类肠器官正在成为研究人类疾病的一种新型模型。本方案描述了如何利用从新生儿组织获得的类肠器官，通过脂多糖（LPS）处理来模拟人类坏死性小肠结肠炎的类肠器官模型。所获得的类肠器官表现出类似于人类坏死性小肠结肠炎的炎症变化。
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摘要
摘要
坏死性小肠结肠炎（NEC）是一种严重危害新生儿的疾病，其特征是人类肠道上皮发生多种病理生理改变，导致肠道通透性增加、上皮修复受损以及细胞死亡增多。尽管已有多种动物模型用于研究 NEC，但不同物种对损伤和治疗干预的反应可能存在显著差异。此外，直接在人体尤其是儿童中研究疾病病理生理机制或新型治疗药物在伦理上具有挑战性。因此，建立一种基于人体组织的新型 NEC 模型具有重要意义。肠类器官（enteroids）是由肠道上皮细胞衍生而来的三维类器官，非常适合研究复杂的生理相互作用、细胞信号传导以及宿主-病原体防御机制。本文描述了一种从接受肠切除手术患者中分离肠道干细胞后培养人源肠类器官的实验方案。隐窝细胞在含有促进其向人类肠道上皮固有各种细胞类型分化的生长因子的培养基中进行培养。这些细胞生长于一种合成的、富含胶原蛋白的蛋白质混合物中，该混合物作为支架模拟细胞外基底膜。由此形成的肠类器官具备顶-基底极性。在培养基中联合使用脂多糖（LPS）可诱导肠类器官产生炎症反应，导致其组织学、基因表达和蛋白质表达的改变，类似于人类 NEC 中所观察到的变化。利用人体组织构建的 NEC 实验模型可能为药物和治疗方法在进入人体试验前提供更准确的测试平台，从而助力我们寻找该疾病的治愈手段。
引言
人肠类器官是一种源自人类肠道组织样本中分离出的肠隐窝干细胞的体外三维培养系统。该突破性模型由Hans Clevers等人于2007年首次建立，其基础是发现了小鼠小肠隐窝中的Lgr5+干细胞1。他们的研究为建立可在无显著遗传或生理改变的情况下连续传代的多种细胞类型的体外肠道上皮培养体系奠定了基础2。自该发现以来，肠类器官已被用作研究正常消化生理功能以及肠道疾病（如炎症性肠病、宿主-病原体相互作用）和再生医学等领域的新模型2。
利用类肠器官（enteroids）作为研究肠道病理生理学的离体模型，相较于其他技术具有多项优势。过去几十年中，研究人员主要依赖动物模型和永生化的肠道癌来源细胞系来研究肠道生理学3,4,5。单细胞培养无法体现正常肠上皮中存在的多种细胞类型，因而缺乏细胞间的相互作用，以及在蛋白质表达、信号传导和病原体诱导疾病方面的肠段特异性6。类肠器官中的干细胞可分化为多种主要的上皮细胞类型，包括肠吸收细胞、潘氏细胞、杯状细胞、肠内分泌细胞等3。它们具有极....
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方案
已获得机构审查委员会批准（IRB #2013-15152），用于在芝加哥安和罗伯特·H·卢里儿童医院（伊利诺伊州芝加哥）进行肠切除术的患者的组织样本采集。所有实验方案均遵循机构及国家关于人类福祉的指南和法规。在所有情况下，样本采集前均须获得家长书面知情同意。
1. 试剂准备
- 准备用于完整组织采集的培养基储备液：1 L 达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）、110 mL 胎牛血清（FBS）、11 mL 青霉素-链霉素（终浓度 1%）和 1.1 mL 过滤除菌的胰岛素（终浓度 0.1%）。将储备液储存于 4 °C。
- 准备螯合缓冲液 #1：30 mL 培养基（如步骤 1.1 所述）、600 µL 0.5 M 乙二胺四乙酸（EDTA）（终浓度 10 mM）、300 µL 庆大霉素（终浓度 1%）和 60 µL 两性霉素 B（终浓度 0.2%）。将储备液储存于 4 °C。
- 准备螯合缓冲液 #2：30 mL 培养基（如步骤 1.1 所述）、300 µL 0.5 M EDTA（终浓度 5 mM）、300 µL 庆大霉素（终浓度 1%）和 60 µL 两性霉素 B（终浓度 0.2%）。将储备液储存于 4 °C。
- 准备人源类肠培养基：41.4 mL DMEM/F-12、5 mL FBS（终浓度 10%）、500 µL 青霉素-链霉素（终浓度 1%）、500 µL L-谷氨酰胺（终浓度 1%）、500 µL 庆大....
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结果
铺板后立即观察，新分离的肠隐窝呈细长杆状。数小时内，类肠体将变为圆形（图1a）。接下来的数天内，类肠体将开始形成球状结构，如图1b所示。出芽现象应在5至10天之间出现（图1c），此时应进行类肠体的收集。
生长中的肠类器官还会表现出极性，具有集中的管腔、顶膜边界和基底外侧区域（图2）。肠类器官也显示出结构完整性，表现为强健的肌动蛋白细胞骨架（图3）。在培养数天后，经LPS处理的肠类器官会经历更多的细胞凋亡，且产量低于对照组（
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讨论
这种新型的离体人肠道类器官模型为研究坏死性小肠结肠炎（NEC）中的肠道屏障功能障碍提供了一种有效的方法。本文所介绍的类器官处理方法改编自Misty Good博士、Michael Helmrath博士和Jason Wertheim博士先前的研究工作10,11,12。
整个组织采集及隐窝分离的时间安排是本方案中的关键步骤。组织必须在手术切除的同时立即采集，并在组织送达实验室后尽快进行隐窝分离处理。本模型选用年龄小于3个月的患者组织。如确有需要，组织采集后可在24小时内延迟处理。此外，人源组织样本的质量显著影响隐窝分离的得率。研究发现，无基础病理改变的健康小肠组织，尤其是来自较年轻患者（<2个月龄）的组织，可获得最佳结果。此外，应从切除标本中最健康的区域取材，通常选择远端部分。使用过大的肠段并不能提高隐窝分离效率，尤其是在本方案所述溶液用量条件下。长度约1-2 cm、重量为0.75-2.5 g的.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院糖尿病与消化及肾脏疾病研究所资助（K08DK106450）以及美国小儿外科协会 Jay Grosfeld 奖项对 C.J.H. 的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4% 多聚甲醛 | ThermoFisher | AAJ19943K2 | |
| A-83 | R&D Tocris | 2939/10 | |
| 两性霉素 B | ThermoFisher | 15290026 | |
| B-27 添加剂（不含维生素 A） | ThermoFisher | 17504-044 | |
| 基底膜基质（Matrigel） | Corning | CB-40230C | |
| DMEM/F-12 | ThermoFisher | MT-16-405-CV | |
| Dulbecco’s 改良伊格尔培养基（DMEM） | ThermoFisher | 11-965-118 | |
| Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液（DPBS） | ThermoFisher | 14190-144 | |
| 表皮生长因子（EGF） | Sigma | E9644-.2MG | |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | Sigma | EDS-500G | |
| 胎牛血清（FBS） | Gemini Bio-Pro | 100-125 | |
| 庆大霉素 | Sigma | G5013-1G | |
| GlutaMAX（L-谷氨酰胺） | ThermoFisher | 35050-061 | |
| 胰岛素 | Sigma | I9278-5mL | |
| [leu] 15-胃泌素 1 | Sigma | G9145-.1MG | |
| 脂多糖（LPS） | Sigma | L2630-25MG | |
| N-2 添加剂 | ThermoFisher | 17502-048 | |
| N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES） | ThermoFisher | 15630-080 | |
| N-乙酰半胱氨酸 | Sigma | A9165-5G | |
| 烟酰胺 | Sigma | N0636-100G | |
| Noggin | R&D Systems INC | 6057-NG/CF | |
| 青霉素-链霉素 | ThermoFisher | 15140-148 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma | P5368-5X10PAK | |
| RPMI 1640 培养基 | Invitrogen | 11875093 | |
| R-Spondin | PEPROTECH INC | 120-38 | |
| SB202190 | Sigma | S7067-5MG | |
| 组织处理凝胶（Histogel） | ThermoFisher | 22-110-678 | |
| Wnt3a | R&D Systems INC | 5036-WN-010 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503-1MG |
参考文献
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Zachos, N. C., et al. ....
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