Aa），使用精细直镊。为了将小脑与后脑其余部分分离，用精细镊子剪断小脑下方的小脑脚（见示意图） 图1Aa’).
  11. 小脑分离后，使用精细直镊小心撕除脑膜（参见示意图） 图1Aa’).
  12. 用精细弯镊轻轻夹住小脑，将其背侧朝上放置于塑料平台上，并与切片刀片垂直（参见示意图） 图1Bb).
  13. 使用连接在1 mL移液枪上的无菌细头吸头，吸除小脑周围多余的分离培养基（参见示意图） 图1Bb).
  14. 确保小脑放置于平台上时平展但不被拉伸，以便在切片过程中获得最佳的矢状切面（参见示意图） 图1Bb).
  15. 使用组织切片机切取300 μm厚的脑干小脑矢状切片（参见示意图） 图1Bb’). 刀片的力度和速度需在现场进行优化。
  16. 轻轻将一滴解剖液加到切好的小脑组织上。使用连接在1 mL移液器上的宽口移液器吸头，缓慢吸取切好的小脑组织，并将其转移回含有冰冻解剖液的60 mm细胞培养皿中（参见示意图） 图1Bb’’).
  17. 每次小脑切片后，用100%乙醇清洁组织切片机的塑料平台。待乙醇完全挥发后，再将下一个小脑组织放置于平台上。
  18. 使用两把精细的直头镊子（或 alternatively 钛针）分离单个脑片，并从小脑蚓部选取 6-8 片脑片（参见示意图） 图1Cc 和 1Cc’).
  19. 取一个带有培养插件的6孔板，使用装有宽口吸头的1 mL移液器，将最多4个选定的脑片连同部分解剖液转移至一个培养插件上（参见示意图） 图1Cc’).
  20. 将切片置于培养插件的中央，使用解剖液或镊子轻轻推拉至合适位置，避免切片相互接触（参见示意图） 图1Cc’).
  21. 使用细头移液枪头吸除切片周围多余的解剖液。确保切片平铺在膜上（参见示意图） 图1Cc’).
  22. 将切片置于膜上后，立即将6孔板放入培养箱中。

5. 切片培养与脱髓鞘（实际操作时间 ≈ 15–20 分钟）

注意：在无菌条件下于流动培养罩内进行此步骤

  1. 制备脑片后，每隔3天，每孔更换1 mL预热并缓冲的新鲜培养基。
  2. 进行脱髓鞘处理时，在体外培养第6天（DIV）后，移除培养插件下方的所有培养基，并更换为每孔1 mL含有0.5 mg/mL LPC的预热新鲜培养基。在37 °C、5% CO2条件下孵育15–17小时。
  3. 孵育结束后，将插件转移至含有1 mL预热培养基的25 mm培养皿中进行洗涤。
    注意：插件应与培养基接触，但不可被培养基完全浸没。
  4. 立即将培养插件转移至含有新鲜预热培养基的新6孔板中。
  5. 直至脑片固定前，每隔2–3天更换一次培养基，每孔加入1 mL预热的新鲜培养基。

6. 免疫组织化学（实际操作时间 ≈ 1:30–2 小时）

注意：步骤 6.1 至 6.3 需在通风橱中进行。避免接触多聚甲醛（PFA），并参考产品安全数据表以进行正确的操作和防护。

  1. 使用镊子夹住培养插件的塑料边缘，将每个培养插件提起，并移除膜插件下方各孔中的培养基。
  2. 向膜插件上加入 2 mL 4% 多聚甲醛（PFA）溶于 1× PBS（pH 7.4）的固定液，固定小脑切片 30 分钟。
    注意：固定时间点取决于所研究的髓鞘化阶段：体外培养第 4 天（4 DIV）对应髓鞘化起始阶段，第 7 天（7 DIV）对应完全髓鞘化切片。若进行 LPC 处理，第 9 天（9 DIV）对应脱髓鞘峰值期，第 11 天（11 DIV）对应再髓鞘化起始阶段，第 14 天（14 DIV）对应完全再髓鞘化切片。
  3. 用 2 mL 1× PBS 将插件连同切片清洗三次，每次 10 分钟。
  4. 在体视显微镜下使用 25× 至 30× 放大倍数，用解剖刀或刷子轻轻推动，将切片从膜插件上分离。或者，为避免在剥离过程中损伤切片，可使用解剖刀将带有切片的膜一起切割下来。
  5. 用刷子将漂浮的切片转移至含有 1× PBS 的 4 孔板的各孔中。
  6. 吸除各孔中的 PBS，并在 -20 °C 下用预冷的 100% 乙醇孵育切片 15 至 20 分钟。此步骤有助于抗体渗透至髓鞘纤维中。
  7. 吸除 100% 乙醇，先用 1× PBS 快速洗涤一次，再于室温下用 1× PBS 洗涤两次，每次 10 分钟。
  8. 吸除 PBS，将切片在室温下用封闭液（含 1× PBS、5% 正常山羊血清（NGS）和 0.3% 非离子型去垢剂）孵育 30 至 45 分钟，以阻断非特异性抗体结合位点。
  9. 吸除封闭液。此步无需洗涤。
  10. 将切片在 4 °C 下与一抗稀释液中孵育过夜。为在小脑器官型切片中显示髓鞘，可使用 MBP 抗体（鸡源，1/150 或小鼠 IgG2b，Smi99，1/200）或 PLP 抗体（大鼠源，杂交瘤，1/5 至 1/10）。
    注意：若需在同一切片中显示多个抗原，可进行双重或三重染色（见 图1 示例）。若要同时孵育，需确保一抗来自不同物种，随后使用相应偶联不同荧光染料的二抗（参见 材料表 中结节区和旁结节区标志物18 抗体）。
  11. 第二天，用 1× PBS 将切片洗涤三次，每次 10 分钟。
  12. 在避光条件下，室温下用二抗稀释液（1/500 稀释度）孵育 3 小时。
    注意：若使用本文未提及的其他抗体，可能需要优化抗体稀释比例和孵育时间。
  13. 在避光条件下，用 1× PBS 将切片洗涤三次，每次 10 分钟。
  14. 在体视显微镜下，将切片置于载玻片上。在载玻片上滴加 100 µL 1× PBS，用刷子将切片转移至 PBS 液滴中。如有需要，将切片展开并压平，吸除多余 PBS。若免疫标记是在切片仍附着于膜上时完成的，则应将膜置于载玻片上，切片面朝向盖玻片进行封片。
  15. 在盖玻片上直接滴加一滴封片剂，轻轻覆盖切片。封片后的载玻片可在 4 °C 避光条件下保存数月。

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结果

代表性髓鞘免疫染色示例来自P9-P10 C57black6野生型（WT）小鼠的小脑器官型切片（图2A），以及PLP-GFP转基因小鼠的小脑器官型切片（图2B），同时显示浦肯野细胞染色。小脑切片的髓鞘化从切片的白质纤维区域向小叶周边延伸，浦肯野细胞的髓鞘化大多在培养6至7天（DIV）后完成。在培养第7天时，可通过LPC处理诱导完全脱髓鞘（图2Ci-ii）。脱髓鞘后，切片可自发再髓鞘化，并在脱髓鞘峰值后的6-7天内实现完全再髓鞘化（图2Ciii）。

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讨论

本文详细阐述了一种制备小鼠小脑器官型切片培养的离体模型的实验方案，该方案改编自先前已发表的方法15,16,19，并进一步对这些切片进行髓鞘免疫染色。该策略能够在健康和病理状态下，以高分辨率可视化髓鞘组分。

取自10日龄小鼠的小脑器官型脑片培养是一种成熟的实验模型，可用于研究髓鞘形成及再髓鞘化过程中潜在的分子与细胞机制，因其能够在体外重现相应组织在体内的大部分解剖和功能特征，不仅保留了明确的细胞结构，还保留了正常的成熟时间进程17。此外，小脑脑片在体外培养两周后仍能保持其结构组织的完整性 （图1C）。转基因PLP-GFP小鼠品系提供了一种替代方案，特别适用于在活体脑片上通过荧光体视显微镜直接观察髓鞘化状态，这对脱髓鞘-再髓鞘化研究尤为便利

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披露

所有作者均无竞争利益或利益冲突。

致谢

感谢 Sean Freeman 博士、Nathalie Sol-Foulon 博士和 Thomas Roux 博士对本文稿提出的宝贵意见。本研究由法国国家健康与医学研究院（INSERM）、ICM、ARSEP 基金会资助（项目编号 R13123DD）、法国国家研究局（ANR）资助（项目编号 R17127DD，授予 A.D.）、法国医学研究基金会（FRM）博士后奖学金（SPF20110421435，授予 A.D.）以及博士后培训基金（FDT20170437332，授予 M.T.）。 我们感谢 CELIS 细胞培养平台和 icm.Quant 成像平台的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BME 培养基ThermoFisher Scientific41010026
Hank’s 平衡盐溶液 (10x HBSS)ThermoFisher Scientific14180046
GlutaMAX (100x)ThermoFisher Scientific35050038
热灭活马血清ThermoFisher Scientific26050088
青霉素–链霉素 (10,000 IU/mL)ThermoFisher Scientific15140122
Gey’s 平衡盐溶液Sigma AldrichG9779-500ML
D-葡萄糖溶液 (45%)Sigma AldrichG8769-100ML
溶血磷脂酰胆碱 (LPC)Sigma AldrichL4129-100MG
多聚甲醛 (PFA)Electron Microscopy Sciences15714
无水乙醇 (100% 乙醇)VWR Chemicals20821.330在 -20°C 下冷却
Triton® X-100Sigma AldrichX100-500ML
10% 正常山羊血清 (NGS)ThermoFisher Scientific500622
磷酸盐缓冲液EuroMEDEXET330-ApH 7.4
抗-GFP 抗体 (多克隆，鸡源)Merck Millipore06-896稀释比例 1/300
抗髓鞘碱性蛋白 (MBP) 抗体 (多克隆，鸡源)Merck MilliporeAB9348稀释比例 1/150
抗髓鞘碱性蛋白 (MBP) 抗体 (单克隆，小鼠 IgG2b)Merck MilliporeNE1019稀释比例 1/200
抗PLP抗体 (大鼠，杂交瘤)由日本冈崎市 K. Ikenaka 博士惠赠稀释比例 1/5 至 1/10
抗泛钠离子通道抗体 (单克隆，小鼠 IgG1，克隆 K58/35)Sigma AldrichS8809稀释比例 1/150
抗Caspr抗体 (多克隆，兔源)Abcamab34151稀释比例 1/500
与 Alexa Fluor 488、594、647 或 405 标记的山羊二抗ThermoFisher Scientific稀释比例 1/500
Fluoromount 封片剂SouthernBiotech0100-20
组织切片机McIlwain
剃刀刀片
大剪刀F.S.T14101-14
小剪刀F.S.T91500-09
直头精细镊子F.S.T91150-20
弯头精细镊子F.S.T11297-00
细胞培养皿 (60 mm 和 100 mm)TPP
4 孔和 6 孔培养板TPP
Millicell 培养插件 (0.4 µm，直径 30 mm)Merck MilliporePICM0RG50
细胞培养孵箱37°C，5% CO2
细头移液器吸头Dutscher134000CL
宽口移液器吸头ThermoFisher Scientific2079G
无菌注射器Terumo Europe20 或 50 mL
无菌注射器滤器Terumo Europe0.22 µm
手术刀Swann-Morton0510
刷子
显微镜载玻片RS France76 mm × 26 mm × 1.1 mm
玻璃盖玻片RS France22 mm × 22 mm
Kimtech 科学擦拭纸Kimberly-Clark Professional5511
双目显微镜

参考文献

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