小鼠鳞状细胞癌细胞黏膜内接种用于肿瘤免疫谱分析及治疗反应评估

摘要

本文介绍了一种可重复建立头颈部鳞状细胞癌小鼠原位模型的方法。所形成的肿瘤表现出与临床疾病相关的组织病理学特征，包括坏死、分化不良、淋巴结转移以及免疫细胞浸润。荷瘤小鼠出现与临床相关的症状，如吞咽困难、下颌移位和体重减轻。

摘要

头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是一种致残性强、致死率高的疾病，具有高复发率和治疗失败率。为了开发更有效的治疗策略，了解导致治疗耐药的肿瘤微环境因素至关重要。目前深入理解疾病机制并改进治疗手段的主要障碍之一，是缺乏能够模拟人类HNSCC侵袭性和转移性特征的小鼠细胞系。此外，大多数小鼠模型采用皮下移植肿瘤的方式，而这种方式缺乏头颈部区域的重要生理特征，包括高密度血管、丰富的淋巴管系统以及局部黏膜菌群。本研究旨在建立并表征一种HNSCC的原位模型。我们采用两种基因型不同的小鼠细胞系，并在小鼠颊黏膜建立肿瘤。我们优化了基于胶原酶的肿瘤消化方法，以实现从已形成肿瘤中高效回收单细胞。本文展示的数据表明，小鼠可形成高度血管化的肿瘤，并发生向区域淋巴结的转移。单细胞多参数质谱流式分析显示，肿瘤微环境中存在多种免疫细胞群体，其中髓系细胞占所有免疫细胞的大多数。本研究所提出的原位模型可用于癌症生物学、肿瘤免疫学以及新型治疗药物的临床前研发。该原位模型在临床特征上与人类疾病高度相似，将为提高转化研究水平和改善患者预后提供有力工具。

引言

头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是全球第五大常见恶性肿瘤，每年新诊断患者超过60万例¹。尽管采用化疗联合放疗（RT）等积极治疗手段，但无高危型人乳头瘤病毒（HPV）感染的HNSCC患者5年总生存率（OS）仍低于50%²。这主要归因于其高度复杂的肿瘤微环境，因为肿瘤可起源于头颈部多个不同的解剖部位，包括颊黏膜、舌、口底、鼻腔、口腔、咽、口咽和下咽。此外，头颈部血供丰富，并含有全身近一半的淋巴结³。目前大多数关于头颈部肿瘤生物学的研究依赖于在小鼠 flank 区域建立的肿瘤模型。这类模型有助于研究肿瘤内在机制，但由于缺乏原生的头颈部微环境，其研究结果的转化潜力受到显著限制。一种曾用于诱导口腔肿瘤的方法是使用致癌物9,10-二甲基-1,2-苯并蒽（DMBA）⁴。然而，该方法耗时较长，仅能在大鼠和仓鼠中诱导肿瘤，无法在小鼠中实现，且所形成的肿瘤缺乏多数分化型鳞状细胞癌的组织学特征^5,6。另一种引入的致癌物为水溶性喹啉酮衍生物4-硝基喹啉-1-氧化物（4-NQO），口服给药可在小鼠中诱导口腔肿瘤，但也存在暴露周期长（16周）、不同批次小鼠间成瘤率低且不稳定等问题^7,

方案

所有动物实验均按照科罗拉多大学丹佛分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案（方案编号 # 00250）进行。

1. 肿瘤细胞培养

注意：B4B8 和 LY2 细胞系用于建立原位 HNSCC 肿瘤模型：B4B8 肿瘤细胞来源于化学致癌物转化的黏膜角质形成细胞（来自 BALB/C 小鼠）¹¹。LY2 肿瘤细胞则来源于自发转化的 BALB/C 角质形成细胞系（Pam 212）的淋巴结转移灶^12,13。这两种细胞系均由美国德克萨斯州休斯顿市德克萨斯大学健康科学中心（UTHealth）的 Nadarajah Vigneswaran 博士惠赠。

1. 使用添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 抗微生物试剂的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）F/12 进行细胞系传代培养。将这些细胞系置于 37 °C、5% CO₂ 的无菌培养箱中培养。细胞传代次数不得超过 15 代，以用于接种。
2. 在 175 cm² 细胞培养瓶中接种 2 × 10⁶ 至 4 × 10⁶ 个细胞。
   注意：

结果

体外评估LY2和B4B8细胞增殖结果显示，两种细胞系的倍增时间相似（分别为21小时和23小时）。在体内，两种细胞系均在接种后1周内形成单一、可见且可触及的肿块。图1A）。在携带LY2肿瘤的小鼠中，由于肿瘤负荷，颌骨在3周时发生移位（图1A）。未接受肿瘤细胞的对照小鼠如预期未形成肿瘤。与B4B8肿瘤相比，LY2肿瘤生长速度更快。在接种肿瘤细胞第21天，LY2荷瘤小鼠的平均肿瘤体积为632 ± 10 mm³ 与 162 ± 4 mm 相比³ 在 B4B8 肿瘤中（图1B）。由于吞咽困难，出现下颌脱位的小鼠迅速出现体重下降图1C）。体重显著减轻的小鼠定义为 >初始体重的15%和/或肿瘤体积 >1 cm³ 在记录到相关观察结果后1天内实施了安乐死。LY2小鼠的中位生存.......

讨论

对肿瘤微环境进行严格分析和表征是理解肿瘤发生、发展及转移机制并开发有效治疗策略的重要途径。头颈部癌症是一种复杂的疾病，可起源于头颈部区域内的多个解剖部位。目前深入理解疾病机制并改进治疗手段的主要障碍之一，是缺乏能够模拟人类头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）侵袭性和转移性特征的小鼠细胞系。此外，现有的多种小鼠模型采用皮下移植成瘤的方式，而该方法缺失了头颈部区域重要的生理特征，包括高密度的血管系统、发达的淋巴管网络以及局部定植的黏膜菌群。

在本研究中，我们表征了一种小鼠头颈部鳞状细胞癌的原位模型。我们选择颊黏膜作为肿瘤接种部位，原因有多个：该区域易于接触，无需影像引导；可使用游标卡尺评估肿瘤生长；肿瘤位于黏膜菌群环境中；存在周围淋巴管；且实验可重复性高。尽管将细胞注射至颊黏膜操作简便，但针头的定位和穿刺深度至关重要，需防止穿透皮肤或将细胞注入皮下组织。我们建议从口腔内进针，使针头与颊部区域完全平行，在准备注射时倾斜角度不超过10°。

我们所使用的细胞系为小鼠细胞系，可植入其来源品系的免疫健全小鼠体内。文献中已研究过39种以上头颈部鳞状.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胶原酶III	Worthington Biochemical Corp.	LS004183
脱氧核糖核酸酶I（DNase I）	Worthington Biochemical Corp.	LS006328
Fc阻断剂（CD16/32）	BD Biosciences	553141	克隆株 2.4G2
流式细胞术染色缓冲液	eBioscience	00-4222-26
赫姆斯平衡盐溶液（HBSS）	ThermoFisher Scientific	14175079	无钙、无镁、无酚红
Helois质谱流式细胞仪	Fluidigm	NA
基质胶膜基质	Corning	CB-40234B
磁共振成像扫描仪（MRI Scanner）	Bruker	NA	7.4 特斯拉
红细胞裂解缓冲液	BioLegend	420301
胰蛋白酶抑制剂	Worthington Biochemical Corp.	LS002830