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方法文章

体内与体外实验用骨疏康颗粒（GSK）的制备

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DOI：

10.3791/59171

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2019年5月9日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Spine Institute, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education, 4School of Rehabilitation Science, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

本文内容

摘要

本文提供了一种用于动物实验的骨疏康颗粒工作溶液以及用于体外实验的含骨疏康颗粒血清的详细制备方案。该方案可应用于中药及其复方在体内和体外药理研究中的相关实验。

摘要

传统中药作为治疗多种疾病的替代方法，具有重要作用，例如用于治疗绝经后骨质疏松症（POP）。骨疏康（GSK）颗粒是中国已上市的处方药，具有防治POP的护骨作用。在给药前，通常需要进行标准制备处理，以促进药材中活性成分的释放，并增强其药理作用和治疗效果。本研究提出了一套详细的实验方案，用于在体外和体内实验中使用GSK颗粒。作者首先提供了适用于动物实验的颗粒剂剂量计算及配制方法，包括称量、溶解、储存和给药等步骤。其次，本文描述了微计算机断层扫描（micro-CT）及骨参数测量的实验流程，评估了样本制备、micro-CT仪器操作以及骨参数定量分析的具体方法。第三，制备含GSK颗粒的血清，并提取含药血清用于体外破骨细胞和成骨细胞分化实验。GSK颗粒以每日两次的频率经口灌胃给予大鼠，连续给药三天。随后采集血液，经离心、灭活和过滤处理。最后将血清稀释，用于破骨细胞生成和成骨细胞生成实验。本文所述方案可为中药复方制剂（如颗粒剂）的药理学研究提供参考依据。

引言

中药（Traditional Chinese Medicine, TCM）是治疗骨质疏松症的重要补充和替代疗法之一1,2。水煎剂是中药方剂最基本且最常用的剂型3。然而，其存在诸多缺点：口感差、携带不便、保质期短以及制备工艺不统一，这些因素限制了其应用及疗效发挥。为克服上述弊端并追求更佳疗效，中药颗粒剂应运而生，并已得到广泛应用4。尽管已有大量研究探讨了颗粒剂中一种或多种有效成分的药理机制5,6,7，但其确切的作用机制及潜在的药理过程仍难以明确。其原因在于，单一种颗粒剂中含有过多的有效成分，可能同时产生相似或相互拮抗的作用4。因此，在将颗粒剂给予机体之前建立统一的标准制备方案，不仅对治疗效果具有重要影响，也是开展体内和体外实验所必需的前提条件。

此外，颗粒剂在临床中的治疗效果难以通过体外或离体研究进行确切验证和精确识别，这带来了挑战，因为其药理机制过于复杂。为解决这一问题，Tashino 于20世纪80年代首次提出了含药血清的制备方法8。自此以后，众多研究人员将含药血清应用于包括颗粒剂在内的中药研究9,10,11。目前，在体外研究中选用含药血清被认为是一种能够较好模拟生理条件的策略。

根据中医理论指导下的临床实践，开发了骨疏康（GSK）颗粒用于治疗绝经后骨质疏松症（POP）。GSK颗粒在体内可防止卵巢切除术（OVX）小鼠的骨量丢失，抑制破骨细胞介导的骨吸收，并促进成骨细胞的骨形成4。因此，Li 等人12发现，GSK颗粒可通过增强钙敏感受体活性以促进骨形成，从而在OVX小鼠中发挥骨保护作用。为验证GSK颗粒的骨保护作用及其药理效应，本文作者提供了一套制备工作溶液及含药血清（GSK颗粒）的详细操作流程。此外，本文还描述了GSK颗粒在OVX诱导的骨质疏松小鼠模型中的应用，以及含GSK颗粒血清在体外破骨细胞/成骨细胞分化实验中的使用方法。

GSK颗粒由多种草药组成13,14，可轻易完全溶解于生理盐水中，因此以生理盐水作为溶剂。假手术小鼠（Sham）和卵巢切除小鼠（OVX）给予与颗粒给药组小鼠相同体积的生理盐水。小鼠GSK颗粒的等效剂量根据Meeh-Rubner方程15计算得出。该方程不仅有助于获得安全的剂量，还能确保药理效应15。GSK颗粒设置三个剂量组，具体如下：（1）GSKL：OVX + 低剂量GSK颗粒，2 g/kg/天；（2）GSKM：OVX + 中剂量GSK颗粒，4 g/kg/天；（3）GSKH：OVX + 高剂量GSK颗粒，8 g/kg/天。GSKL、GSKM和GSKH组小鼠通过灌胃给予GSK颗粒。以碳酸钙（600 mg/片）联合维生素D3（125 国际单位/片）作为阳性对照，例如一种已成熟上市的产品（如Caltrate [CAL]），用于骨质疏松症的治疗和预防。

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方案

所有实验操作均经上海中医药大学机构动物护理和使用委员会批准（SZY201604005）。

1. GSK 工作溶液的制备与给药

  1. 计算小鼠GSK颗粒的等效剂量。
    1. 根据Meeh-Rubner公式15计算体表面积：体表面积 = K × (体重2/3)/1000，其中人的K值为10.6，小鼠为9.1。假设人体重为70 kg，则人体表面积（m2）= 10.6 × (702/3)/1000 = 1.8 m2。假设小鼠体重为20 g（0.02 kg；例如，1月龄雌性C57/BL6小鼠），则小鼠体表面积（m2）= 9.1 × (0.022/3)/1000 = 0.0067 m2。
    2. 根据计算出的体表面积，计算人与小鼠之间的体表面积换算系数。人：70 kg / 1.8 m2 = 39。小鼠：0.02 kg / 0.0067 m2 = 3。GSK颗粒 = 20 g / 70 kg × 39 / 3 = 3.72 g/kg ≈ 4 g/kg。
    3. 根据每只小鼠体重20 g，计算小鼠的等效剂量：4 g/kg × 0.02 kg = 0.08 g。
    4. 根据每组20只小鼠、干预持续3个月（90天）的实验设计，计算三种等效剂量的GSK颗粒总量：（1）GSKL（OVX + 低剂量GSK颗粒[2 g/kg/天]）：0.04 g/小鼠/天 × 20只小鼠 × 90天 = 72 g。（2）GSKM（OVX + 中剂量GSK颗粒[4 g/kg/天]）：0.08 g/小鼠/天 × 20只小鼠 × 90天 = 144 g。（3）GSKH（OVX + 高剂量GSK颗粒[8 g/kg/天]）：0.12 g/小鼠/天 × 20只小鼠 × 90天 = 216 g。
      注：实际操作中应额外准备20%的GSK颗粒以弥补损耗。
  2. 根据体重计算每只小鼠GSK颗粒的给药体积15：例如，体积（V）= 0.24 mL/小鼠/天。
    注：小鼠灌胃给药的标准体积为0.12 mL/10 g体重。
  3. 称取可供10天使用的三种剂量的GSK颗粒，分别称取8 g、16 g和24 g，作为GSKL、GSKM和GSKH。
  4. 根据Meeh-Rubner公式15，参照步骤1.1.1和1.1.2的方法，计算碳酸钙与维生素D3（CAL）在小鼠中的等效剂量：CAL剂量 = 2片 / 70 kg × 39 / 3 = 0.372片/kg ≈ 0.4片/kg。
  5. 根据每只小鼠体重20 g（例如，1月龄雌性C57/BL6小鼠），计算小鼠的CAL等效剂量：0.4片/kg × 0.02 kg = 0.008片。再根据每组20只小鼠、干预持续3个月（90天）的实验设计，计算所需CAL总量：0.008片 × 20 × 90 = 14.4片。称取可供10天使用的CAL量（1.6片）。
  6. 溶解
    1. 将8 g GSK颗粒放入50 mL离心管中，加入48 mL生理盐水，振荡混匀至完全溶解。
      注：完全溶解的标准是无沉淀残留。可通过灌胃针吸取工作液并顺利排出进一步确认是否完全溶解。
    2. 分别用16 g和24 g GSK颗粒重复步骤1.5.1。
    3. 将1.6片CAL（10天用量）放入50 mL离心管中，加入48 mL生理盐水，振荡混匀至完全溶解。
      注：工作液可在-4 °C保存，每10天配制一次。
  7. 灌胃给药
    1. 用手抓住小鼠背部（1月龄雌性C57/BL6小鼠），使小鼠朝前，并确保其保持稳定姿势。给药前让小鼠保持安静状态2–3分钟。
      注：确保研究人员能清晰看到小鼠正面。建议佩戴手套以防被咬伤，尤其是新手研究人员。
    2. 将灌胃针（规格：#12，40 mm）插入GSK颗粒工作液中，吸取0.24 mL工作液。
    3. 将灌胃针从一侧口角插入小鼠口腔，直至进入胃部。
      注：确认灌胃针已进入胃内的方法：（1）灌胃针遇到阻力感，同时小鼠在针通过食管生理狭窄处前出现吞咽动作。（2）注入约0.5 mL工作液后观察1分钟，若无液体从口鼻溢出，则表明灌胃针已进入胃内。
    4. 将GSK颗粒工作液（0.24 mL/小鼠）注入胃内，然后拔出灌胃针，将小鼠放回笼中。
    5. 使用CAL溶液重复步骤1.6.4，每只小鼠注射0.24 mL CAL溶液。
      注：CAL溶液的给药体积按步骤1.2计算得出。

2. 微型计算机断层扫描

  1. 胫骨取材与准备
    1. 在干预90天后的次日，对小鼠腹腔注射80 mg/kg的氯胺酮（剂量为300 mL/100 g）进行麻醉。用针轻夹脚趾以确认小鼠是否完全麻醉，无反应表明麻醉成功。随后通过颈椎脱臼法处死小鼠。
    2. 用图钉将小鼠四肢固定于泡沫板上。
    3. 使用剪刀（长度：8.5 cm）和镊子（长度：10 cm）从近端向远端剪除腿部皮肤，随后取出胫骨。
    4. 立即将胫骨放入70%乙醇中，清洗3次。
  2. 用海绵泡沫包裹小鼠左侧胫骨，并将其放入样品管中（直径35 mm，长度140 mm）。
    注意：标本的长轴应与样品管长轴一致，确保胫骨近端朝上。
  3. 运行micro-CT 80扫描仪
    1. 在室温下启动micro-CT 80扫描仪。
    2. 将样品管放入micro-CT 80中，并以以下参数开始横断面扫描：像素尺寸15.6 μm，管电压55 kV，管电流72 μA，积分时间200 ms，空间分辨率15.6 μm，像素分辨率15.6 μm，图像矩阵2048 × 2048。
      注意：通过预扫描区分松质骨与皮质骨。胫骨的扫描区域定义为从胫骨平台下方5 mm至远端的松质骨区域。
  4. 骨参数的定量分析
    1. 完成横断面扫描后，获取左侧胫骨的图像。
    2. 设定密度阈值为245–1000。使用micro-CT评估软件V6.6测量以下骨参数：骨矿物密度（BMD）、骨体积/总体积（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）以及骨小梁分离度（Tb.Sp）。

3. 体外实验用血清的制备

  1. 计算
    1. 根据大鼠体重0.2 kg（1月龄，雌性，Sprague-Dawley），计算GSK颗粒的剂量：人日剂量 × 人体重 × K / 大鼠体重 = 20 g/70 kg/天 × 70 kg × K（K = 0.018）/ 0.2 kg = 2 g/kg/天。
      注：K为人体与大鼠之间的药理学转换系数15（K = 0.018）。
    2. 重复步骤3.1.1，计算以下剂量。
      1. 计算GSKL剂量：10 g/70 kg/天 × 70 kg × K / 0.2 kg = 1 g/kg/天。
      2. 计算GSKM剂量：20 g/70 kg/天 × 70 kg × K / 0.2 kg = 2 g/kg/天。
      3. 计算GSKH剂量：40 g/70 kg/天 × 70 kg × K / 0.2 kg = 4 g/kg/天。
      4. 计算CAL剂量：2片/70 kg/天 × 70 kg × K / 0.2 kg = 0.2片/kg/天。
    3. 计算GSK颗粒和CAL的总剂量。
      1. 计算GSKL的总剂量：1 g/kg/天 × 0.2 kg × 6只大鼠 × 3天 = 3.6 g。
      2. 计算GSKM的总剂量：2 g/kg/天 × 0.2 kg × 6只大鼠 × 3天 = 7.2 g。
      3. 计算GSKH的总剂量：4 g/kg/天 × 0.2 kg × 6只大鼠 × 3天 = 14.4 g。
      4. 计算CAL的总剂量 = 0.2片/kg/天 × 0.2 kg × 6只大鼠 × 3天 = 0.72片。
        注：需要总共10 mL含GSK颗粒的血清来制备100 mL培养基（含20% GSK颗粒血清）。每只大鼠（每组6只）离心后预计可提供1.5−2 mL含GSK颗粒的血清。
    4. 根据体重15计算每只大鼠给予的GSK颗粒体积：例如，体积（V）= 2 mL/只/天。
      注：大鼠灌胃给药的体积为0.1 mL/10 g。
  2. 称取3天用量的三种剂量GSK颗粒。分别称取3.6 g、7.2 g和14.4 g的GSK颗粒，作为GSKL、GSKM和GSKH。为CAL组称取0.72片。
  3. 将7.2 g GSK颗粒放入50 mL离心管中，加入36 mL生理盐水，振荡使其完全溶解。对3.6 g和14.4 g的GSK颗粒重复此操作。
  4. 按照1.6节方法，使用2 mL GSK工作液进行灌胃给药。
    注：对空白对照组使用相同体积的生理盐水（每只大鼠2 mL）灌胃，用于制备血清，作为体外实验的空白对照。
  5. 含GSK血清的制备
    1. 在最后一次给予GSK颗粒后1小时，以80 mg/kg的氯胺酮按300 mL/100 g剂量腹腔注射麻醉大鼠。用针轻刺脚趾确认大鼠是否完全麻醉，无反应表示麻醉成功。
    2. 切开皮肤和腹膜后，使用直手术剪暴露大鼠腹部至胸腔下缘。
      注：手术器械在使用前必须经高温高压灭菌。采血过程中需用70%乙醇对术区进行消毒。
    3. 用滤纸清除腹主动脉周围的结缔组织，充分暴露血管。
    4. 使用10 mL、22 G注射器从腹主动脉采血。然后取下针头，将血液转移至15 mL无菌离心管中。通常每只大鼠可采集6−8 mL血液。
      注：采血时必须保持大鼠存活。一个指标是活体大鼠的腹主动脉会搏动。采血完成后大鼠死亡。
    5. 将离心管直立于室温下静置30−60分钟，直至血液完全凝固。然后在500−600 × g 条件下离心20分钟。将一组（6只大鼠）的所有上清液（血清）转移至一个50 mL无菌离心管中，轻轻振荡混匀。
    6. 将血清置于56 °C水浴中孵育30分钟以灭活补体。使用孔径0.22 μm的亲水性聚醚砜注射器滤器过滤血清。长期保存（不超过1年）时储存于-80 °C。
      注：过滤后的血清可用于体外破骨细胞生成和成骨细胞生成实验。
  6. 应用
    1. 体外破骨细胞生成
      1. 将三种剂量的含GSK血清（GSKL、GSKM、GSKH）按1:4比例用含L-谷氨酰胺、核糖核苷和脱氧核糖核苷的最低必需培养基（α-MEM）稀释。
        注：确保体外破骨细胞生成和成骨细胞生成实验中含GSK血清的终浓度为20%。
      2. 将步骤3.6.1.1中稀释的含GSK血清（200 μL/孔）加入来自4−6周龄C57BL/6小鼠的骨髓巨噬细胞（BMMs）中，用于破骨细胞生成，并按照先前描述的方法2，用巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF，10 ng/mL）和核因子-κB受体活化因子配体（RANKL，100 ng/mL）刺激BMMs。
    2. 体外成骨细胞生成
      1. 重复步骤3.6.1.1。
      2. 将稀释后的含GSK血清（2 mL/孔）加入来自4−6周龄C57BL/6小鼠的骨髓间充质干细胞（BMSCs）中，以诱导成骨细胞分化，方法如前所述16。

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结果

Micro-CT 扫描结果表明，与生理盐水对照组小鼠相比，OVX 小鼠表现出显著的骨量丢失（图 1A）。GSK 颗粒干预治疗 90 天后，显著提高了骨密度（BMD），尤其是 GSKM 组（图 1B）。对骨结构参数（如 BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th）进行了定量分析。GSK 颗粒治疗可提高 BMD、BV/TV、Tb.N 和 Tb.Th，同时降低 Tb.Sp（图 1C）。

抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色显示，与对照组小鼠相比，OVX 小鼠的破骨细胞数量增加（图 2A）。GSK 颗粒处理组相较于 OVX 组，TRAP 阳性破骨细胞数量减少。通过计算 TRAP 阳性区域与骨小梁表面的比值（OCs/BS%）以及破...

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讨论

中药颗粒已成为制剂或处方的常见选择之一。GSK颗粒根据临床经验或中医理论由多种草药组成，具有疗效更好、副作用更少的特点4。与水煎剂相比，颗粒剂具有以下优势：口感好、便于携带、可长期储存、制备工艺标准化、疗效稳定，且生产效率更高。目前，颗粒剂是中药中最常用的剂型之一。然而，其药理作用的潜在机制仍鲜有研究。因此，有必要明确颗粒制备过程中的关键步骤，以深入探究其潜在的药理机制。

在过去几十年中，由于中药有效成分结构明确，通常采用一种或多种代表性有效成分进行分子检测和药理学研究。已有大量研究致力于通过中药有效成分来理解其治疗作用5,6,7。然而，由于体内环境复杂，多种有效成分协同作用，仅用单一成分难以模拟患者体内的实际反应。为解决这一问题，采用中药颗粒进行研究可探索药理过程，相较于使用有效成分的研究，是一种可行的分子研究方法选择。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由国家自然科学基金（81804116、81673991、81770107、81603643 和 81330085）、中国科学技术部创新团队项目（2015RA4002，WYJ）、 中国教育部创新团队项目（IRT1270，WYJ）、上海市慢性病中医药防治中心（2017ZZ01010，WYJ）、中医药事业发展三年行动计划（ZY(2018-2020)-CCCX-3003，WYJ）以及国家重点研发计划项目（2018YFC1704302）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
α- MEMHyclone
实验室		SH30265.018用于细胞培养
β-甘油磷酸盐SigmaG5422成骨分化
Caltrate（CAL）WyethL96625动物干预
C57BL/6 小鼠SLAC 实验室
Animal Co. Ltd.		随机动物准备
地塞米松SigmaD4902
二甲基亚砜SigmaD2438细胞冻存
乙二胺四乙酸（EDTA）Sangon Biotech60-00-4样品处理
胎牛血清GibcoFL-24562用于细胞培养
骨疏康颗粒中国康成公司Z20003255中药处方
光学显微镜Olympus BX50Olympus BX50破骨细胞生成图像
L-抗坏血酸-2-磷酸酯硒酸氢盐水合物SigmaA8960-5G成骨细胞生成
显微镜LeicaDMI300B破骨细胞与成骨细胞成像
M-CSFPeprotechAF-300-25-10破骨细胞生成
Μ微计算机断层扫描Scanco
Medical AG		μCT80 射线显微断层扫描仪骨结构分析
RANKLPeprotech11682-HNCHF破骨细胞生成
Sprague DawleySLAC 实验室
Animal Co. Ltd.		随机血清采集
抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）检测试剂盒Sigma-Aldrich387A-1KTTRAP 染色

参考文献

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