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Caenorhabditis elegans 中的核酸与蛋白质联合提取

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DOI：

10.3791/59178

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2019年3月17日

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology, Cell Biology and Biochemistry, Brown University

本文内容

摘要

本文介绍了一种从同一样本中同时分离 RNA、DNA 和蛋白质的实验方案，旨在减少样本间变异，提高实验可重复性，并有助于结果的准确解读。

摘要

单个生物样本包含大量信息，目前普遍采用同时分析多种大分子的方法，以全面了解不同条件下分子加工过程及变化的多个层次。本实验方案介绍了从同一样本的线虫Caenorhabditis elegans中分离DNA、RNA和蛋白质的方法，从而消除当这些生物分子从经相似处理但实际不同的样本重复中分别提取时所引入的样本间变异。采用酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取法从线虫中提取核酸和蛋白质，随后分别进行沉淀、洗涤和溶解。我们展示了从三种线虫品系及HeLa细胞的单个样本中成功分离RNA、DNA和蛋白质，并且在成年动物中获得了更优的蛋白质提取效果。此外，与传统的RIPA法提取蛋白质相比，采用硫氰酸胍-苯酚-氯仿法提取的线虫蛋白质可提高大分子量蛋白质的分辨率，并在免疫印迹检测中表现出更高的可检测水平。

本方法在采用多组学方法研究样本时具有重要价值，尤其适用于蛋白质组和转录组的分析。能够同时评估多组学信息的技术备受关注，因为复杂生物现象背后的分子信号被认为在多个互补层次上同时发生；然而，越来越多的研究发现，mRNA 水平的变化并不总能反映蛋白质水平的相应变化，且样本采集时间在昼夜节律调控背景下具有重要意义。该方法可在同一份样本内检测不同组分时消除样本间变异（即实现样本内分析）。

引言

多组学是一种结合基因组、蛋白质组、转录组、表观基因组、微生物组或脂质组等多种组学的分析方法，在处理大规模数据集以进行疾病特征分析时日益流行1,2。越来越多的证据表明，仅局限于单一“组”（"ome"）的研究方法无法提供完整的分子分析（Rotroff 和 Motsinger-Reif 综述1）。尤其是在采用高通量技术进行筛选时会产生大量数据，但为了全面描绘分子图景或识别最关键的靶标，多组学方法更具优势。然而，在使用多组学方法时，常观察到 mRNA 水平与蛋白质水平之间存在差异3,4,5,6。值得注意的是，用于并行转录组和蛋白质组分析的 mRNA 和蛋白质——分别通过 RNA 测序（RNAseq）和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测——通常来源于不同重复样本中经过相似处理的样品，这可能在相同实验条件下引入样本间变异3,4,5,6。Harvald 等人开展了一项精巧的秀丽隐杆线虫（C. elegans）饥饿时间序列研究，比较了野生型（WT）线虫与缺乏长寿相关重要转录因子的 hlh-30 突变体线虫的转录组和蛋白质组7。需要指出的是，RNA 和蛋白质取自相同条件下的不同重复样本，而非同一份样本。他们的研究结果显示，在各个时间点上 mRNA 水平与蛋白质水平之间的相关性较低（r = 0.559 至 0.628）。事实上，其热图分为四个聚类：聚类 I 显示 mRNA 水平显著下降，但相应蛋白质水平几乎没有或未见下降；聚类 II 显示 mRNA 水平几乎没有或未见上升，但蛋白质水平上升；聚类 III 显示 mRNA 水平上升，但蛋白质水平下降；聚类 IV 显示 mRNA 水平上升，而蛋白质水平仅有轻微变化4。此外，当相同条件下的样本并非在同一确切时间点采集时，也可能引入此类样本间变异。例如，受昼夜节律调控的 mRNA 和蛋白质会随一天中的时间而波动8,9，更具体而言，秀丽隐杆线虫（C. elegans）对光照的暴露情况也会影响其表达9；这些昼夜节律相关蛋白的表达可能在基因表达诱导后延迟长达 8 小时才出现10。然而，这种现象的普遍性并不意味着其本身是错误的；事实上，这可能具有重要的信息价值。mRNA 与蛋白质始终处于合成与降解的动态平衡之中。此外，蛋白质常经历翻译后修饰，以增强其稳定性或促使其降解11。例如，泛素化状态可导致蛋白质激活，或将其靶向蛋白酶体或溶酶体进行降解12。同时，非编码 RNA 在转录及转录后阶段对基因表达调控发挥着重要作用13。因此，关键问题在于：如何尽可能减少变量，以确认我们在这些线虫研究中观察到的差异确实是真实存在的。

本文提出了一种通过从同一样本中分析不同大分子来消除样本间差异的方法。本实验方案的目的是提供一种可从秀丽隐杆线虫（C. elegans，也称为线虫）的单个样本中稳定分离DNA、RNA和蛋白质的方法，以减少变异、提高可重复性并促进结果解读。使用同一样本的额外优势还包括在样本采集过程中节省时间和资源，便于对珍贵且有限的样本进行横向分析（例如难以培养和维持的品系），并基于样本内mRNA和蛋白质水平的差异变化，深入理解大分子的差异调控机制。

该方法适用于从单个线虫样品中评估基因表达和蛋白质水平，能够对分子加工的多个层面进行更全面的分析。本实验采用硫氰酸胍-苯酚-氯仿（GTCp）试剂14（一种常用于RNA分离的化学试剂）从线虫中提取核酸和蛋白质，并随后对各组分进行沉淀、洗涤和溶解。本方案整合了多种已有方法15,16 并进行了少量修改，主要针对C. elegans设计，但我们已成功应用相同步骤从HeLa细胞沉淀中分离出RNA、蛋白质和DNA。尽管本文未进行测试，该方案也可能适用于组织样本17,18。

方案

注意：每种大分子的沉淀步骤依次进行，洗涤步骤则同时进行；但建议首先完成RNA的分离，因为RNA本身不稳定。

1. 样本收集

  1. 在10 cm培养皿中接种1,000个线虫卵，并置于适当的生长条件下19。在20 °C下培养72 h。
    注意：通过漂白带有卵的成虫以收集卵，方法如前所述19。
  2. 用约5 mL M9缓冲液冲洗培养皿，将1,000条成虫收集至离心管中。
    注意：M9缓冲液的成分为：35 mM 磷酸氢二钠、102 mM 氯化钠、22 mM 磷酸二氢钾和1 mM 硫酸镁，溶于无菌水中19。
  3. 以1,000 × g离心1 min，弃去上清液，并将沉淀的线虫用1 mL M9缓冲液转移至1.5 mL微量离心管中。
  4. 再次以845 × g离心1 min，弃去大部分上清液。将沉淀的线虫在-80 °C下保存至少4 h。
    注意：使用冷冻沉淀物比新鲜沉淀物获得的产量更高。若使用新鲜沉淀物，建议使用液氮或干冰上的95%乙醇进行多次冻融循环，以破坏线虫角质层。在沉淀物中保留少量M9缓冲液有助于在冷冻过程中破坏角质层。

2. 核苷酸与蛋白质的分离

  1. 去除解冻后沉淀物中的任何上清液，并加入 1 mL 冷的 GTCp 试剂。通过反复吹打充分混匀。将样品置于冰上 10 分钟，并偶尔颠倒混匀。
    注意：苯酚具有腐蚀性、神经毒性且高度有毒，可能引起化学灼伤和失明。
    备注：我们使用的起始材料最多为 5,000 条成虫，对应所报告的试剂体积；各步骤体积均基于使用 1 mL GTCp 试剂。若使用更大的样品量，可能需要按比例放大。
  2. 向线虫与 GTCp 的混合液中加入 200 µL 冷氯仿。用手握住离心管并剧烈振荡 15 秒。室温（RT）静置 3 分钟。
    注意：氯仿为有毒刺激物，可能引起皮肤溃烂及其他器官特异性损伤，且为可能的致癌物。
  3. 在 4 °C 条件下以 13,500 × g 离心 15 分钟。
    备注：离心后形成三层：顶部为透明的水相，底部为粉红色的有机相，中间为含有脂质和 DNA 的少量浑浊界面层。
  4. 使用微量移液器将顶部透明层（水相）转移至新的无 RNase 的 1.5 mL 微量离心管（管 A）中，用于通过醇沉淀法分离 RNA（详见步骤 2.5）；将剩余沉淀中的粉红色层（有机相）转移至另一新管（管 B）并置于冰上。
    备注：粉红色有机相可于 -80 °C 冷冻保存，直至从中提取 DNA 和蛋白质。较大的样品将在水相与有机相之间产生较厚的白色层，该层含有 DNA。若可在不扰动其他相的前提下将其分离，则应将其移至单独的管中（管 B2）。
  5. 按以下步骤分离 RNA。
    1. 从管 A 的透明水相中，加入 500 µL 100% 异丙醇沉淀 RNA。室温孵育 10 分钟。随后在 4 °C 条件下以 13,500 × g 离心 10 分钟。
      备注：管底应可见少量白色 RNA 沉淀。
    2. 倾去大部分上清液。使用带针头的 1 mL 注射器吸除剩余上清液并弃去。
      备注：针头尺寸无关紧要；但较大规格的针头可提供更好的控制力，避免扰动沉淀。若无针头，可使用微量移液器。
    3. 向管 A 中加入 1 mL 75% 乙醇以洗涤沉淀。在 4 °C 条件下以 5,300 × g 离心 5 分钟。
    4. 如步骤 2.5.2 所述，通过倾倒并使用带针头的 1 mL 注射器去除沉淀中的上清液，并弃去。
    5. 让沉淀在空气中干燥 5–10 分钟，但避免过度干燥。在沉淀完全透明前，使用 50 µL 无 RNase 水重新溶解 RNA 沉淀。
      备注：此体积适用于 1,000–3,000 条线虫，但需根据实际起始材料量进行调整。
    6. 在 55–60 °C 孵育 10 分钟以溶解沉淀。
    7. 使用分光光度计测定浓度和纯度。记录 260 nm 处的吸光度以确定 RNA 浓度，以及 230 nm 和 280 nm 处的吸光度以检测杂质。
    8. 通过柱纯化或后续乙醇洗涤结合 DNase 处理，清除 RNA 中的污染物（如苯酚残留物或 DNA）。
      备注：此时 RNA 已可用于 RNA 测序分析，或用于合成 cDNA 进行 RT-qPCR（详见第 3.1 节）。RNA 可于 -80 °C 保存以备后续使用。
  6. 按以下步骤分离 DNA。
    1. 从管 B 中的粉红色有机相及管 B2 中的样品（如有），加入 300 µL 100% 乙醇以沉淀 DNA，并通过颠倒混匀。室温静置 2–3 分钟。
    2. 在 4 °C 条件下以 375 × g 离心管 B 和管 B2 5 分钟，使 DNA 沉淀。
    3. 将管 B 和管 B2 中的上清液倾入新的 2 mL 管（管 C）中，并置于冰上，用于后续蛋白质分离。用 1 mL 含 10% 乙醇的 0.1 M 柠檬酸钠溶液洗涤管 B 或管 B2 中的 DNA 沉淀 30 分钟。在 4 °C 条件下以 375 × g 离心管 B 和管 B2 5 分钟。
      备注：钠离子可结合 DNA 骨架，使 DNA 在柠檬酸钠和乙醇中更易沉淀，从而通过低速离心去除杂质。
    4. 重复步骤 2.6.3 的洗涤步骤。将沉淀重悬于 1.5 mL 75% 乙醇中，室温静置 20 分钟，期间偶尔颠倒混匀。
    5. 在 4 °C 条件下以 375 × g 离心管 B 和管 B2 5 分钟。
    6. 弃去上清液，干燥 5–10 分钟。
    7. 将沉淀溶解于 150 µL 8 mM 氢氧化钠中。如有必要，用 HEPES 调整至所需 pH。在 4 °C 条件下以 375 × g 离心样品 5 分钟。
    8. 使用微量移液器将上清液（DNA）转移至新管中。使用分光光度计测定浓度并确定纯度。记录 260 nm 处的吸光度以确定 DNA 浓度，以及 230 nm 和 280 nm 处的吸光度以检测杂质。
  7. 按以下步骤分离蛋白质。
    1. 为沉淀蛋白质，向管 C 中的粉红色上清液加入最多 1.5 mL 100% 异丙醇，反复颠倒混匀，并在室温孵育 10 分钟。
    2. 在 4 °C 条件下以 13,500 × g 离心管 C 10 分钟。
    3. 弃去上清液，并用 2 mL 含 95% 乙醇的 0.3 M 盐酸胍溶液在室温洗涤沉淀 20 分钟。在 4 °C 条件下以 5,300 × g 离心管 C 5 分钟。
    4. 重复步骤 2.7.3 的洗涤步骤两次。
    5. 将蛋白质沉淀转移至新的 1.5 mL 管（管 C2），并加入最多 1.5 mL 95% 乙醇。涡旋混匀后室温静置 20 分钟。
    6. 在 4 °C 条件下以 5,300 × g 离心管 C2 5 分钟。弃去上清液，在室温下干燥沉淀 10 分钟。在 50 °C 条件下用 300 µL 5% SDS 溶解沉淀 60 分钟。
      备注：可能需要更长的孵育时间才能完全溶解蛋白质沉淀。过去曾将沉淀孵育长达 6 小时而未影响质量。
    7. 在 17 °C 条件下以 13,500 × g 离心管 C2 10 分钟。将上清液转移至新管中。
    8. 使用适合含去垢剂样品的蛋白质定量方法测定浓度。
      备注：该蛋白质样品可直接用于 SDS-PAGE 和免疫印迹分析。如需长期保存，可于 -20 °C 储存。对于 LC-MS/MS 等其他技术，需透析去除去垢剂。

3. 评估 mRNA 和蛋白质水平

  1. RT-qPCR
    1. 使用以下热循环仪程序，以1 ng RNA通过逆转录制备cDNA：引物退火（25 °C下5分钟）、逆转录（46 °C下20分钟）和逆转录酶失活（95 °C下1分钟）。
    2. 将每份cDNA样品以1:100稀释后取100 µL加入96孔板的各个孔中，制备cDNA储备板。应包括适当的对照，例如无模板/仅水孔，以及从1:25至1:400梯度稀释的样品（使用所有分析样品混合后的cDNA制备），以便为每个分析基因建立标准曲线以确定引物扩增效率。
      注意：该格式可与96孔微量分配器联用，实现将整板样品转移至RT-qPCR板，减少孔间移液差异。随后可使用多通道移液器向各孔加入适当的预混液（例如SYBR Green预混液加引物）。总体而言，该方法可减少手工逐孔加样引入的误差，进一步降低变异性。
    3. 从储备板中取3 µL cDNA加入RT-qPCR板的各孔中。
    4. 为每对引物配制预混液，每份包含1×含DNA嵌入型氰基染料的超混合液、正向和反向引物各5 µM，并用水补足至每份7 µL。将7 µL预混液加入RT-qPCR板的相应孔中，轻轻振荡混匀。
      注意：应包括内参基因（看家基因）的检测样品，用于结果归一化20。
    5. 使用适用于所用引物的RT-qPCR程序运行PCR板。
  2. Western blot
    注意：有关Western blot的详细信息，请参阅Mahmood和Yang21。
    1. 将20 µg蛋白质与等体积的2×Laemmli上样缓冲液混合，于95 °C煮沸10分钟，制备SDS-PAGE样品。
    2. 将样品上样至4%–15% Tris-甘氨酸凝胶，以150 V电泳1小时，或直至染料前沿迁移至凝胶底部。
    3. 在半干转装置中，以25 V电压将蛋白质从凝胶转移至硝酸纤维素膜，持续30分钟。
    4. 使用Ponceau S染色法对膜染色，以确认转膜效果。
    5. 用含0.01%吐温-20的Tris缓冲盐水（TBS-T）彻底洗去膜上的染色液。
    6. 用含5%脱脂奶粉的TBS-T溶液在室温下封闭膜1小时。
    7. 根据供应商推荐的稀释比例，将膜与一抗孵育，并在4 °C摇床上过夜孵育。
    8. 用TBS-T溶液洗涤膜3次，每次5分钟。
    9. 根据供应商推荐的稀释比例，将膜与适当的二抗孵育，并在室温下摇床上孵育1小时。
    10. 用TBS-T溶液洗涤膜3次，每次5分钟。
    11. 使用常用方法对Western blot结果进行成像与定量分析。

结果

对RNA、DNA和蛋白质样品进行了分析，本文展示了使用RNA和蛋白质提取物的代表性结果。此外，我们将采用GTCp方法获得的蛋白质样品与常用的RIPA裂解法22进行了比较。在实验中，我们使用了四组独立重复的野生型（N2）线虫，以及两种长寿突变型线虫eat-2和rsks-123,24。

RNA 和 DNA 的数量与质量

使用约3,000条成虫作为起始材料，将RNA重悬于50 µL水中后，其浓度范围为0.2–2 µg/µL。吸光度比值（反映纯度）在A260/A280中为2.0至2.2，在A260/A230中为1.9至2.5（表1），表明成功提取了RNA，且未受到GTCp组分（如苯酚或盐酸胍）的污染。

DNA 提取成功，但质量存在差异。当重新悬浮于缓冲液中时，DNA 浓度为 150 µL NaOH 的浓度范围为 0.04 至 1.1 µg/µLA260/A280 的吸光度比值范围为 1.8 至 2.1，A260/A230 的吸光度比值范围为 0.9 至 1.6（表1)，表明DNA提取成功；然而，部分样品被GTCp组分（如苯酚或盐酸胍）污染。如果需要进行DNA分离，在分离中间层与GTCp相时需格外小心，可能需要增加洗涤步骤。

选定靶标的RT-qPCR

从每种线虫品系的四个独立样本中成功提取了RNA，并送交进行RNA测序分析，随后使用含有氰基染料的预混液进行了RT-qPCR验证。RT-qPCR分析的靶基因选自大规模RNA测序数据集，筛选标准为在两种突变体中相较于野生型（WT）线虫均表现出显著差异表达的共有基因。F07C4.1225（人类neuroligin 3同源基因，b亚型）被选定为共同上调的靶基因。此外，我们还纳入了一个在两种突变体之间差异调控的基因mrp-126进行进一步分析，该基因在eat-2线虫中上调，而在rsks-1线虫中下调。RT-qPCR验证了mrp-1的表达变化；然而，RNA测序分析预测的F07C4.12在rsks-1线虫中的上调现象，在RT-qPCR中未被检测到（图1）。

还研究了其他一些在蠕虫中经抗体验证的靶标。这些靶标包括 Hadwiger 等人研究中表征的多种细胞器标志物27。其中多个标志物在突变蠕虫中的 mRNA 水平上表现出差异表达。如图1所示，lmp-128 和 dlg-129 在 eat-2 蠕虫中上调；hsp-430、hsp-7030 和 lmp-1 在 rsks-1 蠕虫中上调；hsp-6031 和 pas-732 在 eat-2 蠕虫中下调；hsp-60 和 tac-133 在 rsks-1 蠕虫中下调。

同时提取与RIPA蛋白制备的比较

为验证上述GTCp方法所提取蛋白的效率与质量，我们将该方法与使用传统RIPA裂解法收集蛋白的方法进行了比较22使用相同量的起始材料，即仅成虫（约10,000条蠕虫）或成虫、幼虫和卵的混合群体（约130,000条蠕虫），在相同终体积中重悬时，采用GTCp法收集到的总体量较少表1）；然而，从仅含成虫的群体中提取的效果优于混合群体。此外，蛋白质质量相似，尽管在总蛋白等量上样条件下，GTCp法提取的蛋白质在考马斯亮蓝染色中显示出对较大分子量蛋白质更佳的分辨效果。 图2确实，通过蛋白质印迹检测的靶点在 图3 在大多数情况下水平相似；然而，分子量大于75 kDa的蛋白质在RIPA提取的蛋白样品中水平低于GTCp提取的蛋白样品（图3A，右侧泳道； 图3B，黄色标尺。

本文所述提取方法也在哺乳动物细胞系HeLa中进行了评估。作为参考，从六百万个HeLa细胞形成的致密沉淀（约25 µL沉淀）中使用RIPA提取的蛋白量，与从13万个混合虫群（约75 µL致密沉淀）中提取的蛋白量相当，约为从1万个成虫（约100 µL重力沉降沉淀）中提取蛋白量的一半，如表1所示。我们发现，在HeLa细胞中，与RIPA提取的蛋白相比，GTCp提取的蛋白其提取效率（表1）以及大分子量蛋白的分辨率（图2）均有所下降，提示该方法在成虫虫群中效果更佳。GTCp提取的HeLa细胞蛋白沉淀未能完全溶解，可能是该方法在哺乳动物细胞中应用的一个局限性。

通过RT-qPCR分析的免疫印迹靶标

接下来，我们检测了RT-qPCR所分析基因产物的蛋白水平，以确定mRNA水平是否与蛋白水平相关。如图3所示，许多靶标的蛋白平均表达变化与mRNA平均表达变化相一致；然而，部分蛋白水平并未反映mRNA水平的变化。通常情况下，eat-2线虫中某些基因的mRNA水平高于其他品系，但其蛋白水平却与其它品系相同或更低。最显著的观察结果是，eat-2线虫中dlg-1 mRNA水平极高，但并未转化为更多的蛋白；事实上，与其它品系相比，dlg-1蛋白水平反而更低（图3）。

最后，GTCp提取的蛋白与RIPA提取的蛋白水平显示出显著差异。两种方法的RNA均以相同方式提取；然而，通过RIPA裂解收集的相似但独立的样品中蛋白水平明显降低，尤其是分子量大于75 kDa的蛋白（图3A，右侧泳道；图3B，黄色柱状图）。

样本内 mRNA 与蛋白质水平的比较

本方案的目标之一是确定我们在 mRNA 和蛋白质水平上观察到的差异是真实存在的，还是样本间变异所导致的人为假象。在图4中，对部分靶标在单个样本内进行了比较。每个单独的样本以相同色调和颜色的圆点表示，其中样本1为最深的色度，样本4为最浅的灰色（WT）、蓝色（eat-2）或红色（rsks-1）。在大多数样本中，mRNA 水平的变异性较低，而蛋白质水平的变异性更高，这可能是蛋白质印迹半定量分析的一个潜在缺陷。当比较每对 mRNA 与蛋白质之间各彩色圆点的位置时，其从高到低的排序常常不一致；例如，在野生型（WT）中，hsp-60 mRNA 的顺序为样本4、3、2、1，而蛋白质水平的顺序则为1、2、3、4。因此，样本内 mRNA 与蛋白质水平之间的差异确实存在，但本研究所呈现的方法使研究者能够排除样本采集时间作为观察差异的可能来源。

RNA、DNA、蛋白质浓度表格结果；RNA/DNA比值与浓度数据比较。
表1：浓度与吸光度比值。 使用分光光度计测定RNA和DNA的浓度及纯度比值。蛋白质浓度通过比色法蛋白质定量检测确定。灰色、蓝色和红色高亮的样本用于RT-qPCR和Western印迹实验。黄色标记的样本用于比较GTCp与RIPA法提取蛋白质，或线虫蛋白质与HeLa细胞蛋白质。 请点击此处下载该文件。

mRNA 水平比较；柱状图；WT, eat-2, rsks-1；表达分析；标准化数据。
图 1：通过 RT-qPCR 检测基因表达。 采用本方法提取的 mRNA 进行 RT-qPCR 分析，验证来自 RNAseq 数据鉴定出的靶基因以及细胞器标志基因的表达。误差线表示标准差；n = 4。每组引物均构建标准曲线，用于确定 mRNA 浓度。所有 mRNA 水平均相对于六种作为参照基因的看家基因（act-1、cdc-42、ama-1、nhr-23、pmp-3 和 cyn-1）的平均值进行标准化处理。请点击此处查看该图的高清版本。

SDS-PAGE 凝胶电泳结果，来自线虫和 HeLa 样品的蛋白质按分子量（kDa）分离。
图 2：线虫和 HeLa 细胞中 GTCp 法与 RIPA 法提取蛋白质的比较。 通过 GTCp 或 RIPA 裂解方法提取的野生型（WT）线虫或 HeLa 细胞总蛋白，经 SDS-PAGE 分离后用考马斯亮蓝染色。每条泳道上样量为 25 µg 总蛋白。 请点击此处查看该图的放大版本。

显示不同遗传品系线虫中蛋白质水平的蛋白质印迹图和柱状图，以β-actin为内参进行归一化。
图3：线虫中的蛋白质水平。（A）通过RT-qPCR研究的靶蛋白的蛋白质印迹图，以及（B）信号强度的密度分析。每条泳道上样量为20 µg，蛋白样品分别来自野生型（WT）、eat-2 或 rsks-1 突变型线虫，提取方法为GTCp法。所示图像代表每种线虫品系四次独立重复实验的典型结果。β-actin（底部）用作上样对照，仅展示一组代表性数据。最右侧泳道上样量为20 µg，蛋白样品来自rsks-1突变型线虫，提取方法为RIPA法。（B）使用ImageJ软件对相应信号强度进行定量分析。误差线表示标准偏差；n = 4。请点击此处查看该图的放大版本。

基因表达分析，mRNA 和蛋白质水平；比较图：WT、eat-2、rsks-1 基因靶标。
图 4：样本内 mRNA 与蛋白质水平比较。 来自各菌株部分靶基因的单个样本的 mRNA 和蛋白质水平被并列排列。颜色对应于表 1：灰色/黑色代表 WT，蓝色代表 eat-2，红色代表 rsks-1。同一靶基因的 mRNA 与蛋白质水平相邻配对，并按线虫菌株分隔。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

对于生物分子（如 DNA、RNA 和蛋白质）的分离方法，通常在无技术重叠或组合的情况下进行优化。当样本难以获取时，这种方法尤其不利，可能导致在不同时间点但在相同条件下采集样本。根据细胞通路的不同，在不同时间采集的重复样本可能会引入变异。本文提供了一种克服该难题的方案，即从同一样本的线虫中同时分离和纯化各类生物分子，从而减少因不同分离技术、样本采集时间或采集不均所带来的变异。控制这些变量不仅节省时间和资源，还有助于提高实验的可重复性。在此，我们展示了一种组合式方法，在保证 RNA 和蛋白质质量的同时实现同步提取，尽管 DNA 的提取结果存在一定波动。通过 DNA 纯化步骤可进一步优化提取效果。我们以线虫 C. elegans 和 HeLa 细胞的材料验证了该方法。

先前对 N2 野生型动物以及 eat-2 和 rsks-1 突变体的转录组和蛋白质组研究已揭示了多种通路，包括延长寿命的机制4,34,35,36。为了探究热量限制延长寿命的机制，一项细胞培养中氨基酸稳定同位素标记（SILAC）分析发现，eat-2 蠕虫的整体蛋白质合成水平普遍下调36。本文展示的数据与该发现一致，尽管相同靶基因的 mRNA 水平显著升高。另一研究团队旨在鉴定 S6K 介导长寿的效应因子，因此对 rsks-1 蠕虫进行了蛋白质组学筛选34。根据本研究获得的 RNA 测序数据，我们鉴定出至少三个基因，其表达变化与该筛选中发现的蛋白质相符；MRP-1 以及 CPA 和神经配素（F07C4.12）的同源物被发现于 rsks-1 蠕虫中差异表达，相较于野生型 N2 存在显著不同34。

采用该方法生成的数据与以往的多组学研究结果一致。通过九个靶基因的mRNA水平来预测每个样本中的蛋白质水平。在这些靶基因中，许多蛋白质的表达水平可根据其mRNA水平进行预测。然而，mRNA水平与蛋白质水平之间仍存在显著差异。重要的是，本方案通过从同一样本中同时获取mRNA和蛋白质，消除了样本间的变异，使科研人员能够更有把握地评估和解读这些差异。此外，我们将同一样本中获得的mRNA水平与蛋白质水平进行了比较，同时也与采用RIPA法提取的相似但不同样本中的蛋白质水平进行了比较。结果显示，对于多个靶基因，RIPA提取样本中的蛋白质水平明显更低。若不控制样本间的变异，则无法判断这种差异究竟是源于mRNA与蛋白质的差异性调控，还是样本间固有的变异性所致。

需要牢记的是，已有专门针对这些不同大分子的优化方案，因此如果横断面分析并非实验的最终目标，则应采用相应的特定方法。使用GTCp法分离DNA和蛋白质会导致其溶解度降低，需要将DNA重新溶解于弱碱（如NaOH）中，并通过含有高浓度去污剂的缓冲液并加热来溶解蛋白质，但存在溶解不完全的风险。此外，GTCp含有硫氰酸胍和酸性苯酚，虽可使蛋白酶等酶失活，但若不冷冻保存，会随时间推移导致蛋白质缓慢降解。研究人员需自行判断是否值得采取措施规避这些局限性。

值得注意的是，在处理 RNA 时，建议采用无菌技术，除非另有说明，应始终将样品置于冰上，并使用市售的去污染试剂，以保持 RNA 的完整性。需要特别指出的是，较大的样品起始时需要更多的 GTCp，且每种提取溶剂的用量也需相应增加。当使用正确量的 GTCp 时，本方案无需对线虫或细胞样品进行手动匀浆。在 DNA 分离过程中，产量高度依赖于对有机相（粉红色层）回收的熟练程度。最后，为了改善蛋白质在分离过程中的溶解性，可能需要增加复溶缓冲液的体积，或添加除 SDS 以外的其他去垢剂。实际上，来自仅含成虫的线虫群体的蛋白质，相比包含成虫、幼虫和卵的混合群体，更容易复溶。

总体而言，采用本方案可实现生物分子分离的整合方法，有助于准确解读从不同样本中分别提取生物分子时可能出现的 mRNA 水平与蛋白质水平之间的相关性或非相关性。使用该方法可帮助科研人员正确识别 mRNA 翻译为蛋白质的过程不具相关性的案例，进而推动在不同条件下对转录后和翻译后调控机制的深入研究。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

L.R.L. 获得了美国国立卫生研究院衰老研究所（NIH/NIA）基金（R00 AG042494 和 R01 AG051810）、 Glenn衰老研究基金会医学研究奖以及美国衰老研究联合会青年教员基金的资助。作者感谢Anita Kumar和Shi Quan Wong在撰写本手稿过程中提供的有益反馈。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4–15% Mini-PROTEAN® TGX 免染色™ 蛋白质凝胶伯乐（Bio-Rad）4568084
抗体：
CePAS7-sDHSB- 爱荷华大学
CeTAC1-sDHSB- 爱荷华大学
DLG1-sDHSB- 爱荷华大学
GRP78Novus BioNBp1-06274
HRP 标记的山羊抗小鼠Li-Cor926-80010
HRP标记山羊抗兔IgGLi-Cor92680011
HSP60-sDHSB- 爱荷华大学
LMP1-sDHSB- 爱荷华大学
MRP-1Abcamab24102
神经连接蛋白 3Abcamab172798
β-肌动蛋白MilliporeMAB1501R
ChemiDoc MP 成像系统伯乐（Bio-Rad）
氯仿FisherC298-500健康危害，刺激性，有毒
考马斯亮蓝赛默飞世尔科技20279
DC 蛋白测定伯乐（Bio-Rad）500-0116
Epoch 2 微孔板读数仪BioTek
乙醇（200 proof）Fisher04-355-223易燃，健康危害
HeLa细胞ATCCCCL-2BSL2
iScript 逆转录超级混合液伯乐（Bio-Rad）1708840
海德拉微量分配器：Matrix HydraRobbins/ThermoFisher
异丙醇FisherA516-4易燃，健康危害
M9 缓冲液:
3 g KH2PO4
6 g Na2HPO4
5 g NaCl
加入 H20 至 1 升。通过高压灭菌进行灭菌。
待溶液冷却后，加入 1 mL 无菌 1 M MgSO₄4
Laemmli 样品缓冲液（2x）伯乐（Bio-Rad）161-0737
NanoDrop OneThermoSci
PAGE 电泳装置伯乐（Bio-Rad）
Ponceau SAlfa AesarJ60744
引物IDT25 nmole DNA 寡核苷酸，标准脱盐
dlg-1：F（5'-GGTCCTACCA
GGCAGTTGAG-3'
R（5'-CACGTCCGTT
AACCTCTCCC-3'
hsp-4：F（5'-AGAGGGCTTT
GTCAACCCAG-3'
R（5'-TCGTCAGGGT
TGATTCCACG-3'
hsp-70：正向引物（5'-CGGCATGTGA
ACGTGCTAAG-3'
R（5'-GAGCAGTTGA
GGTCCTTCCC-3'
hsp-60：F（5'-ATTGAGCAAT
CGACGAGCGA-3'
R（5'-CAACACCTCC
TCCTGGAACG-3'
lmp-1：F（5'-ACAACAACAC
CGGACTCACG-3'
R（5'-ATCGAGCTCC
CACTCTTTGG-3'
tac-1：F（5'-AGTGGCAGGC
AAAGTTCCTC-3'
R（5'-TGAGCACCTT
GATCTCGTCG-3'
pas-7：F（5'-GTACGCTCAA
AAGGCTGTCG-3'
R（5'-CTGAATCGGC
ATTGGCTCAC-3'
mrp-1：F（5'-TTTGCCTTGC
GCTTGTTCTG-3'
R（5'-AGTTCCAGTG
CGGAGCATAC-3'
F07C4.12：F（5'-TGCTGAGCAT
GAAGGACTGT-3'
R（5'-TGGCAATAGC
TCCTCCGTTG-3'
HK 肌动蛋白：F（5'-CTACGAACTT
CCTGACGGACAAG-3'
R（5'-CCGGCGGACT
CCATACC-3'
HK cyn-1：F（5'-GTGTCACCAT
GGAGTTGTTC-3'
R（5'-TCCGTAGATT
GATTCACCAC-3'
HK nhr-23：F（5'-CAGAAACACT
GAAGAACGCG-3'
R（5'-CGATCTGCAG
TGAATAGCTC-3'
HK ama-1：F（5'-TGGAACTCTG
GAGTCACACC-3'
R（5'-CATCCTCCTT
CATTGAACGG-3'
HK cdc-42：F（5'-CTGCTGGACA
GGAAGATTACG-3'
R（5'-CTCGGACATT
CTCGAATGAAG-3'
HK pmp-3: F (5'-GTTCCCGTGT
TCATCACTCAT-3'
R（5'-ACACCGTCGA
GAAGCTGTAGA-3'
LightCycler 96 qPCR 仪器罗氏
RIPA缓冲液10 mM Tris-Cl (pH 8.0)
1 mM EDTA
1% Triton X-100
0.2% SDS
140 mM NaCl
每 20 mL 加入 1 片 Roche 蛋白酶抑制剂
SsoAdvanced Universal SYBR SupermixBIORAD1725274
SuperSignal West Femto 最高灵敏度底物赛默飞世尔科技34095
Trans-Blot 转膜装置伯乐（Bio-Rad）
Trans-Blot Turbo 转膜试剂盒伯乐（Bio-Rad）170-4159
TRIzol试剂Invitrogen15596026健康危害（皮肤、眼睛）
线虫品系：秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC）
N2（野生型）秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC）
eat-2 (MAH95)秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC）
rsks-1 (VB633)秀丽隐杆线虫遗传学中心（Caenorhabditis Genetics Center, CGC）

参考文献

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