单分子水平下蛋白质组范围内的标记均一性定量分析

摘要

本文介绍了一种在单分子水平上评估复杂蛋白质样品中每种蛋白质组分标记均一性的实验方案。

摘要

细胞蛋白质组通常通过电泳实验进行表征，其中细胞内所有种类的蛋白质被非特异性地标记上荧光染料，并在分离后由光探测器检测其信号。单分子荧光成像技术因其能够可视化单个荧光分子，可实现超灵敏的蛋白质检测。然而，由于缺乏有效方法来表征整个蛋白质组中每种蛋白质的荧光标记均一性，这一强大成像技术在电泳实验中的应用受到限制。本文中，我们开发了一种基于单分子荧光成像实验的方法，用于评估蛋白质组中标记均一性。在使用HeLa细胞样本的实验中，我们测定了至少携带一个染料分子的蛋白质比例，即我们定义的“标记占有率”（LO），其值介于50%至90%之间，表明单分子成像技术在高灵敏度和高精度蛋白质组分析中具有巨大应用潜力。

引言

蛋白质组分析旨在定量细胞中表达的全部蛋白质分子，是当前生物学和医学研究中一种重要的研究方法。该分析通常依赖于质谱技术，通过蛋白质电离产生的质谱图来鉴定蛋白质种类^1,2,3。蛋白质组分析的另一种方法是电泳，包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、毛细管电泳和二维（2D）凝胶电泳。该方法依赖于对分析细胞中所有蛋白质分子进行非特异性荧光标记，随后通过电泳分离，并对每种蛋白质进行检测和定量。为实现所需的非特异性蛋白质标记，一种策略是使用可通过静电作用和疏水相互作用与蛋白质结合的荧光染料，例如考马斯亮蓝和Sypro-Ruby^4,5,6。另一种策略是使用含有N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯或马来酰亚胺的染料进行共价标记，这些基团可分别通过伯胺和巯基与蛋白质发生共价结合^7,8。

同时，荧光检测的高灵敏度非常适合分析低丰度蛋白质和少量细胞。单分子荧光成像是一种最灵敏的方法之一，可在体外和体内检测单个荧光染料及标记....

方案

1. 细胞制备

1. 在含有10%胎牛血清的杜尔贝科改良伊格尔培养基中，于37 °C、5% CO₂条件下，在10 cm培养皿中培养HeLa细胞。
2. 按照ATCC操作说明¹⁷，当细胞生长至70%融合度时，收集处于对数生长期的细胞。
   1. 用5 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）（pH 7.4）冲洗细胞，吸除PBS。
   2. 加入1 mL 0.1%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA），于37 °C孵育5分钟。
   3. 通过显微镜观察细胞解离过程的进展。
   4. 当细胞变圆并从培养皿表面脱离后，加入4 mL生长培养基，并通过移液吹打使细胞团块分散。
   5. 使用细胞计数仪对细胞数量进行计数。
   6. 在离心管中以150 × g离心10分钟，弃去上清液，用5 mL 1×PBS（pH 7.4）重悬细胞沉淀。
   7. 重复步骤1.2.6。根据步骤1.2.5的计数结果，用1×PBS（pH 7.4）将细胞重悬至终浓度为10⁶个细胞/mL。
      注意：细胞悬液可分装后于-80 °C保存数月，应避免反复冻融。

2. 细胞裂解与荧光标记

1. 配制10 mL裂解缓冲液（0.1 M硼酸盐，....

结果

图4展示了来自HeLa细胞裂解液的不同分子量蛋白质组分以及阳性和阴性对照的原始图像数据。蛋白质样品和阳性对照每幅图像均显示出100–500个荧光点，而阴性对照则无或仅有极少荧光点，表明该实验方案能有效抑制染料在盖玻片表面的非特异性结合。蛋白质样品和阳性对照的荧光点强度直方图均呈现多个峰，分别代表染料随机结合至蛋白质中的伯胺基团以及亲和素四聚体结构²²。所有荧光点在持续激光激发下均表现出闪烁和逐步光漂白现象，表明实现了单分子水平的观测（图5A、B）。

LO 通过每个蛋白质样品中的斑点数量与阳性对照中斑点数量的比值计算得出。在 HeLa 细胞裂解液样品中测得的 LO 值从低分子量（16 kDa）组分的 50% 到高分子量（120 kDa）组分的 90% 不等.......

讨论

本文描述了一种在通过SDS-PAGE分离细胞蛋白（步骤3）后，定量分析每种标记蛋白在细胞中标记均一性的实验方案。该分离方法可替换为其他高分辨率的蛋白分离与分级技术，例如液相色谱或毛细管电泳，但这些方法需要特殊设备²³。当前方案中使用的NHS酯标记方法，也可替换为其他标记策略，例如马来酰亚胺酯或抗体标记法。

标记均一性分析的需求取决于标记过程在多大程度上偏离了偶联效率分析中假设的简单随机过程。我们最近的研究¹⁶表明，蛋白质的NHS-酯标记会因反应条件（如pH值和去垢剂）的不同而偏离随机过程。我们观察到，某些条件会因染料与蛋白质发生协同结合，或由于蛋白质溶解不完全或对染料亲和力降低而导致部分蛋白质不具反应活性，从而引发异质性。相比之下，其他条件则可通过蛋白质内所有反应性残基完全与染料结合，从而降低异质性。

我们认为pH是影响标记均一性最重要的因素之一。高pH可能导致蛋白质中赖氨酸残基去质子化，从而增加其与NHS酯染料的反应活性。此外，高.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
22x22x0.15 mm 盖玻片	VWR	470019-004
488 nm 氩离子激光器	Coherent	Innova 70C
488 nm 二向色镜	Semrock	FF495-Di03
488 nm 发射滤光片	Semrock	FF02-520/28
560 nm 二向色滤光片	Semrock	Di02-R561
560 nm 发射滤光片	Semrock	FF02-617/73
560 nm 光纤激光器	MBP Communications	F-04306-2
60x 油浸物镜	Olympus	PLAPON 60x
亲和素（Avidin）	Nacalai-tesque	03553-64
生物素-PEG-胺（Biotin-PEG-amine）	Thermo Scientific	21346
生物素标记的 Alexa Fluor 488	Nanocs
硼酸盐（Borate）	Nacalai-tesque
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A9547
CHAPS	Dojindo	C008-10
Cy3 NHS-酯染料	GE Healthcare	PA13101
透析装置  - D型管，6-8 kDa	Merck Millipore	71507-M
DMEM	Sigma-Aldrich
二硫苏糖醇（DTT）	Nacalai-tesque	14112-94
EDC	Nacalai-tesque
EMCCD 相机	Andor	IiXon 897
落射荧光显微镜	Olympus	IX81
凝胶成像仪	GE Healthcare	ImageQuant LAS 4000
青霉素、链霉素和两性霉素混合液	Gibco
等离子清洗机	Diener Electronic
十二烷基硫酸钠（SDS）	Wako	NC0792960
10K 尺寸纯化柱	Merck Millipore	UFC5010
吐温 20（Tween 20）	Sigma-Aldrich	P9416