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方法文章

抑制 Aspergillus flavus 表达α-淀粉酶抑制剂的转基因玉米中的生长及黄曲霉毒素产生 Lablab purpureus L.

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DOI：

10.3791/59169

⸱

2019年2月15日

 ,  ,  ,  , 
1Southern Regional Research Center, USDA-ARS, Food and Feed Safety Research Unit, 2Department of Plant Pathology, University of Arkansas

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于分析表达抗真菌蛋白的玉米籽粒中Aspergillus flavus生长及黄曲霉毒素产生的实验方案。  利用表达GFP的A. flavus菌株，我们对真菌在成熟籽粒中的侵染与扩散过程进行了实时监测。该检测方法快速、可靠且可重复。

摘要

食品和饲料作物中的黄曲霉毒素污染是全球面临的一项重大挑战。黄曲霉毒素由真菌Aspergillus flavus（A. flavus）产生，是强效的致癌物，不仅严重威胁人类和动物健康，还会显著降低玉米及其他富含油脂的作物（如花生）的经济价值。目前正通过多种方法评估提高易感作物抗黄曲霉毒素能力的可行性，包括传统育种、抗性相关蛋白的转基因表达，以及基于RNA干扰（RNAi）的寄主诱导基因沉默技术，靶向沉默A. flavus的关键基因。以往研究表明，α-淀粉酶在A. flavus的致病过程及黄曲霉毒素生成中发挥重要作用，提示该基因/酶是同时抑制A. flavus生长和毒素产生的潜在靶点。基于此，本研究旨在评估在玉米中异源表达Lablab purpureus L. 的α-淀粉酶抑制剂样蛋白（AILP）（由组成型CaMV35S启动子驱动）对A. flavus的抑制效果。AILP是一种分子量为36 kDa的蛋白质，可竞争性抑制A. flavus的α-淀粉酶活性，属于普通菜豆中凝集素–arcelin–α-淀粉酶抑制剂蛋白家族。在本研究之前开展的体外实验已证实AILP能够抑制A. flavus的α-淀粉酶活性及真菌生长。本研究利用表达绿色荧光蛋白（GFP）的A. flavus菌株，实时监测成熟玉米籽粒中的真菌生长和黄曲霉毒素产生情况。这种籽粒筛选实验（KSA）操作简便，可提供可靠且可重复的感染程度及扩散范围数据，适用于种质资源和转基因品系的评价。GFP菌株发出的荧光强度与真菌生长密切相关，进而与黄曲霉毒素含量高度相关。  本研究的目标是将上述已有研究成果应用于玉米这一具有重要商业价值的作物中，以提高其对黄曲霉毒素的抗性。研究结果表明，在表达AILP的转基因玉米籽粒中，A. flavus的生长减少了35%–72%，相应地，黄曲霉毒素水平降低了62%–88%。

引言

真菌属引起的霉菌毒素污染， 曲霉属, 镰刀菌属, Penicillium，以及 链格孢属 是全球种植的粮食和饲料作物面临的主要问题1,2,3在这些植物病原真菌中， 曲霉属 对农作物价值以及人类和动物健康造成最严重的负面影响。 Aspergillus flavus (A. flavus是一种机会性植物病原菌，可侵染富含油脂的作物，如玉米、棉籽和花生，产生强致癌物黄曲霉毒素以及多种有毒的次级代谢产物（SMs）。玉米是一种在全球广泛种植的重要粮食和饲料作物，极易受到该病原菌的污染 A. flavus黄曲霉毒素污染对美国玉米造成的经济损失及价值下降每年可达6.866亿美元。2 随着全球气候变化的预测，黄曲霉毒素的影响可能导致玉米产业在未来不久面临高达每年16.8亿美元的更大经济损失2鉴于黄曲霉毒素对人类和牲畜造成的不良经济和健康影响，玉米收获前的黄曲霉毒素控制可能是预防食品和饲料产品中黄曲霉毒素污染的最有效方法。

过去几十年中，玉米抗黄曲霉毒素的主要采前控制方法主要依赖育种，但该方法需要耗费大量时间4。近年来，生物防控在大规模田间应用中已取得一定的黄曲霉毒素减控成效5,6。除生物防控外，应用前沿分子工具，如通过RNA干扰实现的“宿主诱导基因沉默”（HIGS）以及抗性相关蛋白的转基因表达，在小规模实验室和田间试验中也已在抑制A. flavus生长和黄曲霉毒素产生方面取得一定成效。目前，这些方法正在进一步优化，同时也在致力于鉴定新的潜在A. flavus基因靶点，以供未来调控利用。

除了可能作为转基因防控策略靶标的直接参与霉菌毒素合成的基因外，真菌淀粉酶也被证明在寄主植物感染早期维持成功致病性和霉菌毒素产生过程中发挥关键作用。一些实例包括引起生姜根茎腐烂病的Pythium pleroticum和引起花椰菜枯萎病的Fusarium solani，在这些病原菌中观察到致病性与α-淀粉酶的表达及活性之间存在正相关关系7,8。通过基因敲除或基因沉默手段抑制α-淀粉酶活性会负面影响真菌的生长和毒素产生。在淀粉培养基或去胚玉米籽粒上培养时，A. flavus的α-淀粉酶基因敲除突变体无法产生黄曲霉毒素9。类似地，在Fusarium verticillioides中，α-淀粉酶基因敲除菌株在侵染玉米籽粒期间无法产生伏马菌素B1（霉菌毒素）10。在一项较新的研究中，Gilbert等（2018年）证明，通过HIGS技术基于RNAi沉默A. flavus的α-淀粉酶表达，可显著降低A. flavus在玉米籽粒侵染过程中的菌体生长和黄曲霉毒素的产生11。

α-淀粉酶活性的特异性抑制剂也产生了与下调α-淀粉酶表达相似的结果。关于α-淀粉酶抑制剂在真菌抗性中作用的首篇报道来自对一种14-kDa胰蛋白酶-α-淀粉酶抑制剂的分离和表征，该抑制剂来源于对黄曲霉（A. flavus）具有抗性的玉米品系12。Fakhoury和Woloshuk进一步筛选了数百种植物物种，从中鉴定了来自扁豆（Lablab purpureus L.）种子的一种36-kDa的α-淀粉酶抑制剂样蛋白（AILP）13。AILP的肽序列与在普通菜豆中报道的凝集素–arcelin–α-淀粉酶抑制剂家族的凝集素相似14,15。纯化的AILP对哺乳动物胰蛋白酶无任何抑制活性，进一步的体外表征显示其可显著抑制黄曲霉（A. flavus）的生长及分生孢子萌发13。本文所综述的研究结果明确表明，α-淀粉酶可作为防控策略中的靶标，用于限制那些在与寄主植物的致病互作过程中依赖淀粉动员（通过α-淀粉酶活性）和可溶性糖获取作为能源的病原体或害虫。

已知α-淀粉酶在黄曲霉（A. flavus）的致病性中起关键作用9,10,11，鉴于AILP作为一种强效抗黄曲霉（A. flavus）因子（通过抑制α-淀粉酶活性及抑制生长）的重要性13，我们构建了在组成型CaMV 35S启动子驱动下表达扁豆AILP基因的转基因玉米植株。研究目的是探讨在玉米中异源表达该α-淀粉酶抑制剂是否能够有效抑制黄曲霉（A. flavus）对玉米籽粒的侵染及其黄曲霉毒素的产生。我们的结果表明，在籽粒侵染过程中，表达AILP的转基因玉米籽粒显著抑制了黄曲霉（A. flavus）的生长及其黄曲霉毒素的产生。

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方案

1. 质粒构建与玉米转化

  1. PCR 扩增扁豆 AILP 使用引物 5’-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3’ 和 5'-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3’ 进行扩增。PCR 反应条件包括：98 °C 预变性 30 s（步骤 1），随后进行 98 °C 变性 10 s（步骤 2）、55 °C 退火 30 s（步骤 3）、72 °C 延伸 20 s（步骤 4），步骤 2 至步骤 4 循环 31 次，最后在 72 °C 延伸 5 min。将 PCR 产物克隆至经修饰的 pCAMBIA 1,300 载体中 Xba我与 PstI 限制性酶切位点。对最终的植物目的载体进行测序，以确认克隆片段的方向和序列准确性 AILP 载体中的基因
  2. 转化 农杆菌 菌株 EHA101 携带最终的载体构建体（图1如前所述 16.
  3. 使用转化后的 农杆菌 包含用于转化未成熟玉米的最终植物目的载体玉米（Zea mays） L. Hi-II）胚胎（在爱荷华州立大学植物转化中心完成） 16.
  4. 培养 T0 温室中种植的植株（26–29 °C；16/8 小时光照周期，辅以高压钠灯），并反复自花授粉以获得 T6 通过多代培育以获得转基因性状的纯合子。

2. 孢子萌发实验

  1. 采集叶片样品并置于 -80 °C 保存。使用液氮将叶片样品在研钵中研磨。称取 0.5 g 样品放入 2 mL 微量离心管中，加入 17 µL 蛋白酶抑制剂，并将离心管置于冰上。
  2. 在 16,000 x g 条件下离心 10 分钟。将 225 µL 植物提取液转移至 0.5 mL 微量离心管中，并置于冰上。
  3. 在 15 mL 离心管中，用 1% 马铃薯葡萄糖肉汤（w/v）配制 5 mL 的 Aspergillus flavus 70 – GFP 孢子悬浮液。涡旋混匀，并使用血细胞计数板将孢子浓度调整至 105 个孢子/mL。
    注意：A. flavus 可产生黄曲霉毒素，所有操作均应在生物安全柜中进行。
  4. 在 28 °C 的 PDB 中培养，直至孢子萌发率达到 50%（以孢子膨胀为标志）。
  5. 涡旋混匀后，取 25 µL 孢子溶液加入 225 µL 植物提取液中。在 28 °C 下孵育 20 小时，期间间歇性振荡。
  6. 取 25 µL 孢子溶液滴于显微镜载玻片上，使用数码相机软件测量孢子萌发管的长度。每组至少进行 20 次重复测量。
    注意：此步骤后，应将所有培养物置于 4 °C 以终止菌落生长，待计数时再取出。

3. 芯片筛选实验（KSA）

  1. 在60 × 15 mm的培养皿中，用胶水将4个扣盖（22 mm）粘合成KSA盖。使用前让胶水干燥48小时。每个KSA盖构成一个重复（图2）。
  2. 在无菌生物安全柜中，用70%乙醇:H2O（v/v）喷洒方形生物测定盘（24 cm × 24 cm），并让其自然晾干。向盘中加入无菌层析滤纸。将9个KSA盖用70%乙醇喷洒，晾干后放入生物测定盘中。
  3. 对每种待测的转基因玉米品系，选取20粒无损伤的籽粒，放入50 mL离心管中。加入70%乙醇，静置4分钟。在消毒过程中轻轻振荡离心管。倒去乙醇，并用无菌去离子H2O冲洗籽粒三次。
  4. 从V8培养基（5% V8果汁，2%琼脂，pH 5.2）上培养6天的Aspergillus flavus 70 – GFP17菌落制备孢子悬浮液。
    1. 加入20 mL无菌0.02% Triton X-100/去离子H2O（v/v），用无菌接种环刮下孢子。用移液器吸取接种液，转移至300 mL无菌烧杯中。
    2. 用0.02% Triton X-100进行5倍稀释，然后使用血细胞计数板进行孢子计数。如有必要，再次稀释，最终获得100 mL浓度为4 × 106 孢子/mL的悬浮液。
  5. 将籽粒放入含搅拌子的无菌300 mL烧杯中，加入接种液。
    注意：将籽粒加入接种液可能导致液体飞溅。将烧杯置于搅拌器上搅拌3分钟。3分钟后，将接种液倒入空烧杯中。
  6. 用镊子将籽粒放入生物测定盘中（每盖1粒籽粒）。在每个生物测定盘底部加入30 mL去离子水，于31 °C黑暗条件下培养7天。
  7. 准备籽粒用于拍照。
    1. 从每个品系中预留4粒籽粒用于显微分析和拍照。
      注意：完成拍照前，籽粒可在4 °C保存，但不得超过5天。
    2. 接种A. flavus七天后对籽粒进行拍照（图3）。
    3. 用柔软纸巾和去离子水清洁籽粒外部，对籽粒进行纵向切片，并立即在荧光显微镜下拍照。
  8. 准备籽粒用于分析。
    1. 用柔软纸巾和去离子水清洁剩余籽粒的外部。
    2. 将4粒籽粒（构成1个重复）放入含2个不锈钢珠的15 mL螺口聚碳酸酯瓶中。立即用液氮速冻样品瓶，并在-80 °C保存，直至进一步处理和分析。
    3. 从-80 °C冰箱中取出样品瓶，在均质器中以1,500 rpm研磨3分钟。
      注意：研磨过程中需用液氮保持籽粒处于冷冻状态。

4. 转基因玉米籽粒的PCR筛选

  1. 根据试剂盒说明书，使用DNA提取试剂盒从被A. flavus感染的玉米籽粒粉末中提取基因组DNA（gDNA）。简言之，向10–15 mg玉米籽粒粉末中加入280 µL缓冲液F、20 µL蛋白酶和3 µL二硫苏糖醇（DTT）。在恒温混匀仪中孵育并振荡（56 °C，1,200 rpm，30 min）。以10,000 × g离心1 min，将澄清上清液转移至平衡过的纯化柱中。室温孵育3 min，再以700 × g离心1 min以洗脱gDNA。
  2. 取0.8 µL提取的gDNA，使用PCR试剂盒为每个样本配制20 µL的PCR反应体系。按照试剂盒说明书推荐的热循环条件进行扩增。PCR程序包括：98 °C初始变性5 min（步骤1）；随后进行40个循环，每个循环包括98 °C变性5 s（步骤2）、55 °C退火5 s（步骤3）和72 °C延伸20 s（步骤4）；最后在72 °C延伸1 min（步骤5）。
  3. 使用正向引物5’-TATACCACCCCCATCCGTGT-3’和反向引物5’-AGCTCGGAAGCAAAAGACCA-3’，检测转基因玉米籽粒中是否存在Lablab AILP基因。

5. RNA 提取、cDNA 合成及半定量 RT-PCR

  1. 取匀浆样本 A. flavus -80°C 保存的感病玉米籽粒，用于RNA提取。按照试剂盒说明书使用总RNA提取试剂盒提取RNA，但略有修改18加入50 mg均质化的玉米籽粒粉末至提取缓冲液后，使用1 mL移液器枪头充分混匀（勿涡旋），冰上静置5-6分钟，随后按照试剂盒生产商提供的说明书进行后续步骤。
  2. 使用cDNA合成试剂盒，按照制造商提供的说明书制备cDNA 18.
  3. 每次半定量 RT-PCR 反应使用 0.5 µL 未稀释的 cDNA，具体操作如前所述18使用上游引物 qAILP-F 5’-TCCCAACAAGGCAACTACTG-3’ 和下游引物 qAILP-R 5’-CGGTGTCGAAGAGACCTAGATA-3’ 分别检测 Lablab AILP 基因表达，以及用于玉米核糖体结构基因（Rib），GRMZM2G024838 表达检测的正向引物 qRib-F 5ʹ-GGCTTGGCTTAAAGGAAGGT-3ʹ 和反向引物 qRib-R 5ʹ-TCAGTCCAACTTCCAGAATGG-3ʹ19 作为看家基因。

6. GFP 定量分析

  1. 分别准备50 mL的0.2 M磷酸二氢钠（NaH₂PO₄）溶液和0.2 M磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）溶液2PO4）和 0.2 M 磷酸氢二钠（Na2HPO4·7H2去离子水中的 O)2O.
  2. 配制 100 mL pH 7.0 的 Sorenson 磷酸盐缓冲液。对于 pH 7.0，加入 19.5 mL NaH2PO4 储备液，30.5 mL NaHPO4·7H2O型血库存，以及50 mL去离子水2O.
  3. 称取25 mg研磨后的胚乳材料（鲜重，FW），置于1.0 mL微量离心管中。向离心管中加入500 µL磷酸盐缓冲液，涡旋振荡30 s。
  4. 将样品在16,000 x g条件下离心15分钟 g用移液器将100 µL上清液加入黑色96孔板中。使用荧光计读取样品（激发波长485 nm，发射波长528 nm）。

7. 总黄曲霉毒素分析

  1. 样品处理与黄曲霉毒素提取
    1. 将干燥的籽粒样品置于60 °C的强制通风烘箱中烘干2天。称取样品重量，并放入带玻璃塞的50 mL锥形瓶中。
    2. 在通风橱中，向每个烧瓶中加入25 mL二氯甲烷。
      警告：二氯甲烷具有高度挥发性，被视为有害物质（刺激性，致癌物）。 处理二氯甲烷时，乳胶或丁腈手套均不安全。应使用改进型耐有机溶剂的聚乙烯醇（PolyVinylAlcohol）手套。
    3. 将样品在腕式振荡器上振荡30分钟。30分钟后，将提取液缓慢倒入装有褶皱滤纸的80 mL烧杯中。让烧杯在通风橱中过夜干燥。
    4. 第二天，将二氯甲烷（约5 mL）冲洗干烧杯内壁，旋转混匀后倒入2 dram玻璃小瓶中。将小瓶敞口置于通风橱中过夜干燥。
  2. 黄曲霉毒素分析
    1. 加入 4.0 mL 80% 甲醇：去离子水2O (v/v) 加入小瓶中。
    2. 使用黄曲霉毒素提取试剂盒，利用所提供的层析柱过滤并纯化甲醇溶液。根据制造商说明书，采用荧光计分析总黄曲霉毒素含量。

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结果

玉米转化及转基因植株的分子筛选

玉米Hi-II品系的未成熟胚通过以下方法进行转化： Agrobacterium tumefaciens 表达目的植物载体的EHA101菌株 Lablab purpureus AILP 在花椰菜花叶病毒（CaMV）启动子控制下的基因 35S 启动子。五个独立转化的玉米株系被推进至T6代以进行后续研究。与同基因型阴性对照植株相比，转基因玉米植株明显更矮小且长势较弱，但未表现出其他异常。对目标片段进行PCR扩增 AILP 基因显示出一个548 bp的扩增片段，该片段仅在转基因玉米品系中观察到，而在对照植株中未出现（图4A）。该 AILP 基因在转基因株系中表现出表达，而在非转基因株系中未检测到表达 AILP 在...

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讨论

由于病原体和害虫导致农作物减产是一个全球性问题20。目前，施用合成杀菌剂和杀虫剂是控制植物病原体和害虫的主要手段，但这些生化物质在食品和饲料中的残留毒性可能对人类和动物健康构成严重威胁21。鉴于玉米作为粮食和饲料作物的重要经济价值，降低或消除黄曲霉毒素污染至关重要2,3,22。通过将抗性基因导入感病品种进行常规育种是一个耗时较长的过程，且此类抗性并不总是稳定，因为黄曲霉毒素抗性属于多基因性状，参与基因的表达会随着环境参数的变化而显著改变4。目前正评估一些替代方法，以期以环境友好的方式增强并稳定玉米对A. flavus的寄主防御能力。

在本研究中，我们选择评估豇豆中AILP基因在玉米中对抗A. flavus

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致谢

感谢阿肯色大学的 David Meints 在早期世代转基因玉米的开发与分析工作中提供的帮助。本工作获得了美国农业部农业研究局（USDA-ARS）CRIS 项目 6054-42000-025-00D 的资金支持。本文中提及的商业名称或产品仅用于提供具体信息，不构成美国农业部的推荐或认可。美国农业部农业研究局的平等就业机会（EEO）政策要求对所有人提供平等机会，并禁止在该机构人事政策、实践和运作的各个方面存在任何形式的歧视。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂Caisson
Amazing Marine GoopEclectic Products
C1000 Touch CFX96 实时系统Bio-Rad
Corning Falcon 组织培养皿，60 mmFisher Scientific08-772F
Eppendorf 5424 微型离心机Fisher Scientific
带塞锥形瓶，50 mLAce Glass6999-10
乙醇
FluoroQuant AflaRomer LabsCOKFA1010
定性褶皱滤纸圆片，15 cmFisher Scientific09-790-14E
鼓风干燥箱VWR
FQ-ReaderRomer LabsEQFFM3010
Geno/Grinder 2010OPS DiagnosticsSP 2010-115
改进型聚乙烯醇耐有机溶剂手套Ansell012-15-554
Innova 44 恒温摇床Brunswick Scientific
iScript cDNA 合成试剂盒Bio-Rad1708890
液氮
低型 Griffin 烧杯，100 mLDKW Life Sciences14000-100
甲醇
二氯甲烷
Nexttec 植物一步法 DNA 提取试剂盒Nexttec47N
配备 Nikon DS-Qi1 相机的 Nikon Eclipse E600 显微镜Nikon
配备 C-HGFI 反射照明器和 Andor Zyla 4.2 sCMOS 相机的 Nikon SMZ25 体视显微镜Nikon
Nunc 方形生物检测培养皿ThermoFisher Scientific240835
Phire 植物直接 PCR 试剂盒ThermoFisher ScientificF130WH
聚碳酸酯样品瓶，15 mlOPS DiagnosticsPCRV 15-100-23
马铃薯葡萄糖肉汤
旋盖，22 mmDKW Life Sciences242612
磷酸氢二钠七水合物Sigma-Aldrich
磷酸二氢钠Sigma-Aldrich
Spectrum 植物总 RNA 提取试剂盒Sigma-AldrichSTRN50
不锈钢研磨珠，3/8''OPS DiagnosticsGBSS 375-1000-02
磁力搅拌器
Synergy 4 荧光计Biotek
T100 梯度PCR仪Bio-Rad
Triton X-100Sigma-AldrichT-9284
V8 果汁Campbell's
Whatman 定性滤纸平张，3号Fisher Scientific09-820P
手腕式振荡器Burrell Scientific

参考文献

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