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方法文章

小鼠鳞状细胞癌细胞黏膜内接种用于肿瘤免疫谱分析及治疗反应评估

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DOI：

10.3791/59195

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2019年4月22日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Radiation Oncology, University of Colorado Denver - Anschutz Medical Campus, 2Department of Anesthesiology, University of Colorado Denver - Anschutz Medical Campus, 3Division of Radiology, University of Colorado Denver - Anschutz Medical Campus

本文内容

摘要

本文介绍了一种可重复建立头颈部鳞状细胞癌小鼠原位模型的方法。所形成的肿瘤表现出与临床疾病相关的组织病理学特征，包括坏死、分化不良、淋巴结转移以及免疫细胞浸润。荷瘤小鼠出现与临床相关的症状，如吞咽困难、下颌移位和体重减轻。

摘要

头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是一种致残性强、致死率高的疾病，具有高复发率和治疗失败率。为了开发更有效的治疗策略，了解导致治疗耐药的肿瘤微环境因素至关重要。目前深入理解疾病机制并改进治疗手段的主要障碍之一，是缺乏能够模拟人类HNSCC侵袭性和转移性特征的小鼠细胞系。此外，大多数小鼠模型采用皮下移植肿瘤的方式，而这种方式缺乏头颈部区域的重要生理特征，包括高密度血管、丰富的淋巴管系统以及局部黏膜菌群。本研究旨在建立并表征一种HNSCC的原位模型。我们采用两种基因型不同的小鼠细胞系，并在小鼠颊黏膜建立肿瘤。我们优化了基于胶原酶的肿瘤消化方法，以实现从已形成肿瘤中高效回收单细胞。本文展示的数据表明，小鼠可形成高度血管化的肿瘤，并发生向区域淋巴结的转移。单细胞多参数质谱流式分析显示，肿瘤微环境中存在多种免疫细胞群体，其中髓系细胞占所有免疫细胞的大多数。本研究所提出的原位模型可用于癌症生物学、肿瘤免疫学以及新型治疗药物的临床前研发。该原位模型在临床特征上与人类疾病高度相似，将为提高转化研究水平和改善患者预后提供有力工具。

引言

头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是全球第五大常见恶性肿瘤，每年新诊断患者超过60万例1。尽管采用化疗联合放疗（RT）等积极治疗手段，但无高危型人乳头瘤病毒（HPV）感染的HNSCC患者5年总生存率（OS）仍低于50%2。这主要归因于其高度复杂的肿瘤微环境，因为肿瘤可起源于头颈部多个不同的解剖部位，包括颊黏膜、舌、口底、鼻腔、口腔、咽、口咽和下咽。此外，头颈部血供丰富，并含有全身近一半的淋巴结3。目前大多数关于头颈部肿瘤生物学的研究依赖于在小鼠 flank 区域建立的肿瘤模型。这类模型有助于研究肿瘤内在机制，但由于缺乏原生的头颈部微环境，其研究结果的转化潜力受到显著限制。一种曾用于诱导口腔肿瘤的方法是使用致癌物9,10-二甲基-1,2-苯并蒽（DMBA）4。然而，该方法耗时较长，仅能在大鼠和仓鼠中诱导肿瘤，无法在小鼠中实现，且所形成的肿瘤缺乏多数分化型鳞状细胞癌的组织学特征5,6。另一种引入的致癌物为水溶性喹啉酮衍生物4-硝基喹啉-1-氧化物（4-NQO），口服给药可在小鼠中诱导口腔肿瘤，但也存在暴露周期长（16周）、不同批次小鼠间成瘤率低且不稳定等问题7,8,9。为建立更具临床相关性的模型，多个研究团队采用了基因工程小鼠模型，通过操控关键驱动癌基因或抑癌基因（如TP53、TGFB、KRAS、HRAS和SMAD4）来模拟肿瘤发生10。这类模型有助于研究具有已知驱动基因的肿瘤，但无法完全模拟人类HNSCC复杂的异质性。

本研究中，我们展示了在小鼠体内进行鳞状细胞癌细胞黏膜内接种的可行性。接种后的细胞在注射后1周内即可发展为侵袭性肿瘤。与人类头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）相似，这些肿瘤会转移至区域淋巴结。我们对疾病的组织学和临床特征进行了表征，并深入解析了肿瘤免疫微环境。我们提出，该HNSCC原位模型可广泛应用于癌症生物学、肿瘤免疫学及临床前研究。免疫逃逸机制、肿瘤进展、治疗耐药性及转移等具有重要临床意义的研究领域，均可借助本模型进行探讨。

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方案

所有动物实验均按照科罗拉多大学丹佛分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案（方案编号 # 00250）进行。

1. 肿瘤细胞培养

注意：B4B8 和 LY2 细胞系用于建立原位 HNSCC 肿瘤模型：B4B8 肿瘤细胞来源于化学致癌物转化的黏膜角质形成细胞（来自 BALB/C 小鼠）11。LY2 肿瘤细胞则来源于自发转化的 BALB/C 角质形成细胞系（Pam 212）的淋巴结转移灶12,13。这两种细胞系均由美国德克萨斯州休斯顿市德克萨斯大学健康科学中心（UTHealth）的 Nadarajah Vigneswaran 博士惠赠。

  1. 使用添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 抗微生物试剂的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）F/12 进行细胞系传代培养。将这些细胞系置于 37 °C、5% CO2 的无菌培养箱中培养。细胞传代次数不得超过 15 代，以用于接种。
  2. 在 175 cm2 细胞培养瓶中接种 2 × 106 至 4 × 106 个细胞。
    注意：确保细胞融合度低于 90%，以避免诱导应激反应。
  3. 当细胞融合度达到 70% 时（约 48 小时），从培养箱中取出培养瓶，用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞 3 次。
  4. 使用 0.25% 胰蛋白酶消化细胞使其从瓶壁脱落，用量以覆盖培养瓶表面为宜。
    1. 操作时，在含有 70% 融合度细胞的 175 cm2 培养瓶中加入 4 mL 胰蛋白酶。将细胞在 37 °C、5% CO2 的细胞培养箱中孵育 3–4 分钟。
    2. 在显微镜下观察细胞，确认细胞已完全脱落。
    3. 加入 12 mL 含 FBS 的 DMEM F/12 培养基以中和胰蛋白酶活性。
  5. 将细胞悬液吸出并转移至 50 mL 圆底离心管中。
  6. 通过上下倒置 3–4 次混匀细胞悬液。
  7. 可选：取 10 µL 细胞悬液与 10 µL 台盼蓝混合于微量离心管中，使用血细胞计数板进行细胞计数。通过从总细胞数中减去台盼蓝染色阳性细胞数，再除以总细胞数，计算细胞活力。
  8. 在 4 °C 条件下，以 300 × g 离心 5 分钟。
  9. 用无血清、无抗生素的 DMEM 培养基重悬细胞，调整体积使每 50 µL 培养基中含有 1 × 106 个细胞。
    注意：根据体内细胞系的侵袭性（通过实验确定），每只小鼠每个注射位点接种 1 × 106 个细胞适用于 B4B8 和 LY2 细胞。
  10. 将含有细胞悬液的离心管置于冰上。
  11. 将预先解冻的基底膜基质置于冰上。
    注意：基底膜基质已在 4 °C 条件下过夜解冻。

2. 小鼠细胞注射

  1. 准备细胞与基底膜基质的1:1混合液（各50 µL）。
  2. 先加入细胞，然后缓慢用移液器加入基底膜基质，避免引入气泡。确保在动物注射前立即配制该混合液。若将细胞在基底膜基质中放置过长时间，会导致细胞在混合液中沉降，从而难以充分混匀，这将导致小鼠间肿瘤大小出现较大差异。
  3. 轻柔混匀。所有涉及基质的操作均需在冰上进行，因为基底膜基质在室温下会聚合。
  4. 准备用于接种的注射器。
  5. 用100 µL的细胞/基底膜基质混合液填充0.5 mL胰岛素注射器（23 G）。
  6. 将注射器置于冰上，以防止基底膜基质发生聚合。
  7. 将小鼠放入含异氟烷和氧气（2.5%）的麻醉 chamber 中进行麻醉。
  8. 在实施注射前，确认小鼠已深度麻醉（通过脚趾夹捏无反应来判断）。
  9. 将针头插入右侧或左侧颊部区域，操作时通过口腔两侧的开放空间进行。
  10. 确保小鼠舌头不在针头路径上。
    注意：操作中容易刺伤舌头，可能导致舌部肿瘤形成。如有必要，将舌头移至对侧。
  11. 在口腔内操作时，保持注射器与颊部区域平行。
  12. 准备注射时，先将注射器稍向后拉，然后以10°角缓慢插入。
  13. 在5秒内缓慢注入100 µL的细胞/基底膜基质悬浮液。
  14. 注射完成后，保持注射器原位再停留5秒，以确保所有液体完全注入。
    注意：对于对照组非成瘤小鼠，注入无肿瘤细胞的无血清培养基与基质的混合液（如上所述）。
  15. 轻柔地拔出注射器。
  16. 对剩余小鼠重复上述操作。
  17. 等待约1周，直至肿瘤明显出现（B4B8和LY2细胞的肿瘤体积约为50–200 mm3）。

3. 小鼠监测

  1. 在肿瘤细胞接种后1周，使用游标卡尺进行首次测量。为利用外部游标卡尺计算肿瘤体积，需测定最大纵向直径（长度）和最大横向直径（宽度），并采用改良的椭球公式14,15。
    肿瘤体积公式，V=1/2(长度×宽度²)，用于估算肿瘤大小的数学方程。
  2. 继续定期使用游标卡尺测量肿瘤体积（每周1至2次，保持固定间隔）。
  3. 测量动物体重，以评估肿瘤生长对摄食的影响。

4. 收集肿瘤组织

  1. 当达到实验终点时，采用适当方法处死动物（例如，CO₂2 窒息、断头或颈椎脱位
    注意： 在本研究中，若小鼠进入濒死状态（体重减轻 >初始体重减少15%、缺乏理毛行为、恶病质）和/或肿瘤大小达到1,000 mm³3.
  2. 从颈部中线开始做一长切口，以启动动物解剖。
    1. 使用钝头镊子夹住皮肤，用锋利的剪刀剪开皮肤。
  3. 将剪刀轻轻插入覆盖肿瘤的皮肤下方，通过横向和深入皮肤推动剪刀来制造气腔。
  4. 当皮肤与肿瘤充分分离后，辨认引流淋巴结（DLNs）并将其切除，以避免淋巴结组织混入肿瘤样本中造成干扰。
    注意： 较大的肿瘤可能达到和/或覆盖深部淋巴结（DLN）。根据所进行检测的类型，完整淋巴结的分离至关重要，以避免免疫细胞溢出至肿瘤组织中，否则将导致检测结果出现偏差。
  5. 沿肿瘤边界切开，直至整个瘤体完全分离。

5. 肿瘤组织处理以用于后续应用

  1. 为后续组织学检查，将肿瘤置于室温下的10%福尔马林中。为避免过度固定，需将福尔马林替换为70%乙醇。如需进行流式细胞术分析，请按以下步骤处理肿瘤。
    注意：组织可在福尔马林中保存72小时，某些染色类型在此时间内通常不会因过度固定而受影响。
  2. 使用无菌剃刀片或锋利的剪刀将肿瘤切成1–2 mm大小的组织块。
  3. 将切好的肿瘤组织块放入50 mL锥形管中，加入胶原酶III（每样本4,250单位）、DNase I（每样本0.1 mg）和胰蛋白酶抑制剂（每样本1 mg）。
  4. 在37 °C孵育30分钟，每隔10分钟振荡一次。
    注意：可将样本置于可密封袋中，用90%乙醇消毒后，放入细胞培养孵箱中。
  5. 30分钟后，加入20 mL Hank's平衡盐溶液（HBSS），以300 x g离心5分钟。
    注意：HBSS由氯化钾、氯化钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和葡萄糖组成。
  6. 弃去上清液，将沉淀物重悬于2–3 mL红细胞（RBC）裂解缓冲液中，充分吹打混匀。
    注意：RBC裂解缓冲液由氯化铵、碳酸氢钠和磷酸氢二钠组成。
  7. 在室温下孵育2分钟。
    注意：孵育时间过长可能对其他细胞群体产生毒性。
  8. 加入20 mL HBSS以中和裂解缓冲液的作用。
  9. 以300 x g离心5分钟，弃去上清液。
  10. 将沉淀物重悬于10 mL HBSS中。
  11. 将细胞悬液通过70 µm尼龙滤网过滤，再以300 x g离心5分钟，弃去上清液。
  12. 重复步骤5.8–5.10，并将细胞悬液通过40 µm尼龙滤网过滤，以确保去除所有残留碎片。

6. 细胞染色与数据采集

  1. 用 1 mL HBSS 重悬细胞沉淀。
  2. 使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数，方法如步骤 1.7 所述。
  3. 确定总细胞数及染色所需的适当浓度。
    注意：    流式细胞术染色的理想细胞浓度为每样本 100 万至 200 万个细胞。例如，若在 96 孔板中进行染色且共有 1000 万个细胞，则将样本重悬于 1 mL 体积中，并每孔加入 100 µL，以实现每孔 100 万个细胞。
  4. 加入 Fc 封闭抗体（CD16/CD32），终浓度为 1:100，以防止免疫球蛋白非特异性结合至 FcγIII 和 FcγII 受体。室温孵育 5 分钟。
    1. 离心后，将细胞沉淀重悬于 100 µL 流式细胞术细胞染色缓冲液中（含 5% FBS、2% EDTA 和 1% HEPES 的生理盐水溶液）。
  5. 根据试剂供应商提供的说明进行细胞表面染色（以适当稀释比例加入各抗体）。室温孵育 60 分钟。
    1. 离心后，将细胞沉淀用 100 µL HBSS 重悬，重复洗涤两次，以去除未结合的过量抗体。
  6. 将样本上机至适当的流式细胞仪进行检测。
    1. 若需分析细胞内标志物（如 foxp3），则按照试剂供应商的说明进行细胞通透化处理及染色。

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结果

体外评估LY2和B4B8细胞增殖结果显示，两种细胞系的倍增时间相似（分别为21小时和23小时）。在体内，两种细胞系均在接种后1周内形成单一、可见且可触及的肿块。图1A）。在携带LY2肿瘤的小鼠中，由于肿瘤负荷，颌骨在3周时发生移位（图1A）。未接受肿瘤细胞的对照小鼠如预期未形成肿瘤。与B4B8肿瘤相比，LY2肿瘤生长速度更快。在接种肿瘤细胞第21天，LY2荷瘤小鼠的平均肿瘤体积为632 ± 10 mm3 与 162 ± 4 mm 相比3 在 B4B8 肿瘤中（图1B）。由于吞咽困难，出现下颌脱位的小鼠迅速出现体重下降图1C）。体重显著减轻的小鼠定义为 >初始体重的15%和/或肿瘤体积 >1 cm3 在记录到相关观察结果后1天内实施了安乐死。LY2小鼠的中位生存...

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讨论

对肿瘤微环境进行严格分析和表征是理解肿瘤发生、发展及转移机制并开发有效治疗策略的重要途径。头颈部癌症是一种复杂的疾病，可起源于头颈部区域内的多个解剖部位。目前深入理解疾病机制并改进治疗手段的主要障碍之一，是缺乏能够模拟人类头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）侵袭性和转移性特征的小鼠细胞系。此外，现有的多种小鼠模型采用皮下移植成瘤的方式，而该方法缺失了头颈部区域重要的生理特征，包括高密度的血管系统、发达的淋巴管网络以及局部定植的黏膜菌群。

在本研究中，我们表征了一种小鼠头颈部鳞状细胞癌的原位模型。我们选择颊黏膜作为肿瘤接种部位，原因有多个：该区域易于接触，无需影像引导；可使用游标卡尺评估肿瘤生长；肿瘤位于黏膜菌群环境中；存在周围淋巴管；且实验可重复性高。尽管将细胞注射至颊黏膜操作简便，但针头的定位和穿刺深度至关重要，需防止穿透皮肤或将细胞注入皮下组织。我们建议从口腔内进针，使针头与颊部区域完全平行，在准备注射时倾斜角度不超过10°。

我们所使用的细胞系为小鼠细胞系，可植入其来源品系的免疫健全小鼠体内。文献中已研究过39种以上头颈部鳞状...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
胶原酶IIIWorthington Biochemical Corp.LS004183
脱氧核糖核酸酶I（DNase I）Worthington Biochemical Corp.LS006328
Fc阻断剂（CD16/32）BD Biosciences553141 克隆株 2.4G2 
流式细胞术染色缓冲液eBioscience00-4222-26
赫姆斯平衡盐溶液（HBSS）ThermoFisher Scientific14175079无钙、无镁、无酚红
Helois质谱流式细胞仪FluidigmNA
基质胶膜基质Corning CB-40234B
磁共振成像扫描仪（MRI Scanner）BrukerNA7.4 特斯拉
红细胞裂解缓冲液BioLegend420301
胰蛋白酶抑制剂Worthington Biochemical Corp.LS002830

参考文献

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