抑制 Aspergillus flavus 表达α-淀粉酶抑制剂的转基因玉米中的生长及黄曲霉毒素产生 Lablab purpureus L.

摘要

本文介绍了一种用于分析表达抗真菌蛋白的玉米籽粒中Aspergillus flavus生长及黄曲霉毒素产生的实验方案。  利用表达GFP的A. flavus菌株，我们对真菌在成熟籽粒中的侵染与扩散过程进行了实时监测。该检测方法快速、可靠且可重复。

摘要

食品和饲料作物中的黄曲霉毒素污染是全球面临的一项重大挑战。黄曲霉毒素由真菌Aspergillus flavus（A. flavus）产生，是强效的致癌物，不仅严重威胁人类和动物健康，还会显著降低玉米及其他富含油脂的作物（如花生）的经济价值。目前正通过多种方法评估提高易感作物抗黄曲霉毒素能力的可行性，包括传统育种、抗性相关蛋白的转基因表达，以及基于RNA干扰（RNAi）的寄主诱导基因沉默技术，靶向沉默A. flavus的关键基因。以往研究表明，α-淀粉酶在A. flavus的致病过程及黄曲霉毒素生成中发挥重要作用，提示该基因/酶是同时抑制A. flavus生长和毒素产生的潜在靶点。基于此，本研究旨在评估在玉米中异源表达Lablab purpureus L. 的α-淀粉酶抑制剂样蛋白（AILP）（由组成型CaMV35S启动子驱动）对A. flavus的抑制效果。AILP是一种分子量为36 kDa的蛋白质，可竞争性抑制A. flavus的α-淀粉酶活性，属于普通菜豆中凝集素–arcelin–α-淀粉酶抑制剂蛋白家族。在本研究之前开展的体外实验已证实AILP能够抑制A. flavus的α-淀粉酶活性及真菌生长。本研究利用表达绿色荧光蛋白（GFP）的A. flavus菌株，实时监测成熟玉米籽粒中的真菌生长和黄曲霉毒素产生情况。这种籽粒筛选实验（KSA）操作简便，可提供可靠且可重复的感染程度及扩散范围数据，适用于种质资源和转基因品系的评价。GFP菌株发出的荧光强度与真菌生长密切相关，进而与黄曲霉毒素含量高度相关。  本研究的目标是将上述已有研究成果应用于玉米这一具有重要商业价值的作物中，以提高其对黄曲霉毒素的抗性。研究结果表明，在表达AILP的转基因玉米籽粒中，A. flavus的生长减少了35%–72%，相应地，黄曲霉毒素水平降低了62%–88%。

引言

真菌属引起的霉菌毒素污染， 曲霉属, 镰刀菌属, Penicillium，以及 链格孢属 是全球种植的粮食和饲料作物面临的主要问题^1,2,3在这些植物病原真菌中， 曲霉属 对农作物价值以及人类和动物健康造成最严重的负面影响。 Aspergillus flavus (A. flavus是一种机会性植物病原菌，可侵染富含油脂的作物，如玉米、棉籽和花生，产生强致癌物黄曲霉毒素以及多种有毒的次级代谢产物（SMs）。玉米是一种在全球广泛种植的重要粮食和饲料作物，极易受到该病原菌的污染 A. flavus黄曲霉毒素污染对美国玉米造成的经济损失及价值下降每年可达6.866亿美元。² 随着全球气候变化的预测，黄曲霉毒素的影响可能导致玉米产业在未来不久面临高达每年16.8亿美元的更大经济损失²鉴于黄曲霉毒素对人类和牲畜造成的不良经济和健康影响，玉米收获前的黄曲霉毒素控制可能是预防食品和饲料产品中黄曲霉毒素污染的最有效方法。

过去几十年中，玉米抗黄曲霉毒素的主要采前控制方法主....

方案

1. 质粒构建与玉米转化

1. PCR 扩增扁豆 AILP 使用引物 5’-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3’ 和 5'-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3’ 进行扩增。PCR 反应条件包括：98 °C 预变性 30 s（步骤 1），随后进行 98 °C 变性 10 s（步骤 2）、55 °C 退火 30 s（步骤 3）、72 °C 延伸 20 s（步骤 4），步骤 2 至步骤 4 循环 31 次，最后在 72 °C 延伸 5 min。将 PCR 产物克隆至经修饰的 pCAMBIA 1,300 载体中 Xba我与 PstI 限制性酶切位点。对最终的植物目的载体进行测序，以确认克隆片段的方向和序列准确性 AILP 载体中的基因
2. 转化 农杆菌 菌株 EHA101 携带最终的载体构建体（图1如前所述 ¹⁶.
3. 使用转化后的 农杆菌 包含用于转化未成熟玉米的最终植物目的载体玉米（Zea mays） L. Hi-II）胚胎（在爱荷华州立大学植物转化中心完成） ¹⁶.
4. 培养 T₀ 温室中种植的植株（26–29....

结果

玉米转化及转基因植株的分子筛选

玉米Hi-II品系的未成熟胚通过以下方法进行转化： Agrobacterium tumefaciens 表达目的植物载体的EHA101菌株 Lablab purpureus AILP 在花椰菜花叶病毒（CaMV）启动子控制下的基因 35S 启动子。五个独立转化的玉米株系被推进至T6代以进行后续研究。与同基因型阴性对照植株相比，转基因玉米植株明显更矮小且长势较弱，但未表现出其他异常。对目标片段进行PCR扩增 AILP 基因显示出一个548 bp的扩增片段，该片段仅在转基因玉米品系中观察到，而在对照植株中未出现（图4A）。该 AILP 基因在转基因株系中表现出表达，而在非转基因株系中未检测到表达 AILP 在.......

讨论

由于病原体和害虫导致农作物减产是一个全球性问题²⁰。目前，施用合成杀菌剂和杀虫剂是控制植物病原体和害虫的主要手段，但这些生化物质在食品和饲料中的残留毒性可能对人类和动物健康构成严重威胁²¹。鉴于玉米作为粮食和饲料作物的重要经济价值，降低或消除黄曲霉毒素污染至关重要^2,3,22。通过将抗性基因导入感病品种进行常规育种是一个耗时较长的过程，且此类抗性并不总是稳定，因为黄曲霉毒素抗性属于多基因性状，参与基因的表达会随着环境参数的变化而显著改变⁴。目前正评估一些替代方法，以期以环境友好的方式增强并稳定玉米对A. flavus的寄主防御能力。

在本研究中，我们选择评估豇豆中AILP基因在玉米中对抗A. flavus

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂	Caisson
Amazing Marine Goop	Eclectic Products
C1000 Touch CFX96 实时系统	Bio-Rad
Corning Falcon 组织培养皿，60 mm	Fisher Scientific	08-772F
Eppendorf 5424 微型离心机	Fisher Scientific
带塞锥形瓶，50 mL	Ace Glass	6999-10
乙醇
FluoroQuant Afla	Romer Labs	COKFA1010
定性褶皱滤纸圆片，15 cm	Fisher Scientific	09-790-14E
鼓风干燥箱	VWR
FQ-Reader	Romer Labs	EQFFM3010
Geno/Grinder 2010	OPS Diagnostics	SP 2010-115
改进型聚乙烯醇耐有机溶剂手套	Ansell	012-15-554
Innova 44 恒温摇床	Brunswick Scientific
iScript cDNA 合成试剂盒	Bio-Rad	1708890
液氮
低型 Griffin 烧杯，100 mL	DKW Life Sciences	14000-100
甲醇
二氯甲烷
Nexttec 植物一步法 DNA 提取试剂盒	Nexttec	47N
配备 Nikon DS-Qi1 相机的 Nikon Eclipse E600 显微镜	Nikon
配备 C-HGFI 反射照明器和 Andor Zyla 4.2 sCMOS 相机的 Nikon SMZ25 体视显微镜	Nikon
Nunc 方形生物检测培养皿	ThermoFisher Scientific	240835
Phire 植物直接 PCR 试剂盒	ThermoFisher Scientific	F130WH
聚碳酸酯样品瓶，15 ml	OPS Diagnostics	PCRV 15-100-23
马铃薯葡萄糖肉汤
旋盖，22 mm	DKW Life Sciences	242612
磷酸氢二钠七水合物	Sigma-Aldrich
磷酸二氢钠	Sigma-Aldrich
Spectrum 植物总 RNA 提取试剂盒	Sigma-Aldrich	STRN50
不锈钢研磨珠，3/8''	OPS Diagnostics	GBSS 375-1000-02
磁力搅拌器
Synergy 4 荧光计	Biotek
T100 梯度PCR仪	Bio-Rad
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-9284
V8 果汁	Campbell's
Whatman 定性滤纸平张，3号	Fisher Scientific	09-820P
手腕式振荡器	Burrell Scientific