转基因 lck:eGFP 斑马鱼在T淋巴细胞中高表达GFP，已被用于研究T细胞发育及急性淋巴细胞白血病。该品系也可用于研究B细胞，因为B细胞以较低水平表达lck。本方案描述了从lck:eGFP斑马鱼中纯化恶性与非恶性B细胞的方法。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
从 lck:eGFP 斑马鱼中分离恶性与非恶性B细胞
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
斑马鱼（Danio rerio）是研究淋巴细胞发育的有力模型。与哺乳动物类似，D. rerio 具有包含B细胞和T细胞的适应性免疫系统。由于目前普遍缺乏识别 D. rerio 细胞表面标志物的抗体，对斑马鱼淋巴细胞生成的研究较为困难，这使得包括B系细胞在内的不同淋巴细胞群体的分离与鉴定变得复杂。为克服这一挑战，通常使用带有谱系特异性荧光蛋白表达的转基因品系。转基因品系 lck:eGFP 已被用于研究 D. rerio T细胞的发育，并被应用于T细胞发育及T细胞急性淋巴母细胞白血病（T-ALL）的建模。尽管 lck:eGFP 斑马鱼已被广泛用于T系细胞分析，但尚未用于B细胞的研究。最近，我们发现许多斑马鱼B细胞也表达 lck，尽管表达水平较低。因此，lck:eGFP B细胞同样表现出低水平的GFP表达。基于这一发现，我们开发了一种从 lck:eGFP 斑马鱼中纯化B系细胞的方案，本文对此进行报道。本方法描述了如何利用荧光激活细胞分选仪（FACS）从 lck:eGFP 斑马鱼或相关品系（如双转基因 rag2:hMYC; lck:eGFP 斑马鱼）中纯化B细胞。在这些品系中，B细胞（尤其是未成熟B细胞）以较低但可检测的水平表达GFP，从而可与高表达GFP的T细胞区分开来。B细胞可从骨髓、胸腺、脾脏、血液或其他组织中分离。本方案提供了一种新的方法用于纯化 D. rerio B细胞，有助于开展针对B细胞发育及B淋巴细胞恶性肿瘤等主题的研究。
引言
斑马鱼具有多种显著优势，例如可进行遗传操作、繁殖力高、身体透明且发育迅速，这些特性有助于利用遗传学方法研究脊椎动物的发育过程。这些优势，加上硬骨鱼类与哺乳动物在造血过程中的共同特征，使得D. rerio成为研究淋巴细胞生成及其功能的理想模型，可从幼体最早出现淋巴细胞阶段一直延续至成体阶段进行活体分析。斑马鱼的血液发育依赖于与哺乳动物高度保守且共有的遗传机制，这些机制同样延伸至适应性免疫系统。此外，调控淋巴系发育的分子机制在斑马鱼与哺乳动物之间也表现出显著的保守性1。
在过去的20年中，转基因 D. rerio 已构建出可标记特定血细胞谱系及这些谱系缺陷型突变体品系的果蝇品系2,3,4,5其中一个，即 lck:eGFP 转基因品系，使用斑马鱼淋巴细胞蛋白酪氨酸激酶（lck) 启动子以驱动 GFP 表达6该基因在T系前体细胞和成熟T淋巴细胞中均高表达，可用于体内追踪胸腺T细胞发育过程，以及通过流式细胞术对T系细胞进行体外分离纯化。7此前，我们利用该品系进行正向遗传学ENU诱变筛选，以鉴定易发生T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）的生殖系突变体，并研究与T细胞肿瘤发生相关的体细胞获得性遗传事件8,9.
最近，我们的实验室进一步拓展了其应用范围 lck:eGFP 斑马鱼。在双转基因 rag2:hMYC （人 MYC）， lck:eGFP D. rerio 已知会发展为T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）的 10，我们发现B系ALL也会发生11与该模型中的T-ALL因高表达GFP而发出明亮荧光不同，B-ALL由于GFP表达水平较低而荧光微弱，因此可通过荧光显微镜在整体上将患有B-ALL的斑马鱼与患有T-ALL的斑马鱼区分开来。这种GFP表达的差异也有助于分离GFPlo GFP来源的B-ALL细胞你好 使用流式细胞术分选T-ALL细胞11此外，较低的 lck 表达并非斑马鱼B-ALL所特有，因为人类B-ALL也表达低水平的 LCK11,12同样，正常的B系细胞 D. rerio，小鼠和人类也表达低水平的 lck/Lck/LCK，其中未成熟B细胞的表达水平最高11,13以单个细胞计，B系细胞在 lckeGFP 斑马鱼或其衍生品系表达的GFP量仅为T淋巴细胞的1-10%。这些GFPlo 细胞表达特征性的B细胞mRNA，例如 pax5, cd79b, 空白, btk, ighm, ighz以及其他来源，可从骨髓、胸腺、脾脏或外周血中纯化11因此，可从B系和T系细胞中分离出 lckeGFP 斑马鱼，以及在以下情况中 rag2hMYC, lckeGFP 动物、B-和T-ALL细胞等11.
在此，我们介绍一种高效通过FACS从非恶性B细胞中进行纯化的实验方案 lck:eGFP 斑马鱼，以及非恶性或恶性B细胞 rag2hMYC;lck:eGFP 鱼类，使用多种来源组织。若需要，此类细胞也可通过流式细胞术进行定量分析，而无需进行FACS分离。低水平的发现 lck 表达水平较低——从而导致B细胞中GFP表达量较低——为实验研究开辟了新的可能性 lckeGFP 斑马鱼，例如 体内 B细胞发育研究。因此，这一转基因品系自2004年首次报道以来，正被重新用于探索斑马鱼适应性免疫的新见解。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有涉及斑马鱼的实验程序均经俄克拉荷马大学健康科学中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。
1. 从转基因 lck:eGFP 鱼中分离非恶性B和T淋巴细胞
- 使用含有0.02%三卡因（MS-222）的养殖水对鱼类进行麻醉。
- 检查2–6月龄的鱼类是否存在荧光性胸腺，该器官位于斑马鱼及其他硬骨鱼类鳃腔的背内侧区域14。使用落射荧光显微镜（激发波长470/40，发射滤光片525/50）检测GFP信号。
- 提前准备50 mL经滤膜灭菌的1×罗斯韦尔公园纪念研究所培养基（RPMI），其中含1%胎牛血清和1%青霉素-链霉素（分选培养基）。未使用的分选培养基可在4 °C保存最多2个月。
- 将鱼置于含有0.2%三卡因的烧杯中约5分钟，随后浸入冰浴中以实施安乐死。通过观察鳃盖（鳃）运动是否停止来确认死亡。
- 将已安乐死的鱼置于培养皿中，在荧光显微镜下分离GFP+胸腺14，在明场显微镜模式下分离肾髓和脾脏15。本文所示结果来自3月龄鱼。淋巴细胞比例及绝对数量随年龄和基因型而异（详见讨论部分）。
- 将每份分离的器官放入含有500 µL冷分选培养基的1.5 mL离心管中。
- 使用研杵式微型匀浆器在冰上对组织进行匀浆处理。
- 将匀浆后的组织通过35 µm细胞筛，制备单细胞悬液。处理期间保持细胞处于冰上，直至分析。
2. 从双转基因 rag2:hMYC;lck:eGFP 斑马鱼 中分离恶性淋巴细胞
- 从2-4个月龄开始，使用显微镜对rag2:hMYC; lck:eGFP 鱼进行异常GFP模式的检测。
注意：在lck:eGFP 背景下，B细胞的GFP表达水平较低（GFPlo），因此识别B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）需要一定经验；而T细胞GFP表达水平高（GFPhi），故T-ALL易于识别。因此，rag2:hMYC 与 lck:eGFP 双转基因品系表现出两种表型：荧光强烈的T-ALL（通常起源于胸腺并扩散至身体其他部位）和荧光微弱的B-ALL。- 使用荧光显微镜，以“低曝光”设置（200 ms，2.4倍增益）筛查明亮的T-ALL（图1A），以“高曝光”设置（1.5 s，3.4倍增益）识别微弱的B-ALL（图1A）。野生型对照鱼和白血病前期鱼仅在胸腺区域显示GFP信号（图1B）。
- 按照步骤1.1–1.2所述方法麻醉并检查鱼类。
- 根据GFP荧光的扩散程度，将鱼类分为三个简单类别：
注意： 1级：荧光表现为局限于胸腺的肿瘤，仅有局部轻微扩散。
2级：荧光超出胸腺范围，累及<50%的身体区域。
3级：荧光扩散超过身体50%以上的区域。 - 将患有急性淋巴细胞白血病（ALL）的鱼与无癌症的鱼分离开。每月监测一次白血病前期鱼（即无GFP+肿瘤的鱼），观察是否新发ALL。约至9个月龄时，所有rag2:hMYC、lck:eGFP 鱼均会发展出T-ALL、B-ALL或两者兼有。
- 为分离T-或B-ALL细胞，应选择3级鱼（ALL累及>50%身体区域），此类鱼可获得超过2 × 106个ALL细胞，通常数量更多。
- 按照步骤1.4的方法实施安乐死。
注意： 获取ALL细胞有两种方法：全身体匀浆法和腹腔冲洗法16。这两种方法在可收集的细胞绝对数量上存在差异，因而影响流式分选（FACS）所需时间及成本（详见讨论部分）。 - 无论采用哪种方法，首先将已安乐死的鱼置于培养皿中，使用刀片切除包含胸腺区域的头部。如需要，可单独处理该部分，或用于组织学染色。
- 腹腔冲洗法
- 使用P1000移液器，以500 µL冷的分选培养基冲洗鱼的腹腔，将细胞与培养基收集至5 mL离心管中。
- 更换新的移液器吸头，向体腔内再注入200–300 µL冷的分选培养基。然后用移液器吸头轻轻按压鱼体，促使细胞从体腔中排出。收集液体并加入5 mL离心管中。
- 重复步骤2.8.2共2–3次。将收集的细胞置于分选培养基中，并在冰上保存。
- 在进行流式细胞术/FACS分析前，将细胞悬液通过35 µm孔径的滤网过滤，并在分析前始终保持细胞处于冰上。
- 全身体匀浆法
- 切除鱼头后，将鱼体放入含有200 µL分选培养基的1.5 mL离心管中。
- 使用微型研磨杵在离心管中匀浆鱼体组织。
- 加入额外的300 µL冷分选培养基。将细胞悬液通过35 µm孔径滤网过滤。根据需要添加分选培养基，冲洗所有细胞通过滤网，直至滤网上仅剩组织残渣。细胞在分析前需保持在冰上。
3. 正常或恶性B淋巴细胞的流式细胞分析
- 根据制造商指南设置流式细胞术分析和/或荧光激活细胞分选（FACS）参数。
- 获取所需数量的事件以初步表征样本。在分选前分析 1 × 104 至 5 × 104 个事件，以确定后续分选步骤的特定门控范围。
- 确定门控：使用前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）参数定义淋巴细胞和前体细胞门控，排除细胞碎片（图 2A-C）17。FSC 和 SSC 分别对应于细胞大小/直径和颗粒度。
注意：GFP-、GFPlo 和 GFPhi 细胞在 GFP 荧光强度上相差 10 至 100 倍，因此这些群体的分离较为直接（图 2-5）。此时可使用碘化丙啶（PI）或 7-氨基放线菌素 D（7-AAAD）进行活/死细胞鉴别染色。先前使用 PI 的实验通常显示，FACS 分选后 GFP+ 细胞的存活率超过 >95%。 - 根据所用 FACS 仪器的参数排除细胞双联体。
- 在淋巴系和/或前体细胞门控范围内，确定 GFP+ 细胞的数量和百分比。
- 确定门控：使用前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）参数定义淋巴细胞和前体细胞门控，排除细胞碎片（图 2A-C）17。FSC 和 SSC 分别对应于细胞大小/直径和颗粒度。
- 利用藻红蛋白（PE）和 GFP 荧光强度，设定 GFP-、GFPlo 与 GFPhi 细胞的门控。
注意：在 lck:eGFP 转基因小鼠品系中，B 细胞表现出较弱的 GFP 荧光，而 T 细胞则显示较强的 GFP 荧光。许多淋巴器官或肿瘤样本中均含有这两种 GFP+ 群体。B 系细胞/B-ALL 为 GFPlo，T 系细胞/T-ALL 为 GFPhi。应设定门控以区分 GFP-、GFPlo 和 GFPhi 细胞，并分别收集这些细胞群体（图 2A-C、图 3A-C、图 4A 和 图 5A）。 - 将各细胞群体分选至不同的含有 2 mL 分选培养基的 15 mL 聚丙烯管中，或直接分选至含有适当缓冲液的不同 1.5 mL 管中，用于后续分析（如 RNA、DNA 或蛋白质提取、异体移植等）。
- 在进行进一步分析前，将纯化的细胞置于冰上保存。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
我们采用流式细胞术分析并利用荧光激活细胞分选技术分离GFPlo 和 GFP你好 胸腺、肾髓质和脾脏的细胞 lck:eGFP 转基因斑马鱼。对3个月大的鱼进行分析发现，胸腺主要含有GFP+ 淋巴细胞。GFP+ 细胞主要局限于Traver等人先前描述的淋巴细胞门区域。17两种不同的GFP+ 种群，GFPlo和 GFP你好,能 可在胸腺中观察到GFP你好 淋巴细胞所占比例较高，约为60%，而GFPlo 细胞数量较少，约占胸腺淋巴细胞总数的40%（表1）。与哺乳动物不同，鱼类的造血骨髓位于肾脏内，而非骨骼中。我们发现肾脏骨髓中定居的B细胞也表达低水平的GFP（图2B 和
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
我们开发并提供了一种从lck:eGFP转基因斑马鱼中分离B细胞的实验方案，从而将这一模型补充到其他带有B系标记的D. rerio模型中3,4。令人略感意外的是，自2004年该品系被报道以来，其中GFPlo B细胞的存在一直未被发现。通常认为lck是T细胞特异性的6，但近期研究发现自然杀伤细胞和髓系细胞中存在意外的lck表达，本文结果也显示B细胞中同样存在该表达18,19。与我们发现斑马鱼B细胞为GFPlo表型一致，人类的前B细胞、初始B细胞及成熟B细胞也均表达低水平的LCK11,13。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢Megan Malone-Perez在斑马鱼饲养方面提供的帮助，以及俄克拉荷马大学健康科学中心流式细胞术核心实验室的支持。本工作获得了资助 由现代希望之轮基金会、俄克拉荷马科学与技术发展中心（HRP-067）以及美国国立卫生研究院/国家普通医学科学研究所INBRE试点项目资助（P20 GM103447）。JKF 担任 E.L. & 儿童医院基金会资助的儿科血液学-肿瘤学Thelma Gaylord冠名主席
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 35 µm 网格滤膜 | Sefar Filter technology | 7050-1220-000-13 | |
| 带细胞筛帽的 5 mL 聚苯乙烯圆底管 | Falcon Corning Brand | 352235 | |
| 50 mL 锥形管 | VWR international | 525-0448 | |
| AZ APO 100 荧光显微镜 | Nikon | ||
| Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| DS-Qi1MC 相机 | Nikon | ||
| 氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（MS-222） | Sigma | E-10521 | |
| FACSJazz | BD Biosciences | ||
| 胎牛血清 | Thermo Fisher | 10437028 | |
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC | ||
| lck:eGFP | 参见 Langeneu 等，2004 | ||
| NIS Elements 软件 | Nikon | 版本 4.13 | |
| 青霉素-链霉素 | Sigma | P4333 | |
| 微型研磨管匀浆器 | Electron Microscopy Sciences | 64788-20 | |
| 塑料移液管 | |||
| rag2:hMYC-ER | 参见 Gutierrez 等，2011 | ||
| RPMI 1640 培养基（1x） | Life Technologies | 11835-030 |
参考文献
- Paik, E. J., Zon, L. I. Hematopoietic development in the zebrafish. International Journal of Developmental Biology. 54 (6-7), 1127-1137 (2010).
- Kasheta, M., et al. Identification and characterization of T reg-like cells in zebrafish. Journal of Experimental Medicine. 214 (12), 3519-3530 (2017).
- Liu, X., et al. Zebrafish B Cell Development without a Pre-B Cell Stage, Revealed by CD79 Fluorescence Reporter Transgenes. Journal of Immunology. 199 (5), 1706-1715 (2017).
- Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122 (8), e1-e11 (2013).
- Schorpp, M., et al. Conserved functions of Ikaros in vertebrate lymphocyte development: genetic evidence for distinct larval and adult phases of T cell development and two lineages of B cells in zebrafish. Journal of Immunology. 177 (4), 2463-2476 (2006).
- Langenau, D. M., et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of National Academy of Sciences U S A. 101 (19), 7369-7374 (2004).
- Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. The use of zebrafish to understand immunity. Immunity. 20 (4), 367-379 (2004).
- Frazer, J. K., et al. Heritable T-cell malignancy models established in a zebrafish phenotypic screen. Leukemia. 23 (10), 1825-1835 (2009).
- Rudner, L. A., et al. Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL. Oncogene. 30 (41), 4289-4296 (2011).
- Gutierrez, A., et al. Pten mediates Myc oncogene dependence in a conditional zebrafish model of T cell acute lymphoblastic leukemia. Journal of Experimental Medicine. 208 (8), 1595-1603 (2011).
- Borga, C., et al. Simultaneous B and T cell acute lymphoblastic leukemias in zebrafish driven by transgenic MYC: implications for oncogenesis and lymphopoiesis. Leukemia. , (2018).
- Haferlach, T., et al. Clinical utility of microarray-based gene expression profiling in the diagnosis and subclassification of leukemia: report from the International Microarray Innovations in Leukemia Study Group. Journal of Clinical Oncology. 28 (15), 2529-2537 (2010).
- Novershtern, N., et al. Densely interconnected transcriptional circuits control cell states in human hematopoiesis. Cell. 144 (2), 296-309 (2011).
- Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of the adult zebrafish. Toxicology Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- Pruitt, M. M., Marin, W., Waarts, M. R., de Jong, J. L. O. Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (37), (2017).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature Immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).
- Carmona, S. J., et al. Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types. Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).
- Tang, Q., et al. Dissecting hematopoietic and renal cell heterogeneity in adult zebrafish at single-cell resolution using RNA sequencing. Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 2875-2887 (2017).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
