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方法文章

流式细胞术检测FcγR交联诱导的巨噬细胞ROS产生

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DOI：

10.3791/59167

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2019年3月7日

 , 
1Division of Immunity and Pathogenesis, Burnett School of Biomedical Sciences, University of Central Florida

本文内容

摘要

本研究展示了如何使用流式细胞术检测由 FcγR 激活引发的活性氧（ROS）产生。该方法可用于评估吞噬细胞在免疫复合物、调理微生物或直接 FcγR 交联刺激下，其抗菌功能和氧化还原信号传导功能的变化。

摘要

氧化爆发或呼吸爆发用于描述吞噬细胞在多种免疫刺激下快速消耗氧气并产生活性氧物质（ROS）的现象。免疫活化过程中产生的活性氧物质主要通过损伤DNA和蛋白质的能力发挥强大的抗菌作用，从而导致微生物死亡。为了评估不同信号通路和分子在宿主防御机制中的贡献，必须能够可重复且简便地测量活性氧物质的生成。本文中，我们展示了利用荧光探针和流式细胞术检测活性氧物质产生的方法。尽管荧光检测法被广泛使用，但其在活性氧物质测量方面存在显著问题，尤其是在检测由特异性刺激（而非有丝分裂原性刺激）诱导的活性氧物质时。我们提供了一套详细的方法，用于检测由特异性Fcγ受体刺激所引发的活性氧物质生成，内容涵盖巨噬细胞的制备、预处理、染色、Fcγ受体交联，直至流式细胞术分析的完整流程。

引言

活性氧（ROS）是有氧呼吸过程中产生的活性分子或自由基副产物（综述见1）。其中包括超氧阴离子、过氧化物、过氧化氢、羟基自由基和羟基离子等。在正常的生理条件下，ROS主要由线粒体和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶产生，并被超氧化物歧化酶和谷胱甘肽等多种酶和蛋白质迅速解毒。当ROS产生过多或清除能力缺陷时，可导致氧化应激，此时活性氧会促进蛋白质、脂质和DNA的损伤，进而引起细胞应激或死亡，并导致病理疾病状态。然而，目前人们认识到ROS也可作为信号分子发挥作用（即氧化还原信号），通过介导多种分子和信号通路中间体的修饰，影响细胞代谢、增殖、存活、炎症信号传导以及衰老过程2。在吞噬细胞中，ROS在所谓的“呼吸爆发”过程中发挥关键作用，介导抗菌活性1,3,4,5,6。当吞噬细胞受到外界刺激时，NADPH氧化酶复合物的组分（p40phox、p47phox、p67phox）会从胞质溶胶转位至含有gp91phox和p22phox亚基的吞噬体膜上，并在Rac1/2的作用下共同形成具有完整功能的NADPH氧化酶复合物。组装完成的NADPH氧化酶利用NADPH将氧气还原为超氧阴离子，该反应发生于吞噬体囊泡内。超氧阴离子可直接造成损伤，也可经歧化反应生成过氧化氢。超氧阴离子和过氧化氢均可与其他分子反应，生成高活性的羟基自由基。这些ROS可通过与蛋白质上的铁硫簇发生反应，或引起DNA碱基氧化，从而介导损伤，最终导致微生物代谢受限或死亡5。NADPH氧化酶复合物及其在呼吸爆发过程中产生的ROS的重要性，在慢性肉芽肿病（CGD）患者的临床表现中得以体现7,8,9,10。CGD患者存在gp91phox基因突变，导致无法产生ROS，因而易反复感染某些细菌和真菌，而这些病原体在免疫功能正常个体中通常不会引起严重问题。因此，无论研究氧化应激、氧化还原信号传导还是宿主防御机制，能够实时检测ROS的生成都是一项有价值的研究手段。

已有多种检测方法用于测量活性氧（ROS）的产生或氧化应激的结果11,12,13。其中应用最广泛的方法之一是使用荧光探针2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH2-DA）14。该分子无色且具有亲脂性。DCFH2-DA可扩散穿过细胞膜，进入细胞后被胞内酯酶水解，脱去乙酰基生成DCFH2，从而转变为不能透过细胞膜的化合物。多种类型的活性氧（如过氧化氢、过氧亚硝酸盐、羟基自由基、一氧化氮和过氧自由基）可将DCFH2氧化为具有荧光特性的DCF（激发/发射波长：485–500 nm/515–530 nm），后者可使用配备标准荧光素滤光片组（FL1通道）的流式细胞仪进行检测。超氧阴离子与DCFH2反应较弱，但可与另一种探针二氢乙啶（DHE）反应，生成荧光产物2-羟基乙啶（同时也产生其他不依赖于超氧阴离子的荧光氧化产物）15。DHE氧化产生的荧光产物可在激发波长518 nm、发射波长605 nm（FL2通道）下检测。尽管这些探针使用相对简便，但要获得有效的实验结果和结论，必须了解其局限性，并在具体实验中谨慎设计染色步骤和对照措施。以下实验方案展示了如何使用一种市售试剂盒，该试剂盒包含上述两种探针，专为通过流式细胞术检测ROS而设计。我们用这两种探针对经预处理的小鼠骨髓来源巨噬细胞进行染色，并通过FcγR交联诱导ROS的产生。本文展示了采用该方案获得的代表性数据，并强调了成功开展实验所必须采取的适当预防措施。

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方案

动物操作方案已获得中佛罗里达大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。

1. 骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）的制备

  1. 培养基制备
    1. 制备D10F基础培养基：在杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中加入10%热灭活胎牛血清（FBS）、1 mM丙酮酸钠、10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）和0.05 mM β-巯基乙醇。
      注意：虽然最好使用新鲜的D10F培养基，但D10F基础培养基可提前两周配制，用于一周内的多个实验。每只小鼠约需175 mL D10F基础培养基（25 mL用于冲洗骨骼，150 mL用于制备巨噬细胞分化培养基）
    2. 制备LADMAC生长培养基：在伊格尔最小必需培养基（EMEM）中加入10%热灭活FBS和2 mM L-谷氨酰胺。在计划开始培养的当天新鲜配制该培养基。
      注意：1升LADMAC生长培养基可获得约（19）份50 mL的LADMAC条件培养基。
    3. 制备完全DMEM培养基：在DMEM中加入10%热灭活FBS和1×抗生素-抗真菌剂。在收获BMDM的当天新鲜配制该培养基。
      注意：每只小鼠约需100 mL完全DMEM培养基，包括用于细胞预处理的培养基。
  2. LADMAC条件培养基的制备
    1. 使用10 mL LADMAC生长培养基（见步骤1.1.2）在10 cm培养皿中将LADMAC细胞培养至完全汇合。在37 °C、5% CO2条件下孵育细胞。
    2. 当细胞达到汇合状态时，通过强力吹打培养基使细胞脱落。将1 mL脱落的细胞悬液接种至含有100 mL LADMAC生长培养基的T-175培养瓶中。在37 °C、5% CO2条件下孵育至细胞完全汇合（约一周时间）。通过此方法，一个10 cm培养皿可获得十个T-175培养瓶，或约1升条件培养基。
    3. 当细胞准备就绪后，收集条件培养基并在350 x g 下离心5分钟以沉淀不需要的细胞。将上清液通过0.2 μm滤膜过滤，并分装成50 mL等份后于-80 °C保存。LADMAC条件培养基分装物可在-80 °C保存数月而活性损失极小。
      注意：若预计进行大规模实验，应同时制备大量LADMAC条件培养基以确保一致性。若无法做到，则每次实验应使用来自同一批次或同一批号的LADMAC条件培养基分装物。
  3. 骨髓来源巨噬细胞的制备
    1. 在实验当天，通过将25%的LADMAC条件培养基加入先前配制的D10F培养基中（1份LADMAC条件培养基加3份D10F）来新鲜配制巨噬细胞分化培养基。切勿提前配制！仅根据BMDM培养所需量现配现用。
    2. 第1天：按照先前描述的方案16分离小鼠骨髓细胞，稍作修改，使用D10F基础培养基冲洗股骨和胫骨中的骨髓。每根骨的两端各用2.5 mL D10F培养基进行冲洗。直接将骨髓细胞冲洗至置于50 mL离心管上方的预润湿40 μm细胞筛中。剩余的培养基（约5 mL）可用于冲洗细胞筛。
    3. 将收集的骨髓细胞在350 x g 下离心5分钟。弃去上清液，并将细胞重悬于总共30 mL巨噬细胞分化培养基中（每只小鼠）。
    4. 准备并标记（6）个无菌10 cm培养皿。每个培养皿中加入5 mL巨噬细胞分化培养基。再将5 mL重悬的骨髓细胞悬液（溶于巨噬细胞分化培养基）加入每个培养皿中，使每皿总体积为10 mL。在37 °C、5% CO2条件下孵育5天。
    5. 第5天：吸除细胞培养基。用1–2 mL PBS洗涤一次，然后加入10 mL新鲜配制的巨噬细胞分化培养基。继续孵育3天。
    6. 第8天：按以下所述方法进行BMDM的收获。

2. BMDM 的收获、接种与诱导

  1. 将BMDMs在巨噬细胞分化培养基中培养7天后，移除上清液。用1-2 mL PBS洗涤贴壁巨噬细胞一次，吸除PBS。
  2. 向每块巨噬细胞培养板中加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA，置于37 °C培养箱中孵育5-10分钟，并频繁轻敲以促进细胞脱落。使用P1000移液器反复吹打使胰蛋白酶消化的巨噬细胞解离，并将细胞收集至含有10-15 mL完全DMEM培养基的50 mL离心管中。再用额外的2 mL完全DMEM培养基洗涤培养板，以收获残留的巨噬细胞。
    警告：巨噬细胞在胰蛋白酶中孵育时间不得超过10分钟。
  3. 将50 mL离心管在350 ×g条件下离心5分钟。弃去上清液。轻柔地重悬沉淀，并将细胞重悬于10 mL完全DMEM培养基中。使用血细胞计数板结合台盼蓝等活率染料对巨噬细胞进行计数，方法如下：
    1. 例如，将90 µL台盼蓝与10 µL细胞混合，得到1:10稀释液。
    2. 取上述混合液10 µL加入血细胞计数板，计数中央方格（5 × 5网格）。总细胞数 = 计数 × 104 × 稀释倍数（10）× 体积（10 mL）。
  4. 将细胞悬液调整至100万/mL，并将4 mL该细胞悬液接种至每块6 cm培养皿中。
    注意：每个实验至少需要3块培养皿。其中一块培养皿的细胞不进行刺激，第二组细胞通过交联FcγR进行刺激，第三块培养皿的细胞用于所有其他实验及流式细胞术对照。
  5. 将培养皿在37 °C、5% CO2条件下孵育过夜。
  6. 次日，吸除上清液，用1-2 mL PBS洗涤细胞一次。向每块培养皿中加入含100 ng/mL小鼠IFN-γ的完全培养基4 mL。在37 °C、5% CO2条件下孵育过夜。
  7. 如需要，可取部分细胞通过流式细胞术评估BMDMs的生成情况。每项检测使用1×106个细胞，并准备聚苯乙烯FACs管用于以下条件：同型对照、F4/80染色（或CD11b染色）。
  8. 通过向1× PBS中加入0.1% FBS制备流式细胞术染色缓冲液。仅使用此浓度FBS，以避免抵消后续步骤中无血清饥饿处理的效果。
  9. 每管分装1×106个细胞，在750 ×g条件下离心5分钟。
  10. 通过倾倒或吸除上清液，将细胞重悬于2 mL流式细胞术缓冲液中，洗涤一次。在750 ×g条件下离心5分钟。
  11. 吸除上清液，将细胞重悬于100 µL流式细胞术染色缓冲液中。向每管中加入1 µL抗小鼠CD16/32 Fc阻断抗体。冰上孵育5分钟。
  12. 无需洗涤，直接向“染色”管中加入2 µL FITC标记抗小鼠F4/80抗体或1 µL APC标记抗小鼠CD11b抗体，向“同型对照”管中加入相应同型对照抗体等量。冰上避光孵育30分钟。
  13. 直接向细胞中加入2 mL PBS洗涤细胞。在750 ×g条件下离心5分钟。
  14. 吸除上清液，将细胞重悬于150 µL PBS中。
  15. 在流式细胞仪上采集样本，设定采集终止条件为100 µL或目标门控内10,000个事件，并确保选择FSC、SSC、FL1（FITC抗小鼠F4/80）或FL4（APC抗小鼠CD11b）通道作为待分析参数。
  16. 使用流式细胞术软件，绘制FSC（X轴）与SSC（Y轴）的散点图，并围绕目标细胞群设门，排除死细胞和碎片（死细胞和碎片事件明显小于主细胞群，位于图左下区域）。
  17. 在目标细胞门控基础上，绘制直方图，X轴为FL1（FITC抗小鼠F4/80）或FL4（APC抗小鼠CD11b）。
  18. 运行“同型对照”样本。设置标记门，使绝大多数“同型对照”样本事件位于门左侧（<1%为阳性）。将此模板应用于染色样本文件。
  19. 运行“染色”样本。成功生成的BMDMs应表现为FITC抗小鼠F4/80或APC抗小鼠CD11b表达率>95%（图1A），而培养条件不当可能导致巨噬细胞生成不理想（图1B）。
    注意：若从多种基因型小鼠生成BMDMs，应记录每批BMDMs中这些标志物的表达水平，以便在评估刺激后ROS生成时作为排除样本的依据。

3. 活性氧检测的试剂与材料准备

  1. 将冻干的氧化应激检测试剂用 60 µL 无水 DMF 重悬，配制成 5 mM 的储存液。使用前轻轻混匀。
    注意：ROS-ID 试剂盒说明书指出，重悬后的试剂在 -20 °C 下可保存约 1 周。建议在重悬后立即分装至小型避光离心管中，以减少氧化，延长在 -20 °C 下的保存期限。
  2. 将冻干的超氧阴离子检测试剂用 60 µL 无水 DMF 重悬，配制成 5 mM 的储存液。使用前轻轻混匀。
    注意：根据试剂盒说明书，两种检测试剂均可能具有致突变性，操作时应小心处理，并妥善处置废弃物。
  3. 将 ROS 诱导剂（Pyocyanin）用 20 µL 无水 DMF 重悬，配制成 50 mM 的储存液。
  4. 将 ROS 抑制剂（N-acetyl-L-cysteine）用 123 µL 去离子水重悬，配制成 0.5 M 的储存液。
  5. 用实验对照和处理条件标记 5 mL 圆底聚苯乙烯管（流式细胞术专用管）。（参见第 4 节：实验条件与对照）
  6. 通过向不含酚红的 DMEM 中添加 0.1% FBS，配制低血清 DMEM（无酚红）。
  7. 将抗 BSA 抗体分装成小份（根据使用需求），并于 -80 °C 保存。
  8. 在 HBSS（Hanks 平衡盐溶液）或 PBS 中配制 100 mg/mL 的 BSA 储存液。分装为每份 100 µL，于 -20 °C 保存。
  9. 配制 ROS 探针的 2 倍浓度溶液（2x 探针溶液）：每 10 mL 低血清 DMEM 中加入 4 µL 氧化应激检测试剂（绿色染料）和 4 µL 超氧阴离子检测试剂（橙色染料）。
  10. 配制仅含氧化应激检测试剂的 2x 探针溶液（仅绿色），或仅含超氧阴离子检测试剂的 2x 探针溶液（仅橙色）。仅配制实验所需量的试剂，并在使用前立即配制 2x 溶液。
    注意：若需配制较小体积的 2x 检测溶液，可在最终稀释至 DMEM 前，先将绿色和橙色检测试剂分别进行 1:10 的中间稀释。例如，配制 1 mL 的 2x 检测溶液时，先将每种探针各取 1 µL 加入 9 µL DMEM 中（得到 1:10 中间稀释液），再取 4 µL 该中间稀释液加入 1 mL DMEM 中稀释。

4. 检测条件与对照

  1. 每次实验进行流式细胞术补偿时，需包含以下实验对照：
    a) 未染色且未刺激的细胞。
    b) 仅用氧化应激检测试剂（绿色试剂）染色并用活性氧诱导剂处理的细胞。
    c) 仅用超氧阴离子检测试剂（橙色试剂）染色并用活性氧诱导剂处理的细胞。
  2. 每只小鼠或每个生物学重复需包含以下6种条件：
    a) 未染色且未刺激的细胞
    b) 已染色但未刺激的细胞
    c) 经阳性诱导剂处理的染色细胞
    d) 经阳性诱导剂和活性氧抑制剂处理的染色细胞
    e) 通过FcγR交联激活的染色细胞
    f) 通过FcγR交联激活并经活性氧抑制剂处理的染色细胞
  3. 根据小鼠数量和实验条件计算所需2倍浓度探针溶液的用量（每种需要染色的条件使用200 µL的2倍浓度探针溶液）。
    注意：若实验使用6只小鼠，每只小鼠需要5种染色条件，则总条件数为30。因此，所需2倍浓度探针溶液的总量至少为6 mL（30×200 µL）。

5. 细胞制备

  1. 将巨噬细胞孵育过夜后，吸除上清液，用 PBS 洗涤细胞一次。
  2. 通过更换为等体积的低血清DMEM培养基使细胞血清饥饿。每只小鼠对应的一个培养板将用抗BSA IgG处理1 在血清饥饿的同时，另一组则不予处理。向未处理的培养板中仅加入低血清DMEM。向低血清DMEM中添加含2.5 µg/mL小鼠抗BSA IgG的成分1 处理过的培养板。
    注意：每次实验需要额外准备一个未经处理的培养板，用于流式细胞术补偿对照。
  3. 将培养板在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 4 小时2.
  4. 经血清饥饿处理后，用轻柔刮擦或含 0.2 mM EDTA 的 PBS 收集细胞。将细胞收集至已标记的 5 mL 圆底管中，并在 750 x g 5 分钟。记录哪些细胞经小鼠抗 BSA IgG 处理。1.
  5. 用2 mL PBS洗涤细胞沉淀一次，以去除处理过的细胞中残留的抗BSA。
  6. 将细胞沉淀重悬于600 µL低血清DMEM中。
  7. 从600 µL细胞悬液中，分装200 µL至预先标记的5 mL圆底试管中，具体如下：
    1. 从未经处理的细胞中，分别取 200 µL 加入标记为“unstimulated”的管中，200 µL 加入标记为“positive inducer”的管中，以及 200 µL 加入标记为“positive inducer + inhibitor”的管中
    2. 来自抗BSA IgG1 处理后的细胞，取200 µL加入标记为“FcγR交联/FcγR XL”的管中，另取200 µL加入标记为“FcγR XL + 抑制剂”的管中
    3. 从未处理的用于补偿对照的细胞中，分别取 200 µL 加入标记为“未染色未刺激”的管、200 µL 加入“绿色 + 诱导剂”对照管，以及 200 µL 加入“橙色 + 诱导剂”对照管。
      注意：如果5.7.1和5.7.3中的细胞来自同一只小鼠，则可使用相同的“未染色未刺激”细胞作为实验对照和补偿对照。若非如此，则需额外准备200 µL细胞，用于a）项的“未染色未刺激”实验对照。
  8. 将试管置于冰上直至染色和刺激步骤。在血清饥饿和IgG结合期间1, 按照下述说明准备探针、特异性刺激物和诱导剂。
    注意：如果首次进行该实验，或无可用模板，或流式细胞仪及相应软件不具备事后补偿功能，则需刺激并染色补偿对照样本，随后在流式细胞仪上运行，以进行手动补偿 之前 向实验样品中添加刺激物。

6. 实施检测

  1. 通过将吩嗪-1-羧酸（Pyocyanin）以1:100的比例稀释于步骤3.9中制备的2倍探针溶液中，配制2倍阳性诱导剂溶液，以获得500 µM的吩嗪-1-羧酸（最终浓度为250 µM）。同时，将吩嗪-1-羧酸以1:100的比例分别稀释至步骤3.10中制备的“2倍探针溶液，仅绿色”和“2倍探针溶液，仅橙色”试管中。
    注意：标记为“阳性诱导剂”和“阳性诱导剂 + 抑制剂”的所有条件均需使用阳性诱导剂处理。计算所需2倍阳性诱导剂溶液的总量时应合理规划。例如：若使用3只小鼠进行实验，则共有6个条件（3×2）需接受阳性诱导剂处理，因此需配制6×200 µL = 1.2 mL的2倍阳性诱导剂溶液。
  2. 通过将BSA储备液用2倍探针溶液稀释，配制2倍BSA溶液，使其终浓度为2 µg/mL（最终浓度为1 µg/mL）。
    注意：标记为“FcγR交联”和“FcγR交联 + 抑制剂”的所有条件均需使用2倍BSA溶液处理。计算所需溶液量时应合理规划。例如：若使用3只小鼠进行实验，则共有6个条件（3×2）需接受BSA溶液处理，因此需要6×200 µL或1.2 mL的2倍BSA溶液。
  3. 在开始特异性刺激（FcγR交联）前，确保所有试剂和细胞均已准备就绪。将试管按刺激顺序置于冰上。
  4. 对于配备自动进样器的流式细胞仪，请记录仪器分析一个样本并进入下一个样本所需的时间，包括任何混合和探针清洗步骤（例如3.5分钟）。
    注意：本实验的时间控制极为关键。为了确保每个条件均得到良好控制，每种条件的刺激必须精确持续30分钟。应按顺序刺激细胞，并考虑流式细胞仪在样本采集之间的延迟时间。例如，若仪器分析一个样本并进入下一个样本所需时间为3.5分钟，则应每隔3.5分钟按分析顺序依次刺激细胞。
  5. 若在此阶段进行手动补偿，请刺激用于补偿的对照管（步骤5.7.3）。向标记为“绿色+诱导剂”的试管（步骤5.7.3）中加入200 µL含诱导剂的“2倍探针溶液，仅绿色”（来自步骤6.1）。向标记为“橙色+诱导剂”的试管（步骤5.7.3）中加入200 µL含诱导剂的“2倍探针溶液，仅橙色”（步骤6.1）。
  6. 将细胞在37 °C、5% CO2条件下避光孵育30分钟。
  7. 使用流式细胞术软件，为对照样本“未染色、未处理”、“绿色+诱导剂”和“橙色+诱导剂”生成并标记3个样本文件，确保标明待分析的通道/参数（FSC、SSC、FL1、FL2）及期望的停止条件（100 µL、3分钟等）。为实验样本生成并标记一组类似的文件。
  8. 运行“未染色、未处理”样本。打开FSC（横轴）对SSC（纵轴）的散点图，并围绕目标细胞群绘制门控，排除死细胞和碎片（死细胞和碎片事件远小于主细胞群，出现在图的左下角）。
  9. 使用此“细胞”门控，打开FL1（横轴）对FL2（纵轴）的另一个散点图。绘制初步的象限门控。调整象限门控，使事件位于FL1对FL2图的左下象限。
  10. 运行“绿色+诱导剂”样本。调整电压，使事件出现在FL1对FL2图的左下和右下象限。将此补偿矩阵应用于全部3个样本文件。
  11. 运行“橙色+诱导剂”样本。调整电压，使事件出现在FL1对FL2图的左上和左下象限。将此补偿矩阵应用于全部3个样本文件。
  12. 检查每个补偿文件，确保“未染色、未处理”事件位于FL1对FL2图的左下象限，“绿色+诱导剂”事件位于左下和右下象限，“橙色+诱导剂”事件位于左上和左下象限。将补偿矩阵应用于所有实验样本文件。
    1. 在将补偿矩阵应用于所有实验样本文件之前，确保已对所有对照样本文件进行了适当的补偿。参见图2以查看代表性数据，展示未补偿和正确补偿的样本。
      注意：许多流式细胞仪将FL1指定为标准FITC/GFP通道（由蓝色488 nm激光激发，使用530/30滤光片组检测），将FL2指定为标准PE通道（由蓝色488 nm激光激发，使用585/40滤光片组检测）。我们采用相同的惯例，但提醒初次使用流式细胞术的用户咨询其流式细胞术核心负责人，以确保仪器配置相同，并使用正确的通道检测这些探针。根据流式细胞仪型号及配套软件的不同，可能在样本采集前或后进行补偿。如果支持事后补偿，则可在所有实验样本被仪器采集后进行补偿步骤。对于具有动态范围且无需调整PMT电压的流式细胞仪，也可在另一天进行补偿实验，并保存实验模板（包括补偿矩阵），以减少手动补偿所需时间。
  13. 完成手动补偿并获得实验模板后，开始处理实验样本。在使用阳性诱导剂或FcγR细胞刺激前，标记哪些试管需加入ROS抑制剂。至少在阳性诱导剂或FcγR刺激前30分钟，向这些细胞加入ROS抑制剂。
  14. 加入ROS抑制剂时，向200 µL重悬细胞（不含抗BSA IgG1）中加入1 µL抑制剂，使其终浓度为5 mM。
  15. 使用刺激物（或阳性诱导剂）处理细胞，并按如下方式加载ROS探针：
    1. 对于未刺激细胞：向标记为“已染色、未刺激”的200 µL细胞悬液中加入200 µL不含任何刺激物的2倍探针溶液。
    2. 对于阳性对照：向标记为“阳性诱导剂”或“阳性诱导剂 + 抑制剂”的200 µL细胞悬液中加入200 µL 2倍阳性诱导剂溶液（步骤6.1中制备）。
    3. 对于通过FcγR交联刺激的细胞（特异性刺激）：向标记为“FcγR交联”或“FcγR交联 + 抑制剂”的200 µL细胞悬液中加入200 µL 2倍BSA溶液（步骤6.2中制备）。
      注意：请记住，在样本分析之间应考虑延迟时间，每隔x分钟加入刺激物，其中x为采集一个样本与下一个样本之间的延迟时间。
  16. 将细胞在37 °C、5% CO2条件下避光孵育30分钟。使用配备自动进样器的流式细胞仪，按照刺激顺序分析样本。使用初始补偿步骤期间生成的分析模板。分析前无需洗涤细胞。

7. 流式细胞术数据分析与预期结果

  1. 在流式细胞术软件中，打开先前生成的实验样本分析文件（分析模板在步骤6.7-6.12中生成，样本在步骤6.16中运行）。确保手动补偿过程中生成的补偿矩阵已正确应用于实验样本。
    注意：对于支持事后补偿的流式细胞仪及流式细胞术软件，如果补偿矩阵尚未应用于实验样本文件，则应在当前步骤中进行应用。
  2. 与验证手动补偿的正确性类似，需确保实验样本中的对照组表现符合预期。
    1. 确保“未染色、未处理”事件出现在FL1与FL2散点图的左下象限，“阳性诱导剂”处理的事件在FL1与FL2散点图的左上、右上和右下象限显示出增强的荧光信号，而“阳性诱导剂 + ROS抑制剂”处理的事件在上述三个象限中的荧光信号较“阳性诱导剂”样本有所降低。
    2. 如果实验样本中的对照组未显示任何荧光增强，应检查所有实验步骤是否均已正确执行，确认骨髓来源巨噬细胞（BMDM）的生成与预处理是否恰当（参见步骤2.7-2.19），并重复实验。若对照组结果符合预期，则继续分析经FcγR刺激的实验样本（图3A）。
  3. 验证FcγR特异性刺激是否有效。使用C57BL/6J野生型小鼠制备以下样本：“未染色、未刺激”、“染色、未刺激”、“染色、经FcγR刺激”以及“染色、经FcγR刺激 + ROS抑制剂”。这些样本分别对应第4节中的样本4.2a、4.2b、4.2e和4.2f。
    1. 确保“未染色、未刺激”事件出现在FL1与FL2散点图的左下象限，“染色、未刺激”事件也位于该图的左下象限，“染色、经FcγR刺激”事件在FL1与FL2散点图的左上、右上和右下象限显示出增强的荧光信号，而“染色、经FcγR刺激 + ROS抑制剂”事件在上述三个象限中的荧光信号较“染色、经FcγR刺激”样本有所减弱（图3A）。
    2. 若未达到上述预期，例如“染色、经FcγR刺激”样本相较于“染色、未刺激”样本未显示明显或无荧光增强，或“染色、未刺激”样本相较于“未染色、未刺激”样本已表现出显著升高的荧光水平，应检查所有实验步骤是否正确执行，确认BMDM的生成、预处理及操作是否得当（参见步骤2.7-2.19），并重复实验。若结果符合预期，则继续分析其余实验样本。
      注意：产生可与绿色探针反应的活性氧（如过氧化氢、过氧亚硝酸盐、羟基自由基、一氧化氮、过氧自由基等）的细胞将在对数FL1（X轴）对对数FL2（Y轴）的散点图中出现在右上和右下象限；产生可与橙色探针反应的活性氧（主要但不仅限于超氧阴离子）的细胞则出现在该散点图的两个上部象限。
  4. 针对目标细胞群体设置门控，分别生成FL1和FL2荧光的单个直方图。利用“未染色、未刺激”样本设置直方图门标，使所有“未染色、未刺激”事件均位于该门标左侧。将此带门标的图应用于其余实验样本（图3B）。
  5. 以各ROS探针阳性细胞的百分比形式呈现实验结果，或通过展示刺激样本相对于对照的平均荧光强度（MFI）进行表达（图3C）。

8. 细胞表面染色结合活性氧产生流式细胞术分析（可选）

注意：本步骤提供了一种在刺激 FcγR 并检测活性氧（ROS）之前，使用细胞表面标志物对巨噬细胞进行染色的方案。该方法可用于评估混合细胞群体中的 ROS 生成情况。选择与合适荧光染料偶联的巨噬细胞表面标志物抗体时，应确保其荧光信号不会干扰氧化应激或超氧阴离子检测试剂的荧光信号。在本方案中，使用与 Alexa Fluor 647 偶联的小鼠 F4/80 抗体。

  1. 按照前述方法（第1和第2节）制备、收获并预处理骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）。
    注意：为完成下述所有实验对照和处理条件，至少需要三块6 cm培养板。其中一块板在无血清培养时用抗BSA IgG1处理，另外两块板则不做处理。
    1. 每项实验需包含4个用于流式细胞术补偿的实验对照：
      a) 未染色且未刺激的细胞。
      b) 用氧化应激检测试剂（绿色试剂）和活性氧（ROS）诱导剂处理的细胞。
      c) 用超氧阴离子检测试剂（橙色试剂）和ROS诱导剂处理的细胞。
      d) 仅用偶联Alexa 647的抗小鼠F4/80抗体染色的细胞。
    2. 对每只小鼠或生物学重复，设置以下3种处理条件：
      a) 用F4/80染色且不进行刺激
      b) 用F4/80染色并通过FcγR激活
      c) 用F4/80染色并通过FcγR激活，同时用ROS抑制剂处理
  2. 巨噬细胞预处理过夜后，吸除上清液。用1–2 mL PBS洗涤细胞一次。通过更换为等体积的低血清DMEM培养基对细胞进行无血清培养。对每只小鼠，其中一块板在无血清培养期间用抗BSA IgG1处理，另外两块板则不做处理。将培养板在37 °C、5% CO2条件下孵育4小时。
  3. 无血清培养结束后，通过轻柔刮取或使用含0.2 mM EDTA的PBS收集细胞。将每块板的细胞分别收集至标记好的5 mL圆底离心管中，在750 ×g条件下离心5分钟。记录哪些细胞接受了小鼠抗BSA IgG1处理。
  4. 用1–2 mL PBS洗涤细胞沉淀一次，以去除经处理细胞中残留的抗BSA抗体。
  5. 将未接受抗BSA IgG1处理的培养板中的一个细胞沉淀重悬于600 µL低血清DMEM中。这些细胞将不进行细胞表面染色，仅用于补偿对照。将该细胞悬液分别取200 µL加入3个标记为a) 未染色未刺激、b) 绿色氧化应激试剂 + ROS诱导剂、c) 橙色超氧阴离子检测试剂 + ROS诱导剂的5 mL圆底离心管中。
  6. 将未接受抗BSA IgG1处理的培养板中的另一个细胞沉淀重悬于300 µL流式细胞术染色缓冲液（PBS + 0.1% FBS）中。将该细胞悬液分别取100 µL加入2个5 mL圆底离心管中，用于Alexa 647标记的抗小鼠F4/80抗体染色。
  7. 将接受抗BSA IgG1处理的培养板中的细胞沉淀重悬于300 µL流式细胞术染色缓冲液中。将该细胞悬液分别取100 µL加入2个5 mL圆底离心管中，用于Alexa 647标记的抗小鼠F4/80抗体染色。
  8. 对第8.6和8.7步分装的细胞，在冰上避光孵育30分钟，加入5 µL Alexa 647标记的抗小鼠F4/80抗体进行染色。
  9. 染色后，加入2 mL PBS洗涤细胞，在750 × g条件下离心，吸除上清液，再将每管细胞重悬于200 µL不含酚红的低血清DMEM中。保留一个未经处理的管作为单染FL4对照。按照第3.9、3.10、6.1、6.2和6.14节所述，准备探针、诱导剂、FcγR刺激物和ROS抑制剂。
    1. 对未接受抗BSA IgG1处理的细胞，标记管子为：a) 无刺激或 b) ROS诱导剂。
    2. 对接受抗BSA IgG1处理的细胞，标记管子为：a) Fc XL 或 b) Fc XL + 抑制剂。
  10. 根据第6.5–6.6节所述，对用于补偿的样本进行相应刺激处理，按照流式细胞仪读取顺序进行，并考虑各样本采集之间的延迟时间。
  11. 将细胞在37 °C、5% CO2条件下避光孵育30分钟。使用配备自动进样器的流式细胞仪，按刺激顺序分析样本。
  12. 按照第6.7–6.12节所述进行手动补偿，按照第7节所述进行数据分析。
  13. 使用流式细胞术软件，为“未染色未处理”、“绿色 + 诱导剂”、“橙色 + 诱导剂”和“F4/80染色”对照样本分别生成并标记4个样本文件，确保标明待分析的通道/参数（FSC、SSC、FL1、FL2、FL4）以及设定的终止条件（如100 µL、3分钟等）。
  14. 运行样本并生成散点图以进行手动补偿。
    1. 对于细胞表面染色，额外生成两张图：FL1（x轴）vs FL4（y轴）和FL2（x轴）vs FL4（y轴）。调节电压以确保正确应用补偿，如图7A所示。完成所有补偿后，将补偿矩阵应用于所有实验样本文件。
  15. 完成手动补偿并获得实验模板后，按照第6.13–6.15.3节所述开始处理实验样本，并按照第6.16节所述在流式细胞仪上采集数据。

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结果

根据所述实验方案，我们展示了通过流式细胞术检测野生型C57BL/6J小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）经FcγR刺激后活性氧（ROS）产生的代表性数据。如预期所示，未刺激细胞中FL1和FL2荧光信号相对于本底水平无明显变化（图3A，比较“染色、未刺激”与“未染色、未刺激”的散点图）。当细胞经FcγR交联剂刺激后，FL1和FL2荧光信号显著增强（图3A，比较“经Fc交联刺激并染色”样本与“染色、未刺激”散点图）。最后，若在FcγR交联刺激前用ROS抑制剂处理细胞，则荧光增强效应恢复至基础水平（图3A，比较“经ROS抑制剂处理并经Fc交联刺激”与“经Fc交联刺激并染色”的散点图）。该趋势在以各通道直方图形式展示数据时同样明显（图3B），或在以绿色或橙色ROS探针阳性细胞百分比形式展示时亦可清晰观察到（图3C）。当数据以平均荧光强度（MFI）表示时...

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讨论

基于 DCFH2-DA 和 DHE 的活性氧（ROS）检测是一种广泛应用的技术14,15。这些 ROS 探针操作简便，且适用于动力学微孔板检测、荧光显微镜或流式细胞术分析，因而广受欢迎。然而，在我们对 FcγR 介导的巨噬细胞功能的研究中，尚未见针对 FcγR 交联细胞进行流式细胞术分析的标准化实验方案。鉴于所检测分析物具有较高的反应活性，我们发现实验时间的控制对于确保结果的可重复性至关重要。尽管我们也曾开展动力学微孔板检测，但不同实验间荧光强度存在较大变异，导致生物学重复样本难以合并进行统计学分析。使用流式细胞术检测这些探针可定量“ROS 阳性”细胞，从而在一定程度上解决上述问题，但仍存在一些挑战。当使用配备自动进样器的流式细胞仪时，这一问题尤为突出。在此情况下，分析大量样本将影响细胞暴露于各种刺激物的时间。为减轻此影响，我们已在实验方案中纳入样本分析之间的滞后时间，以确保所有待分析细胞接受刺激的时间基本一致。

流式细胞术检测活性氧（ROS）...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢Tigno-Aranjuez实验室其他成员，包括Madelyn H. Miller、Omar Cardona、Andjie Jeudy和Roopin Singh，在实验室日常维护和小鼠品系保育方面提供的帮助。本研究得到了R00 HL122365基金以及J.T.T-A.启动资金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗BSA IgG1Innovative ResearchIBSA9E2C2
Alexa Fluor 647 大鼠IgG2b，κ 同型对照抗体BioLegend400626
抗小鼠CD16/32BioLegend101302
与Alexa Fluor 647偶联的抗小鼠F4/80抗体BD Biosciences565853
与FITC偶联的抗小鼠F4/80抗体BioLegend123108
与Alexa Fluor 647偶联的抗小鼠/人CD11b抗体 BioLegend101218
β-巯基乙醇（BME）SigmaM3148-100ml
牛血清白蛋白（BSA）第五组分FisherBP1600-100
C57BL/6J Jackson labsStock No.000664
CM-H2DCFDAMolecular ProbesC6827可作为Enzo试剂盒中氧化应激检测试剂的替代品
二氢乙啶（DHE）Molecular ProbesD11347可作为Enzo试剂盒中超氧阴离子检测试剂的替代品
DMEM 1xCorning10-013-CV
无酚红DMEMGibco31053-028
无水DMF Acros Organics61094-1000
胎牛血清（FBS）VWR97068-085
FITC标记的大鼠IgG2a，κ 同型对照抗体BioLegend400506
HEPES（1M）Gibco15630-080
L-谷氨酰胺Gibco25030-081
LADMAC细胞ATCCCRL-2420
MEMCorning10-010-CV
小鼠IFN-γGoldBio1360-06-100
N-乙酰-L-半胱氨酸EMD Milipore106425可作为Enzo试剂盒中活性氧抑制剂/清除剂的替代品
配备自动进样器的Novocyte流式细胞仪Acea2060R
绿脓菌素（ROS诱导剂）Cayman chemical10009594可作为Enzo试剂盒中诱导剂的替代品
ROS-ID总ROS/超氧阴离子检测试剂盒ENZOENZ-51010
丙酮酸钠（100 mM）Gibco11360-070
胰蛋白酶-EDTA（0.25%）Gibco25200-056

参考文献

  1. Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
  2. Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), R453-R462 (2014).
  3. Robinson, J. M. Reactive oxygen species in phagocytic leukocytes. Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 281-297 (2008).
  4. Thomas, D. C. The phagocyte respiratory burst: Historical perspectives and recent advances. Immunology Letters. 192, 88-96 (2017).
  5. Fang, F. C. Antimicrobial actions of reactive oxygen species. MBio. 2 (5), (2011).
  6. Iles, K. E., Forman, H. J. Macrophage signaling and respiratory burst. Immunologic Research. 26 (1-3), 95-105 (2002).
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  13. Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).
  14. Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).
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流式细胞术活性氧检测巨噬细胞活化Fcγ受体氧化应激检测荧光探针骨髓来源巨噬细胞补偿对照活性氧抑制剂绿脓菌素刺激
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