本文介绍了一种用于测定血清中抗Shigella抗体杀菌活性的实验方案。将血清与细菌及外源补体混合，孵育后将反应混合物接种于琼脂平板。存活的细菌形成菌落，使用自动菌落计数仪进行计数，并据此确定杀菌滴度。
本文内容
摘要
摘要
血清杀菌试验（SBAs）用于检测抗体的功能活性，已有数十年的应用历史。SBAs通过评估血清中抗体与细菌结合并激活补体的能力，直接测量抗体的杀菌活性。这种补体的激活会导致靶向细菌的裂解和死亡。这些试验具有重要价值，因为它们不仅限于量化抗体的产生，还能阐明这些抗体所具有的生物学功能，使研究人员能够研究抗体在预防感染中可能发挥的作用。SBAs已被用于研究多种人类病原体的免疫应答，但目前尚无广泛接受的针对Shigella的标准方法。传统上，SBAs劳动强度极大，需要多个耗时的步骤来准确量化存活细菌。本方案描述了一种简单、稳健且高通量的体外检测血清中特异性抗Shigella功能抗体的方法。此处所述方法相较于传统SBAs具有多项优势，包括使用冻存的菌种、96孔检测板、微培养系统以及自动菌落计数。所有这些改进使该试验的劳动强度更低，通量更高。该方案比传统SBAs操作更简便、更快速，同时仍采用简单技术和 readily available 试剂。该方案已在多个独立实验室成功应用，试验结果稳健且可重复。该方法可用于临床前及临床研究中免疫应答的评估。在抗原暴露（通过免疫接种或感染）前后定量测定抗志贺菌抗体滴度，有助于更全面地理解功能性抗体应答的产生机制及其对保护性免疫的贡献。这一标准化且特征明确的检测方法的建立，将极大促进Shigella疫苗的设计与开发。
引言
志贺氏菌血清型，包括福氏志贺氏菌 2a、S. flexneri 3a 和S. sonnei，在全球范围内具有显著的流行病学优势。由这些志贺氏菌物种引起的腹泻性疾病对军队人员和旅行者构成影响1，并且是发展中国家5岁以下儿童腹泻相关死亡的主要原因2。目前尚无获批用于预防志贺氏菌感染的疫苗，但已有多种候选疫苗处于不同研发阶段。其中许多疫苗以及其他正在开发的预防措施，均聚焦于针对志贺氏菌脂多糖（LPS）产生的抗体。LPS 是一个理想的疫苗候选靶点，因为它是主要的表面抗原，且自然感染志贺氏菌可诱导产生特异性抗LPS抗体，从而在血清型特异性的基础上提供对再感染的保护作用。因此，一种成功的志贺氏菌疫苗很可能需要具备多价特性，并针对3至4种志贺氏菌血清型，以对全球流行的70%–80%菌株诱导免疫保护3,4,5,6。这就要求评估志贺氏菌候选疫苗的检测方法必须能够特异性地识别多种不同的血清型。
目前评估疫苗候选物的免疫学检测方法主要集中在定量抗体滴度水平，但用于评估功能性抗体的检测方法却很少得到充分表征。检测抗体的功能能力非常重要，因为针对病原体的特异性抗体可通过多种功能机制抵抗感染，包括结合细菌表面抗原、阻止细菌黏附和侵染上皮细胞、靶向细菌细胞或介导调理作用与吞噬作用，以及通过结合并激活补体级联反应直接杀灭病原体。抗体对细菌的直接杀伤作用发生在抗体结合靶细菌表面组分并启动补体级联反应时，导致多个酶原被激活，最终在细菌细胞膜上形成孔道，引起细菌裂解和死亡。循环抗体与补体介导的对细菌的直接杀伤作用可能在感染早期构成关键的防御防线。
自然感染的个体血清中含有具有志贺菌杀灭活性的抗体。这些 志贺氏菌-使用传统的补体介导杀伤试验检测特异性抗体 7,8这表明杀菌抗体在抵御感染方面可能具有重要作用 志贺氏菌传统的杀菌试验操作简单：将血清进行热灭活（以消除内源性补体活性），然后与目标细菌混合。向该混合物中加入特定浓度的外源性补体。反应体系经孵育以允许细菌被杀灭，随后进行平板培养以确认菌落形成单位（CFUs）。在计数CFUs后，可计算出50%杀菌指数（KI）并确定血清杀菌活性（SBA）滴度。尽管该操作流程相对简单，但此类试验往往耗时耗力，且结果变异性较高。除这些局限性外，目前尚无充分表征的功能性检测方法可用于 志贺氏菌 因此，我们已成功开发并验证了一种简单、高通量的检测方法，用于测量 志贺氏菌 三种最具临床相关性的菌株的杀菌活性9本方案描述了一种经改进以提高检测效率和可重复性的血清杀菌试验（SBA）。其中第一项改进是使用冷冻保存的细菌菌种。制备一次性使用的细菌储备液，可避免每次检测前均需新鲜培养细菌，同时降低不同检测之间的变异。该方案另一项节省时间和劳力的优势在于采用96孔板检测体系。该体系可对样本进行系列稀释，从而实现多个浓度梯度的同时检测。 它还支持使用多通道移液器将样品接种到方形培养皿上。当这些方形培养皿与可生成微菌落的培养系统联合使用时，可减少检测所需的琼脂平板数量。结合最初为肺炎链球菌多重调理吞噬杀伤试验（MOPA）开发的免费菌落计数软件，10可实现快速、自动且可靠的菌落计数。上述所有改进显著减少了实验操作时间，并构建出高通量系统，可同时运行多块培养皿。
虽然本方案已针对三种最具临床相关性的血清型进行了优化 志贺氏菌， 此处描述的SBA可轻松应用于多种其他细菌病原体。除了本方案可能适用于其他细菌外，该方法还有望突破仅以血清作为起始材料的限制，进而拓展至分析其他相关样本类型中的抗体，例如黏膜样本，包括唾液和粪便样本。利用该检测方法研究疫苗接种后的免疫应答，有助于更全面地理解疫苗诱导的免疫反应，从而推动疫苗的理性设计，并促进对自然免疫形成机制的理解。
方案
本方案遵循美国陆军传染病医学研究所（WRAIR）人体受试者保护委员会的指导原则。本研究中使用的样本为人类血清样本，采集自WRAIR第1328号方案，符合所有关于人体受试者保护的机构及联邦法规。样本已去标识化，美国阿拉巴马大学伯明翰分校机构审查委员会（UAB IRB）认定此类匿名样本的使用不属于人体受试者研究（方案编号N150115001）。
1. 准备检测试剂
- 将1 g明胶加入100 mL水中，配制1%明胶溶液。经高压灭菌后，室温保存。
- 将5 g TTC（2,3,5-氯化三苯基四氮唑）加入40 mL水中，配制100 mg/mL的TTC储备液（1,000倍）。待TTC完全溶解后，加水定容至50 mL，并使用0.2 µm滤膜进行无菌过滤。溶液于4 °C避光保存。
注意：TTC可使细菌菌落显色，从而更易于计数。TTC溶液呈淡黄色。若溶液变为红色，则应弃去并重新配制。 - 将5 g NaN3加入40 mL水中，配制10%叠氮化钠（NaN3）储备液（100倍）。待完全溶解后，加水定容至50 mL。室温保存。
注意：叠氮化钠为有毒物质，若被摄入或经皮肤、眼睛吸收可能引起中毒。其可与铅或铜质管道反应生成极易爆炸的金属叠氮化物。含叠氮化钠的试剂在废弃时，应以大量水冲洗，防止叠氮化物积聚，或将其丢弃于生物危害废物袋中。 - 将35 g LB琼脂加入1 L水中，高压灭菌后制备LBA平板（LB琼脂平板）。每块方形培养皿（120 × 120 mm2）中加入25 mL琼脂。于室温下静置10–20 min，使琼脂凝固。将平板放回塑料袋中，4 °C保存，最长可保存1个月。
- 将7.5 g琼脂加入1,000 mL水中，高压灭菌后制备覆盖琼脂（Overlay Agar）。使用前置于56 °C水浴中保温。使用前立即加入1 mL 100 mg/mL TTC溶液和10 mL 10% NaN3溶液，并充分混匀。
注意：每块LBA平板需加入25 mL覆盖琼脂。覆盖琼脂可提前制备，最长可保存1个月，使用时根据需要在微波炉或加热板上融化。应用前应确保琼脂温度约为55 °C。 - 将5 mL 10倍浓度的含Ca2+/Mg2+汉克斯平衡盐溶液（HBSS）、5 mL 1%明胶溶液加入40 mL水中，配制检测缓冲液（Assay Buffer）。室温保存。
2. 准备补体和靶向细菌
- 制备幼兔补体（BRC）
注意：补体批次选择的详细标准可在此处查阅：https://www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf- 取冻存的BRC，用流动的冷水解冻。每间隔约10-20分钟轻轻混匀一次，直至完全解冻。避免对BRC进行反复冻融。
- 在BRC解冻过程中，标记1.5 mL、5 mL或15 mL离心管，并将标记好的管子置于冰上预冷。将适当体积的BRC分装至预冷的离心管中（分装后立即放回冰上）。将分装后的BRC储存于≤ -70 °C的冰箱中。
注意：每块检测板大约需要1 mL补体。补体分装物仅供一次性使用，应根据实验设计的布局分装成合适的体积。 - 制备热灭活BRC时，先解冻一份有活性的BRC分装物。准备一个56 °C的水浴。待BRC完全解冻后，将其转移至水浴中，孵育30分钟。
- 孵育结束后，将热灭活的BRC从水浴中取出，在室温下冷却10-15分钟。剧烈混匀后，将约150 µL分装至1.5 mL微量离心管中。将分装物储存于≤ -10 °C。
- 制备靶细菌储备液
注意：以下步骤用于制备48份靶细菌储备液；如需更多分装量，可按比例放大操作。- 从冰箱中取出细菌主储备管，刮取冷冻表面，将少量冰晶转移至血琼脂平板上。立即将主储备管放回冰箱冷冻保存。
- 将该少量细菌储备物划线接种于血琼脂平板上，盖上平板盖。将平板倒置，在37 °C、5% CO2培养箱中过夜培养。
- 挑取约10个独立且光滑的单菌落，转移至含有30 mL LB液体培养基的50 mL离心管中。在37 °C下轻摇培养3-5小时，直至菌液OD600达到约0.6-0.7。
- 收集上层12.5 mL培养物，转移至新的50 mL离心管中。使用台式微量离心机在15,000 x g条件下离心2分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于25 mL含15%无菌甘油的LB培养基中。
- 充分混匀后，将0.5 mL分装至无菌的1.5 mL微量离心管中（约48管）。将分装物储存于≤ -70 °C的冰箱中。
- 使用凝集试验在使用前确认细菌的身份。
- 确定靶细菌储备液的最佳稀释倍数
注意：每批靶细菌储备液都必须在实验条件下进行滴定，以确定能够产生约120 CFU/点的稀释倍数。- 取一块微量滴定板（稀释板），在1A孔中加入135 µL检测缓冲液，在1B-1H孔中各加入120 µL检测缓冲液。
- 从冰箱中取出一管冻存的靶细菌，室温解冻。将15 µL解冻后的细菌储备液加入1A孔，使细菌储备液稀释10倍。
- 从1A孔中转移30 µL细菌溶液至1B孔，进行5倍系列稀释。继续进行5倍系列稀释至1H孔，共完成8个稀释梯度（1:10；1:50；1:250；1:1 250；1:6 250；1:31 250；1:156 250；1:781 250）。
- 另取一块微量滴定板（检测板），在检测板第1列和第2列的所有孔中各加入20 µL检测缓冲液。
- 将稀释板第1列各孔中的10 µL稀释后细菌液转移至检测板第1列和第2列对应孔中。例如，将稀释板1A孔中的10 µL细菌液分别加入检测板的1A孔和2A孔，依此类推。
- 随后按照下文“血清杀菌试验（SBA）”中Control A和Control B的步骤3.6-3.12继续操作。
- 待平板在冰上孵育后，使用八通道移液器将第1列各孔中的10 µL液体点样至LBA平板上。同样，也将第2列各孔中的液体点样至LBA平板上。
- 继续按照下文步骤3.14-4.6进行实验。
- 确定在Control B中产生约120 CFU/点的细菌稀释倍数，该稀释倍数将用于正式实验。
3. 血清杀菌试验（SBA）
注意： 下述步骤适用于一块检测板，但可增加检测板的数量。
- 将样本置于56 °C水浴中孵育30分钟，以进行热灭活。
注意：测试样本必须在检测前进行热灭活，以消除任何内源性补体活性。此步骤可在检测前完成，灭活后的样本可重新冷冻或在4 °C保存至使用前。 - 取一块检测板，在A至G行的第1至第12列各加入20 µL检测缓冲液。在H行的第1列和第2列中也各加入20 µL检测缓冲液，参见表1。
- 将每个测试样本以30 µL体积重复加样至检测板的H行。例如，将30 µL样本1加入3H和4H孔，将30 µL样本2加入5H和6H孔，依此类推。
- 使用多通道移液器对测试样本进行3倍系列稀释。
- 从3H-12H孔中取出10 µL样本，转移至G行对应孔中，并通过上下吹打8-10次充分混匀。
- 然后从3G-12G孔中取出10 µL样本，转移至F行对应孔中，并充分混匀。
- 继续按此方式逐行进行系列稀释至A行。混匀A行各孔后，从3A-12A孔中移除并弃去10 µL液体，使所有孔最终体积均为20 µL。
注意：由于在总体积为80 µL的反应体系中使用了20 µL血清，因此检测过程中存在4倍的额外稀释。在计算SBA滴度时必须考虑该稀释倍数，即将血清稀释倍数乘以4。例如，若起始稀释倍数为1:2，则实际检测的稀释倍数为1:8。
- 取出一管冷冻的目标菌储备液，在室温下解冻。根据预先确定的最佳稀释倍数（该稀释倍数在2.3节中已确定），将细菌用20 mL检测缓冲液稀释。使用多通道移液器向检测板的每个孔中加入10 µL稀释后的细菌溶液。
- 取出一管冷冻的天然BRC和一管冷冻的热灭活BRC，在室温下用流动的冷水解冻，或将其置于生物安全柜的格栅上并用气流吹拂以快速解冻。
- 配制20%的热灭活BRC溶液。将100 µL热灭活BRC与400 µL检测缓冲液混合。向第1列的所有孔（对照A孔）中各加入50 µL该20%热灭活BRC溶液。
注意：热灭活BRC作为对照，用于监测检测中的非特异性杀伤（NSK）。 - 配制20%的天然BRC溶液。将1 mL天然BRC与4 mL检测缓冲液混合。向第2至第12列的所有孔（对照B孔和测试样本孔）中各加入50 µL该混合液。
注意：反应体系中BRC的最终浓度为12.5%。 - 将检测板在板式振荡器上轻轻振荡10-15秒，或使用多通道移液器上下吹打8次，以短暂混匀。
- 将检测板置于37 °C微生物培养箱中孵育2小时（不振荡）。
- 将2块LBA平板干燥：打开皿盖，将平板正面朝上放置于生物安全柜中40-60分钟。
- 当2小时孵育结束后，将检测板转移至湿冰上，孵育10-20分钟以终止反应。
- 使用12通道移液器混匀H行各孔，然后将10 µL反应混合物点样至LBA平板底部。立即倾斜平板，使液滴沿表面流动约1.5-2 cm。按相同方法依次对G、F和E行进行点样，每次点样位于前一行上方。E、F、G和H行点样于一块LBA平板，A、B、C和D行以相同方式点样于第二块LBA平板，参见图1。
- 将LBA平板在室温下孵育，直至溶液被完全吸附（10-15分钟）。盖上皿盖，将LBA平板倒置放入微生物培养箱中过夜孵育（约16-18小时）。S. flexneri 2a和3a在29 °C孵育，S. sonnei在26 °C孵育。
注意：这些温度可产生大小适中的“微菌落”，便于菌落计数器准确计数9。 - 过夜孵育后，向每块LBA平板中加入25 mL含100 µg/mL TTC和0.1% NaN3的覆盖琼脂（约55 °C）。
- 将LBA平板在37 °C孵育2小时，使存活细菌形成红色菌落，参见下方图1。
- 使用数码相机拍摄平板图像，并将图像传输至已安装美国国家标准与技术研究院（NIST）集成菌落计数软件（NICE）的计算机，参见图2。
注意：NICE菌落计数软件可免费获取。详见材料清单中的说明和安装指南。
4. 计数细菌菌落
- 打开 NICE 软件，将操作员姓名、实验信息以及任何检测相关的备注输入到空白字段中。输入完成后，点击完成按钮。
- 通过点击打开按钮，并从计算机中选择正确的文件，导入拍摄的平板图像。
- 设置行数为 4，列数为 12，以调整检测参数。将背景设置为 -3 sigma，分辨率设置为低。参见图 2。
- 通过点击并拖动来移动感兴趣区域（ROIs），使每个 ROI 正好覆盖一个样品点。确保所有细菌菌落均位于 ROI 内，且样品之间无重叠。完成一个平板后，双击存储的数据图像列表中的下一个平板，并调整其 ROI。参见图 2。
- 当所有平板均调整完毕后，点击绿色的计数按钮，参见图 2 和图 3。计数完成后，点击导出按钮，以 .xls/.xlsx 格式导出数据。为后续数据分析，命名并保存该 .xls/.xlsx 文件。
- 将导出的数据整理为表格形式，使计数值按 96 孔检测板的布局排列，参见表 2。
5. 计算血清杀菌活性滴度（KI）和非特异性杀伤（NSK）
注意：SBA 效价，即杀伤指数（KI），定义为能够杀死 50% 目标细菌的血清稀释度的倒数。
- 通过计算活性补体对照孔（对照 B）的菌落形成单位（CFU）的平均值并除以 2，得出 50% 杀灭指数（KI）的临界值。计算每个样本在双复孔中各稀释度的平均 CFU，见表 3。
- 由于血清稀释度很少恰好产生该 50% KI 值，因此可从两个连续的血清稀释度中进行插值估算，其中一个杀灭率低于 50%，另一个高于 50%，见图 4。插值法计算 SBA KI 的公式如下所示：
注意：杀菌滴度（即 KI）也可使用阿拉巴马大学伯明翰分校（UAB）开发的 Opsotiter 软件自动计算。如需获取 Opsotiter，请联系 Moon Nahm 博士或 Rob Burton 先生。联系方式请访问 https://www.vaccine.uab.edu。 - 通过用 1 减去对照 B 的平均值除以对照 A 的平均值，计算 NSK 值。
结果
典型的检测中使用的96孔板布局如表1所示。该布局包含活性补体对照孔（对照B）、热灭活补体对照孔（对照A），以及五个重复检测的样品。样品从H行至A行在板上进行连续3倍梯度稀释，使得每个样品可同时检测8个稀释度。图1展示了两块LBA平板在过夜培养及覆盖物添加后的结果。显色反应已经发生，所有存活的菌落均呈现红色。在前三个稀释度（F-H行）中，所有被测样品均表现出明显的细菌杀灭作用；随着样品在板上进一步稀释，血清浓度降低，细菌杀灭效果也随之减弱。图2展示了NICE软件界面。图3显示了来自NICE软件的微菌落计数结果，这些计数数据已整理至表2中。计算每个样品各稀释度的平均CFU值，并据此计算50%杀灭指数（KI）值，结果见表3。该50% KI值可用于各血清稀释度的平均CFU值，以确定根据图4所述公式计算SBA KI所需的数值。该检测的最终结果如表4所示。
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | 对照 A | 对照 B | 稀释 8 | 稀释 8 | 稀释 8 | 稀释 8 | 稀释 8 | 稀释 8 | 稀释 8 | 稀释 8 | 稀释 8 | 稀释 8 |
| B | 对照 A | 对照 B | 稀释 7 | 稀释 7 | 稀释 7 | 稀释 7 | 稀释 7 | 稀释 7 | 稀释 7 | 稀释 7 | 稀释 7 | 稀释 7 |
| C | 对照 A | 对照 B | 稀释 6 | 稀释 6 | 稀释 6 | 稀释 6 | 稀释 6 | 稀释 6 | 稀释 6 | 稀释 6 | 稀释 6 | 稀释 6 |
| D | 对照 A | 对照 B | 稀释 5 | 稀释 5 | 稀释 5 | 稀释 5 | 稀释 5 | 稀释 5 | 稀释 5 | 稀释 5 | 稀释 5 | 稀释 5 |
| E | 对照 A | 对照 B | 稀释 4 | 稀释 4 | 稀释 4 | 稀释 4 | 稀释 4 | 稀释 4 | 稀释 4 | 稀释 4 | 稀释 4 | 稀释 4 |
| F | 对照 A | 对照 B | 稀释 3 | 稀释 3 | 稀释 3 | 稀释 3 | 稀释 3 | 稀释 3 | 稀释 3 | 稀释 3 | 稀释 3 | 稀释 3 |
| G | 对照 A | 对照 B | 稀释 2 | 稀释 2 | 稀释 2 | 稀释 2 | 稀释 2 | 稀释 2 | 稀释 2 | 稀释 2 | 稀释 2 | 稀释 2 |
| H | 对照 A | 对照 B | 稀释 1 | 稀释 1 | 稀释 1 | 稀释 1 | 稀释 1 | 稀释 1 | 稀释 1 | 稀释 1 | 稀释 1 | 稀释 1 |
| 样品 1 | 样品 2 | 样品 3 | 样品 4 | 样品 5 | ||||||||
表1：检测板布局。第1列和第2列包含补体对照孔。对照A位于第1列，为热灭活补体对照，含有SBA缓冲液、细菌和热灭活补体。对照B位于第2列，为活性补体对照，含有SBA缓冲液、细菌和补体。第3至12列包含血清样本。每个样本设两个复孔，从H行到A行进行3倍系列稀释。
图1：显色反应后的LBA平板。 代表性S. flexneri 3a细菌微菌落在过夜培养后已生长至适当大小。已加入覆盖琼脂，菌落通过还原覆盖琼脂中的TTC化合物而呈现红色。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：美国国家标准与技术研究院（NIST）集成菌落计数器（NICE）软件界面。 NICE 软件界面的图形化表示。在计数前，每个点位的菌落均被设定为兴趣区域（ROIs）的中心。数据可直接从 NICE 窗口中导出。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：在NICE软件中计数的LBA平板。 色彩照片图像被导入NICE软件中，菌落形成单位（CFUs）由软件自动计数。此图像显示了两块具有代表性的LBA平板及其菌落计数信息。请点击此处查看该图的放大版本。
| 185 | 167 | 145 | 151 | 122 | 134 | 119 | 142 | 124 | 115 | 113 | 123 | 1:17496 | 稀释度 8 |
| 186 | 152 | 145 | 138 | 132 | 135 | 108 | 116 | 100 | 119 | 105 | 109 | 1:5832 | 稀释度 7 |
| 179 | 160 | 145 | 135 | 109 | 120 | 54 | 55 | 71 | 75 | 79 | 89 | 1:1944 | 稀释度 6 |
| 193 | 153 | 146 | 138 | 87 | 105 | 5 | 6 | 6 | 9 | 19 | 30 | 1:648 | 稀释度 5 |
| 184 | 129 | 121 | 143 | 6 | 7 | 0 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1:216 | 稀释度 4 |
| 180 | 145 | 22 | 24 | 2 | 3 | 3 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 1:72 | 稀释度 3 |
| 207 | 129 | 1 | 0 | 2 | 2 | 1 | 0 | 4 | 1 | 0 | 1 | 1:24 | 稀释度 2 |
| 201 | 140 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 | 1 | 0 | 4 | 4 | 1:8 | 稀释度 1 |
| 对照 A | 对照 B | 样本 1 | 样本 2 | 样本 3 | 样本 4 | 样本 5 | |||||||
表2：细菌菌落数量统计。 CFU计数从NICE软件导出为Excel格式。这些数据可整理成表格，显示所有重复样本及对照孔的细菌计数结果。
| 对照 A | 对照 B | 148 | 128 | 131 | 120 | 118 | 1:17496 | 稀释度 8 |
| 189 | 147 | 142 | 134 | 112 | 110 | 107 | 1:5832 | 稀释度 7 |
| NSK (1-CtrB/CtrA)：22% | 140 | 115 | 55 | 73 | 84 | 1:1944 | 稀释度 6 | |
| 50% KI (CtrB/2)：73 | 142 | 96 | 6 | 8 | 25 | 1:648 | 稀释度 5 | |
| 132 | 7 | 1 | 1 | 1 | 1:216 | 稀释度 4 | ||
| 23 | 3 | 2 | 1 | 0 | 1:72 | 稀释度 3 | ||
| 1 | 2 | 1 | 3 | 1 | 1:24 | 稀释度 2 | ||
| 0 | 0 | 1 | 1 | 4 | 1:8 | 稀释度 1 | ||
| 样品 1 | 样品 2 | 样品 3 | 样品 4 | 样品 5 | ||||
表3：50% KI 截断值及重复样本均值的计算。50% KI 截断值通过计算所有对照B孔的平均值并除以2得到。对每份样本在双孔中检测的各稀释度分别计算其重复孔的平均值。同时计算NSK值。
图4：线性插值示意图。 将不同血清稀释度（x轴）下存活的细菌数量（y轴）进行绘图（黑色菱形点），并用细的黑色虚线连接各数据点。实线和虚线水平线分别表示0%和50%的杀菌率。位于50%杀菌线以上（稀释度5）和以下（稀释度4）的血清稀释点之间用红色线连接，并标示出杀菌滴度（KI）。请点击此处查看该图的放大版本。
| SBA KI | |
| 样品 1 | 72 |
| 样品 2 | 216 |
| 样品 3 | 1994 |
| 样品 4 | 1994 |
| 样品 5 | 648 |
表4：显示杀菌滴度（KI）的血清杀菌试验（SBA）结果。 已确定每个样本的最终SBA KI值并列出。这些值通过平均菌落形成单位（CFU）、50% KI截断值以及线性插值公式计算得出。
讨论
本文所述方案展示了一种功能性免疫检测方法，用于评估血清中抗体对志贺菌的杀灭活性。本方案所演示的实验采用针对志贺菌的单克隆抗体 S. flexneri 3a 被使用9 以及来自先前的对照人血清 志贺氏菌 疫苗研究11本实验所检测血清的来源可能差异较大，从临床前动物样本到人类临床样本均有可能，血清样本的志贺菌杀灭活性将受到个体所经历的免疫接种和暴露史的影响。在密切相关的血清型之间，可能会出现一定程度的交叉反应性 S. flexneri 2a 和 S. flexneri 3a 但与这些菌株相比，交叉反应性较低 S. sonnei9SBA 的基本原理在于抗体-抗原结合对补体级联反应的激活。因此，BRC 试剂的处理是本实验方案执行过程中诸多关键步骤之一。本检测选用 BRC 是因其在其他杀菌试验中表现出稳定的性能以及较低的非特异性杀菌（NSK）水平。12,13,14. BRC 的活性具有温度敏感性，必须采取适当措施，尽量减少冻融循环，将 BRC 分装为单次使用体积，并在使用前立即快速解冻 BRC 分装样品。补体活性的一致性将影响本实验的可重复性。另一个影响实验可重复性的关键步骤是菌液原液的制备与稀释。在开始实验前，必须确定菌液原液的合适稀释度，因为实验成功依赖于对照 A 和对照 B 的 CFU 数量稳定，每点平均约为 120 CFU。为了获得软件可准确计数的菌落点，成功执行细菌涂布技术也至关重要。滴加菌液后倾斜培养皿，使液滴流动距离约为 2–3 cm，这对于形成大小合适、分布均匀的菌落，从而实现 NICE 软件准确计数，是关键步骤。熟练掌握上述所有步骤，可确保本方案产生准确且一致的实验结果
即使所有关键步骤都已正确执行，仍有可能需要对本方案进行修改或故障排除。若要将本方案用于检测其他细菌，可能需要优化LB琼脂平板的过夜培养温度，以确保微菌落的形成。对于其他菌株或非血清来源的抗体，可能需要优化补体浓度。还应监测阴性血清对照的NSK值和杀菌指数（KI），以确保实验体系正常工作。阴性血清对照的NSK值不应超过70%。对照血清的KI值波动范围不应超过均值±2倍标准差。为在使用本方案时获得成功且一致的结果，必须严格按照本文所述步骤操作，并特别注意上述关键步骤。
虽然本方案满足了该领域的一项重要需求 志贺氏菌 科研界，该方案并非没有局限性。本方案依赖于生物材料，因此总会存在一些难以控制的变异性。不同批次和来源的补体活性差异可能会影响实验结果的一致性。为减轻这一问题，应妥善处理补体，并在采购前对新批次补体的活性进行检测。此外，将已知活性的补体批次混合成池，以获得均一的供应，也可能有所帮助。本方案在设计上较为简便，无需任何特殊设备，且自动菌落计数软件可免费获取。尽管这种简便性使其几乎可在任何实验室中应用，但仍需要过夜孵育。已有新近报道的检测方法所需孵育时间显著缩短，但需要特殊的预处理试剂。15该检测方法的另一个局限性在于，目前的形式仅能同时研究单一细菌物种。在 志贺氏菌 该领域迫切希望开发一种多价疫苗，因此能够以多重方式评估病原体的免疫学检测方法具有重要价值。该检测方法未来可被改进以满足这一需求，但目前形式下仍为单重检测。
尽管该检测方法存在一些局限性，但它相较于现有或替代方法仍具有诸多优势。这些优势包括多项改进，共同使得该方法的实施比传统SBAs更省力且通量更高。使用冷冻细菌菌种、96孔板检测格式、在较大的方形培养皿上涂布、菌落显色以便拍照和自动计数等步骤，均有助于减少完成该检测所需的材料和时间。该检测方法相较于其他高通量方法也具有优势，因为它不需要任何特殊试剂或专用设备。所述方案仅需基础试剂和免费软件即可实施，因此可在任何实验室环境中应用。
该方案提供的所有优势均使其适用于未来的多项研究。该检测方法特别适用于疫苗接种或自然感染后免疫应答的评估。这一应用使SBA成为一项有价值的工具 志贺氏菌 疫苗研究，并已被用于评估疫苗的免疫原性 志贺氏菌 结合疫苗，其中已证明这些疫苗能够诱导功能性抗体的产生16该方案已由多个实验室进行了广泛测试，结果表明其能够产生可靠且可重复的结果。9该方案在使用其他杀菌试验对相同样本进行检测时，也能获得可比的结果。17该检测方法所产生的数据具有一致性，且与其它传统方法具有兼容性，因此是准确评估血清样本杀菌活性的可靠工具。该检测方法也可轻松调整，用于评估其他类型的样本。尽管在成人临床试验中血清易于获取，但在针对婴儿和幼儿（该检测方法的最终目标人群之一）的试验中，往往难以获得足够的血清样本。 志贺氏菌 疫苗。在这些试验中，通常将全血采集到滤纸上并干燥。使用SBA对这类样本形式已取得一些初步成功。除全血外，黏膜样本（如唾液、粪便提取物和尿液）也是相关的重要检测目标 志贺氏菌 疫苗研究。目前，该方案已针对三种临床最相关的血清型进行了评估。 志贺氏菌 但也可根据需要进行调整以适用于其他用途 志贺氏菌 spp. 以及其他细菌病原体。后续工作将致力于开发一种多重检测方法，该方法将具备本方案所述检测方法的诸多相似特性。多重检测可实现对多种目标物的同步评估 志贺氏菌 同时检测多种血清型，进一步节省样本用量和实验操作时间。目前，该检测方法正在向全球多个实验室推广。这些全球性评估将产生更多数据，有助于在更大规模的研究中验证该检测方法的可靠性，同时增加可使用此血清杀菌活性检测（SBA）的微生物学与免疫学实验室数量，以评估来自不同流行地区的细菌与血清样本。本文所述的检测方法操作简便、通量高，具备提升免疫学评估能力的潜力 志贺氏菌 领域，以及更广泛地应用于其他细菌病原体的评估。
披露
R.W.K 是美国政府雇员，因此本文所表达的观点仅为作者个人观点，不一定反映美国陆军部、国防部或美国政府的官方政策或立场。
致谢
本工作由 PATH 向 M.H.N. 提供的资助支持。本研究是沃尔特·里德陆军研究所与阿拉巴马大学伯明翰分校之间通过合作研究与开发协议开展的。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 明胶 | Sigma | G9391 | 类型B，粉末，BioReagent，适用于细胞培养 |
| TTC（2,3,5-三苯基四氮唑氯化物） | Sigma | T8877 | ≥98.0%（HPLC） |
| 叠氮化钠（NaN3） | Sigma | S2002 | ≥99.5% |
| 幼兔补体 | PelFreez | 31061-3 | 3-4周龄 |
| 含Ca2+/Mg2+的HBSS | Invitrogen | 14065-56 | 不含酚红 |
| LB琼脂（Lennox） | Sigma | L2897 | 粉末状微生物生长培养基 |
| Bacto琼脂 | BD | 214010 | 粉末状，(C12H18O9)n |
| 甘油 | Sigma | G5516 | 分子生物学级，≥99% |
| LB肉汤（Lennox） | Sigma | L3022 | 粉末状微生物生长培养基 |
| 方形培养皿 | Sigma | Z617679-240EA | 120 mm × 120 mm |
| 检测板 | Costar | 3799 | 96孔U型底板，带盖 |
| NICE软件 | 阿拉巴马大学伯明翰分校 | ftp://ftp.nist.gov/pub/physics/mlclarke/NICE/ |
参考文献
- Riddle, M. S., Sanders, J. W., Putnam, S. D., Tribble, D. R. Incidence, etiology, and impact of diarrhea among long-term travelers (US military and similar populations): a systematic review. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 74 (5), 891-900 (2006).
- Tickell, K. D., et al. Identification and management of Shigella infection in children with diarrhoea: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (12), e1235-e1248 (2017).
- Livio, S., et al. Shigella isolates from the global enteric multicenter study inform vaccine development. Clinical Infectious Diseases. 59 (7), 933-941 (2014).
- Barry, E. M., et al. Progress and pitfalls in Shigella vaccine research. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 10 (4), 245-255 (2013).
- Noriega, F. R., et al. Strategy for cross-protection among Shigella flexneri serotypes. Infection and Immunity. 67 (2), 782-788 (1999).
- Levine, M. M., Kotloff, K. L., Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B. Clinical trials of Shigella vaccines: two steps forward and one step back on a long, hard road. Nature Reviews Microbiology. 5 (7), 540-553 (2007).
- Sayem, M. A., et al. Differential host immune responses to epidemic and endemic strains of Shigella dysenteriae type I. Journal of Health Population and Nutrition. 29 (5), 429-437 (2011).
- Rahman, M. J., et al. Effects of zinc supplementation as adjunct therapy on the systemic immune responses in shigellosis. The American Journal of Clinical Nutrition. 81 (2), 495-502 (2005).
- Nahm, M. H., et al. interlaboratory evaluations, and application of a simple, high-throughput Shigella serum bactericidal assay. mSphere. 3 (3), (2018).
- Burton, R. L., Nahm, M. H. Development and validation of a fourfold multiplexed opsonization assay (MOPA4) for pneumococcal antibodies. Clinical and Vaccine Immunology. 13 (9), 1004-1009 (2006).
- Tribble, D., et al. Safety and immunogenicity of a Shigella flexneri 2a Invaplex 50 intranasal vaccine in adult volunteers. Vaccine. 28 (37), 6076-6085 (2010).
- Kim, H. W., Kim, K. H., Kim, J., Nahm, M. H. A high throughput serum bactericidal assay for antibodies to Haemophilus influenzae type b. BMC Infectious Diseases. 16, 473(2016).
- Maslanka, S. E., et al. Standardization and a multilaboratory comparison of Neisseria meningitidis serogroup A and C serum bactericidal assays. The Multilaboratory Study Group. Clinical Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (2), 156-167 (1997).
- Jang, M. S., Sahastrabuddhe, S., Yun, C. H., Han, S. H., Yang, J. S. Serum bactericidal assay for the evaluation of typhoid vaccine using a semi-automated colony-counting method. Microbial Pathogeneis. 97, 19-26 (2016).
- Necchi, F., Saul, A., Rondini, S. Development of a high-throughput method to evaluate serum bactericidal activity using bacterial ATP measurement as survival readout. PLoS One. 12 (2), e0172163(2017).
- Riddle, M. S., et al. Safety and immunogenicity of a candidate bioconjugate vaccine against Shigella flexneri 2a administered to healthy adults: a single blind, randomized phase I study. Clinical and Vaccine Immunology. , (2016).
- Shimanovich, A. A., et al. Functional and Antigen-Specific Serum Antibody Levels as Correlates of Protection against Shigellosis in a Controlled Human Challenge Study. Clinical and Vaccine Immunology. 24 (2), (2017).
重印与许可
