移植物狭窄是组织工程气道替代物面临的关键障碍。为了研究导致狭窄的细胞机制，我们采用了一种经骨髓单个核细胞（BM-MNC）接种的组织工程气管替代小鼠模型。本文详细描述了我们的实验方案，包括支架制备、BM-MNC分离、移植物接种以及移植手术。
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摘要
摘要
由于无法替换功能性组织，先天性或继发性长段气管缺损的治疗选择历来有限。组织工程技术通过将细胞和信号分子整合到三维支架中，展现出作为潜在解决方案的巨大前景。近年来，组织工程气管移植物（TETG）的研究已取得一定成功，但其临床转化受到移植物狭窄、移植物塌陷以及上皮化延迟等问题的限制。为了探究导致这些问题的机制，我们建立了一种用于组织工程气管移植物植入的小鼠模型。TETG采用静电纺丝法制备的聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）和聚氨酯（PU）聚合物，按PET与PU质量比20:80混合而成。随后，通过梯度离心法从6至8周龄C57BL/6小鼠骨髓中分离单个核细胞，并将其接种于支架内腔。每例移植物接种一千万个细胞，接种后在植入前于体外孵育过夜，随后植入至第三至第七气管环之间。该移植物能够重现组织学分析所显示的狭窄和上皮化延迟现象，并通过免疫荧光检测发现缺乏Keratin 5和Keratin 14阳性的基底上皮细胞。该模型将作为研究宿主重塑过程中涉及的细胞与分子机制的有力工具。
引言
长段气管缺损可能表现为罕见的先天性病变，如完整气管环和气管闭锁，也可能由外伤、恶性肿瘤和感染引起。当成人缺损长度超过6 cm，或儿童缺损长度超过气管总长的30%时，此类缺损无法通过手术重建进行治疗。既往尝试使用自体组织、尸体供体移植和人工结构替代气道的方法，常因慢性感染、肉芽组织形成、机械性失效和狭窄等问题而失败。
组织工程气管移植物（TETGs）有望解决这些问题，同时避免需要长期免疫抑制治疗。在过去十年中，TETGs已在动物模型中进行测试，并在极少数同情用药的临床案例中得到应用。1,2,3在临床和大型动物研究中，组织工程气道置换术后的恢复需要多种干预措施来应对狭窄（定义为 >50%管腔狭窄）并维持气道通畅。其他TETG相关研究则致力于通过评估细胞接种选择、血管化及支架设计的作用来减轻这种狭窄。旨在恢复天然气管结构与功能的细胞接种选择和支架设计，主要集中于在各类可吸收、不可吸收及脱细胞支架上接种呼吸道上皮细胞和软骨细胞。由于血管化可能在狭窄形成中起重要作用，其他研究团队已聚焦于优化 体外 或异位模型以加速再血管化或新生血管形成4然而，在保持组织工程化移植物具有足够机械性能和功能的同时，实现有效的血管化仍是一项挑战。尽管近年来取得了一些进展，但如何最大限度地减少狭窄仍是临床转化过程中的关键障碍。
为了研究TETG植入后引起的组织病理学反应 体内我们建立了一种用于组织工程气管置换的绵羊模型。移植物由经静电纺丝制备的聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）与聚氨酯（PU）混合支架构成，并接种了骨髓来源的单个核细胞（BM-MNCs）。在这一小样本队列中，我们证实接种自体BM-MNCs可加速再上皮化并延缓狭窄的发生5尽管自体骨髓单个核细胞（BM-MNCs）移植可提高存活率，但BM-MNCs调控功能性新生组织形成的细胞机制仍不明确。
在细胞水平上的研究需要建立一种小鼠组织工程气管替代模型。与绵羊研究类似，我们采用了一种由PET:PU静电纺丝支架并接种骨髓单个核细胞（BM-MNCs）的构建方式。与绵羊模型一致，在植入后的前两周内，逐渐出现组织工程气管（TETG）狭窄1,2,3,5。这一结果表明，小鼠模型成功再现了此前观察到的病理过程，使我们能够进一步探究气道狭窄背后的细胞机制。
在本报告中，我们详细阐述了在小鼠模型中进行组织工程气管置换的实验方案，包括支架制备、骨髓单个核细胞（BM-MNC）分离、移植物接种及移植手术（图1，图2）。
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方案
本文所述所有方法均已获得全美儿童医院机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。
1. 支架制造
- 通过以下步骤制备聚合物纳米纤维前体溶液：1) 将8 wt% PET溶解于1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇中，并将溶液加热至60 °C；2) 在室温下将3 wt% PU溶解于1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇中。
- 待溶液冷却后，将其混合，得到PET与PU比例为20:80的最终聚合物混合物。
- 使用装有PET:PU溶液的60 mL注射器，通过20G钝头针在高压直流电源（针头端设为+14 kV）、另一高压直流电源（设为-3 kV）、5 mL/h流速和20 cm针尖至基底距离的条件下，将PET+PU溶液电纺至不锈钢棒（直径1 mm）上。在纤维沉积过程中以350 rpm转速旋转该棒。
- 持续电纺直至达到目标支架壁厚300 µm。将支架从棒上滑下，随后在真空条件下放置过夜，以去除任何残留溶剂。
- 植入前采用350 mJ/cm2的紫外线剂量对支架进行灭菌处理。
2. 骨髓来源单个核细胞（BM-MNC）的采集
- 使用氯胺酮（200 mg/kg）、赛拉嗪（20 mg/kg）和酮洛芬（10 mg/kg）混合物对一只6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠实施安乐死。通过尾夹法确认安乐死完全。务必遵循当地的安乐死操作指南。
- 在无菌条件下，使用精细剪刀和显微Adson镊子去除股骨和胫骨表面的皮肤以暴露骨骼。使用Dumont #5镊子和Dumont #5/45镊子去除筋膜和肌腱。分离骨骼，并在每根骨的两端进行切断。使用5 mL注射器和25G针头，将骨髓冲洗至含有30 mL罗斯韦尔公园纪念研究所（RPMI）培养基的培养皿中。将含有骨髓的RPMI通过70 µm尼龙细胞滤网过滤至50 mL离心管中。
- 在生物安全柜中，将5 mL聚蔗糖和泛影酸钠加入15 mL离心管中。沿管壁缓慢加入含骨髓单个核细胞的RPMI，避免两层液体混合。在24 °C条件下，以461 × g离心30分钟，刹车设置为"Brake 1"。
注：在我们的离心机上，Brake 1表示减速过程中最长的滑行时间。 - 形成的三层中，弃去顶部（粉红色）的血浆层，收集中间（透明）层，该层含有骨髓单个核细胞。弃去底部的红细胞沉淀。
- 将骨髓单个核细胞（BM-MNC）以1:1比例用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释，并在24 °C条件下，以461 × g离心10分钟，刹车设置为"Brake 9"。
- 弃去上清液，将沉淀物用5 mL PBS重悬。在24 °C条件下，以461 × g离心10分钟，刹车设置为"Brake 9"。
- 弃去上清液，将沉淀物用约10 mL RPMI重悬。
- 取10 µL BM-MNC悬液，与等体积的0.4%台盼蓝在1 mL离心管中混合。取10 µL混合液加入细胞计数板。使用自动细胞计数仪进行细胞计数。重复该步骤并计算平均细胞数。
注：从两只供体小鼠获得的平均细胞数为1 × 108个细胞。这相当于从两根股骨和两根胫骨中分离出的骨髓细胞总量。 - 将BM-MNC悬液在24 °C条件下，以461 × g离心10分钟，刹车设置为"Brake 9"。弃去上清液，并将细胞浓度调整至每移植物含107个细胞。
注：我们研究了每移植物100万、1000万和1亿个细胞的接种效率，发现每移植物1000万个细胞时接种效率最高。
3. 在移植物上接种细胞
- 测量支架的长度，如有需要，将其切割至5 mm长度。
- 用5 µL RPMI预润湿支架5分钟，然后移除RPMI。
- 向支架管腔内加入5 µL BM-MNC溶液，孵育10分钟。
- 用21G针头穿通移植物管腔，将移植物置于1000 µL RPMI中，在37 °C培养箱中过夜孵育。
4. 移植物植入
注意：在移植物植入过程中，应保持无菌操作技术。
- 使用6-8周龄雌性C57BL/6小鼠作为细胞接种移植物的受体。在手术前24小时及切口前，皮下注射恩诺沙星（10 mg/kg）。
- 称重小鼠，并按0.1 mL/10 g剂量腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg）、赛拉嗪（10 mg/kg）和酮洛芬（5 mg/kg）的麻醉混合物作为镇痛剂。
- 通过尾部夹捏法检查是否已达到麻醉平面。确认镇静水平后，将无菌眼膏涂抹于眼睛，并剪除从下巴至锁骨区域手术部位的毛发。将动物置于垫子上，保持仰卧位。先使用聚维酮碘消毒垫对手术部位进行消毒，接着使用酒精消毒垫（70%酒精），最后再使用一次聚维酮碘消毒垫。
- 将动物置于解剖显微镜下，使其头部远离操作者。使用精细剪刀和显微Adson镊子，从锁骨至舌骨做一正中切口。必要时用Dumont #5和Dumont #7精细镊子及无菌棉签清理筋膜，并插入自持式Colibri牵开器。
- 切开带状肌图3A使用Dumont #5和Dumont #7精细镊子暴露甲状软骨、环状软骨及气管。钝性分离气管两侧与其平行走行的喉返神经，随后将气管与食管进行环周分离。图3B).
- 使用20G针头和外科标记笔标记气管前部。
- 识别气管，在第三气管软骨环下方用Vannas-Tubingen弹簧剪和Dumont #7精细镊子做一切口并横断气管。用精细弯镊夹住并固定 使用无菌9-0尼龙缝线将气管远端与胸骨固定，以建立临时性气管造口（图3C）。注意：气管植入和肌肉重新对合时可选用的另一种缝合材料是9-0 PDS。
- 使用20G针头和外科标记笔，在移植物上标记以表示前部区域。
- 依次植入移植物，先缝合近端后侧、再缝合近端外侧、最后缝合近端前侧，使用9-0无菌尼龙线（图3D），Dumont #7 精细镊子和持针器。
- 将动物旋转180°，使其尾部远离术者。解除临时气管造口。远端气管进行不完全横断，以保留切除段作为牵引用的残端。当不再需要时，完全移除5 mm气管段。
- 以与近端吻合相同的方式缝合完成远端吻合。
- 重新对合移植物位置与带状肌，使用9-0无菌尼龙缝线连续缝合关闭切口。
- 皮下注射0.1 mL布托啡诺（0.1 mg/kg），并将动物置于加热垫上的恢复笼中，笼内不与其他动物同笼。
- 观察小鼠直至其恢复意识并能够自主活动，然后将其转移至含有柔软垫料、湿润饲料和含药物的水（布洛芬，30 mg/kg）的新笼子中饲养48小时。此后，将小鼠放回正常笼具，与其他小鼠合笼饲养。
注意：植入后若小鼠持续出现呼吸窘迫或活动减少的情况，应由实验室和/或动物饲养人员在32 °C的培养箱中观察。如果此状况持续超过48小时，则应实施安乐死。
5. 组织学与免疫组织化学
注意：苏木精和伊红染色由全美儿童医院形态学核心实验室采用标准技术完成。免疫组织化学染色按照以下步骤进行。
- 使用以下步骤对切片进行脱蜡：1) 二甲苯 5 分钟，2) 二甲苯 5 分钟，3) 100% 乙醇 5 分钟，4) 90% 乙醇 5 分钟，5) 70% 乙醇 5 分钟，6) 蒸馏水 H2O (dH25分钟
- 将切片浸入柠檬酸盐缓冲液中，放入盛有水的压力锅内。加热10分钟，随后冷却至室温。用含0.1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液（BSA-PBS）洗涤5分钟。用去离子水漂洗2O.
注意：也可使用水浴或微波加热15分钟。 - 在室温下用含3%正常山羊血清的PBS溶液孵育载玻片1小时。用含0.1% BSA的PBS溶液洗涤5分钟。加入一抗孵育，角蛋白5（keratin 5）抗体稀释比例为1:10006，角蛋白14（1:250）6 和 F4/80（1:100）7 4 °C下孵育18小时过夜。
- 用 0.1% BSA-PBS 洗涤两次，每次 10 分钟。室温下用适当浓度的二抗孵育 1 小时，K5/K14 的稀释比例为 1:500，F4/80 的稀释比例为 1:300。用 0.1% BSA-PBS 洗涤两次，每次 10 分钟。
- 使用含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂和玻璃盖玻片进行封片。室温避光静置30分钟，然后进行成像。
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结果
图1 展示了TETG接种与植入的示意图。从小鼠C57BL/6中采集骨髓并进行培养 体外通过密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞，并将其接种至TETG上。将接种了细胞的TETG植入同系C57BL/6受体小鼠体内。
图2 是 PET:PU TETG 支架制造过程的示意图。将 PET:PU 溶液通过静电纺丝技术沉积到一根 20G 钝针上，以获得最终壁厚为 300 µm、管腔直径为 1 mm 的 TETG，从而模拟小鼠气管的天然结构。扫描电子显微镜图像展示了 TETG 的表面结构，并包含动画显示的单核细胞。
手术植入过程如图3所示，其中展示了最关键的...
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讨论
建立组织工程气管的小鼠模型对于理解限制组织工程化气管移植物（TETGs）临床转化的因素至关重要，这些因素主要包括移植物塌陷、狭窄以及上皮化延迟4。导致这些局限性的若干因素包括移植物材料的选择、制造工艺、支架设计以及细胞接种方案。该模型可实现对这些因素的快速评估，从而有助于阐明影响这些过程的细胞和分子机制。
我们在此展示了上皮细胞的存在（图4），以及该模型再现移植物狭窄的能力（图5）；然而，该模型的成功应用依赖于植入过程中的几个关键步骤。首先，在初始切口和分离小鼠气管时，必须避免损伤位于气管食管沟内的邻近喉返神经或使其受到牵拉。另一个在切除自体气管时的重要因素是避免对位于气管后方的食管造成任何损伤。
通过建立临时气管造口以在操作过程中允许气流通过，可避免气管插管。然而，重要的是要防止任何物质（即组织）堵塞临时的远端气管造口，并将气管保持在体腔外，以利于呼吸。移植物...
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
我们谨向 Robert Strouse 及研究信息解决方案团队致以感谢 &感谢全美儿童医院 #38; 创新部门在平面设计方面的支持。本研究由美国国立卫生研究院（NHLBI K08HL138460）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.9% 氯化钠注射液 | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-186-10 | |
| 10毫升血清学移液管 | Falcon | 357551 | |
| 18G 1.5英寸针头 | BD | 305190 | |
| 1 mL 注射器 | BD | 309659 | |
| 24孔板 | 康宁 | 3526 | |
| 25毫升血清移液管 | Falcon | 356535 | |
| 25G 1英寸针头 | BD | 305125 | |
| 50 cc 离心管 | BD | 352070 | |
| 酒精消毒片 | Fisher Healthcare | NDC 69250-661-02 | |
| 拜耳灵（恩诺沙星）溶液 | 拜耳医药保健有限责任公司 | NDC 0859-2267-01 | |
| 黑色聚酰胺单丝缝合线，9-0 | AROSurgical Instruments Corporation | T05A09N10-13 | |
| C57BL/6，雌性 | 杰克逊实验室 | 664 | 6-8周龄 |
| pH 6.0 柠檬酸盐缓冲液 20倍浓缩液 | 赛默飞世尔科技 | 5000 | |
| 科利布里拉钩 | F.S.T | 17000-04 | |
| 棉签 | Fisher Scientific | 23-400-118 | |
| 细胞角蛋白14单克隆抗体 | 赛默飞世尔科技 | MA5-11599 | |
| Dumont #5 镊子 | F.S.T | 11251-20 | |
| Dumont #5/45 镊子 | F.S.T | 11251-35 | |
| Dumont #7 细镊 | F.S.T | 11274-20 | |
| F4/80 大鼠抗小鼠抗体 | Bio-Rad | MCA497R | |
| Ficoll | Sigma | 10831-100mL | |
| 精细剪刀—尖头钝头 | F.S.T | 14028-10 | |
| Fisherbrand 优质盖玻片 | 赛默飞世尔科技 | 12-548-5M | |
| 含DAPI的Fluoroshield封片剂 | Abcam | ab104139 | |
| 山羊抗小鼠IgG二抗Alexa Fluor 594 | 赛默飞世尔科技 | A-11001 | |
| 山羊抗兔 IgG 二抗 Alexa Fluor 594 | 赛默飞世尔科技 | A-11012 | |
| 山羊抗大鼠IgG二抗Alexa Fluor 647 | 赛默飞世尔科技 | A-21247 | |
| 布洛芬 | Precision Dose, Inc | NDC 68094-494-59 | |
| 碘伏消毒垫 | Professional Disposables International, Inc. | NDC 10819-3883-1 | |
| 角蛋白5多克隆抗体，纯化 | BioLegend | 905501 | |
| 盐酸氯胺酮注射液 | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| 微型阿德森镊 | F.S.T | 11018-12 | |
| 显微镜 | Leica | M80 | |
| 无纺布海绵 | Covidien | 441401 | |
| 眼膏 | 德克拉动物保健产品 | NDC 17033-211-38 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| PET/PU（聚对苯二甲酸乙二醇酯 &聚氨酯支架 | 纳米纤维溶液 | 定制订购 | |
| 培养皿 | BD | 353003 | |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | 11875-093 | |
| TISH持针器/镊子 | 微管蛋白互作蛋白 | MI1540 | |
| 修剪器 | Wahl | 9854-500 | |
| Vannas-Tü宾根弹簧剪 | F.S.T | 15008-08 | |
| 温水循环器 | Gaymar | TP-700 | |
| 赛拉嗪无菌溶液 | Akorn 动物健康 | NDC 59399-110-20 |
参考文献
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