单分子水平下蛋白质组范围内的标记均一性定量分析

摘要

本文介绍了一种在单分子水平上评估复杂蛋白质样品中每种蛋白质组分标记均一性的实验方案。

摘要

细胞蛋白质组通常通过电泳实验进行表征，其中细胞内所有种类的蛋白质被非特异性地标记上荧光染料，并在分离后由光探测器检测其信号。单分子荧光成像技术因其能够可视化单个荧光分子，可实现超灵敏的蛋白质检测。然而，由于缺乏有效方法来表征整个蛋白质组中每种蛋白质的荧光标记均一性，这一强大成像技术在电泳实验中的应用受到限制。本文中，我们开发了一种基于单分子荧光成像实验的方法，用于评估蛋白质组中标记均一性。在使用HeLa细胞样本的实验中，我们测定了至少携带一个染料分子的蛋白质比例，即我们定义的“标记占有率”（LO），其值介于50%至90%之间，表明单分子成像技术在高灵敏度和高精度蛋白质组分析中具有巨大应用潜力。

引言

蛋白质组分析旨在定量细胞中表达的全部蛋白质分子，是当前生物学和医学研究中一种重要的研究方法。该分析通常依赖于质谱技术，通过蛋白质电离产生的质谱图来鉴定蛋白质种类^1,2,3。蛋白质组分析的另一种方法是电泳，包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、毛细管电泳和二维（2D）凝胶电泳。该方法依赖于对分析细胞中所有蛋白质分子进行非特异性荧光标记，随后通过电泳分离，并对每种蛋白质进行检测和定量。为实现所需的非特异性蛋白质标记，一种策略是使用可通过静电作用和疏水相互作用与蛋白质结合的荧光染料，例如考马斯亮蓝和Sypro-Ruby^4,5,6。另一种策略是使用含有N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯或马来酰亚胺的染料进行共价标记，这些基团可分别通过伯胺和巯基与蛋白质发生共价结合^7,8。

同时，荧光检测的高灵敏度非常适合分析低丰度蛋白质和少量细胞。单分子荧光成像是一种最灵敏的方法之一，可在体外和体内检测单个荧光染料及标记蛋白^{9,10,11,12,13,14,15}。将该成像方法应用于基于电泳的蛋白质组分析，有望通过计数单个荧光标记蛋白实现高灵敏度和定量检测。然而，目前尚不清楚荧光染料标记在所有蛋白质分子之间是否足够均一，以及不同蛋白质种类如何影响这种均一性（图1）。简单的整体溶液测量可用于获得荧光染料与蛋白质的摩尔比，称为“偶联效率”⁸或“标记效率”，但该参数无法提供有关蛋白质分子间标记均一性的信息。

本文描述了一种用于研究细胞中所有蛋白质种类标记均一性的实验方案（图2）¹⁶。该实验的关键步骤包括蛋白质纯化和成像。第一步中，细胞内的所有蛋白质均被荧光标记并进行生物素化，随后通过凝胶电泳分离，并利用电洗脱法分别提取。第二步中，基于单分子成像技术评估提取样品中单个蛋白质分子的荧光特性。由此可获得对计数分析至关重要的参数，例如至少结合一个染料分子的蛋白质比例（我们称之为标记占有率（LO））¹⁶，以及单个蛋白质分子上结合的荧光染料平均数量（n̄_dye）。在本方案中，以NHS酯类Cy3（Cyanine 3）染料对HeLa细胞蛋白质组进行标记的优化流程为例进行说明，也可根据具体研究目标采用其他标记方法进行调整。

方案

1. 细胞制备

1. 在含有10%胎牛血清的杜尔贝科改良伊格尔培养基中，于37 °C、5% CO₂条件下，在10 cm培养皿中培养HeLa细胞。
2. 按照ATCC操作说明¹⁷，当细胞生长至70%融合度时，收集处于对数生长期的细胞。
   1. 用5 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）（pH 7.4）冲洗细胞，吸除PBS。
   2. 加入1 mL 0.1%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA），于37 °C孵育5分钟。
   3. 通过显微镜观察细胞解离过程的进展。
   4. 当细胞变圆并从培养皿表面脱离后，加入4 mL生长培养基，并通过移液吹打使细胞团块分散。
   5. 使用细胞计数仪对细胞数量进行计数。
   6. 在离心管中以150 × g离心10分钟，弃去上清液，用5 mL 1×PBS（pH 7.4）重悬细胞沉淀。
   7. 重复步骤1.2.6。根据步骤1.2.5的计数结果，用1×PBS（pH 7.4）将细胞重悬至终浓度为10⁶个细胞/mL。
      注意：细胞悬液可分装后于-80 °C保存数月，应避免反复冻融。

2. 细胞裂解与荧光标记

1. 配制10 mL裂解缓冲液（0.1 M硼酸盐，1%十二烷基硫酸钠（SDS）和1% Tween 20）。用2 M NaOH调节pH至12。
   警告：浓NaOH具有腐蚀性。配制该溶液时应佩戴合适的手套和护目镜。
   注意：裂解缓冲液可在室温下保存最多一周。
2. 将100 μL裂解缓冲液与1 μL 1 M二硫苏糖醇（DTT）和4 μL 50% 3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸盐（CHAPS）混合。
3. 取1 μL细胞培养物（约1,000个细胞）与步骤2.2中配制的混合裂解缓冲液混合。通过缓慢移液混匀溶液，避免产生气泡。在室温下避光孵育5分钟，并轻轻振荡。再次通过缓慢移液重新混匀溶液。
4. 加入1 μL浓度为2 μg/mL的Cy3 NHS-酯染料。通过缓慢移液混匀溶液，避免产生气泡。在室温下避光孵育5分钟，并轻轻振荡。
   注意：该缓冲液的高pH值会导致蛋白质中赖氨酸残基去质子化，从而提高反应活性。
5. 重复加入1 μL浓度为2 μg/mL的Cy3 NHS-酯染料。通过缓慢移液混匀溶液，避免产生气泡。在室温下避光孵育10分钟，并轻轻振荡。
   注意：重复添加NHS-酯染料可提高标记效率，因为部分Cy3 NHS-酯染料在反应缓冲液的高pH条件下会发生水解并失活。
6. 加入100 μL pH 7.2的0.8 M 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）-NaOH以终止反应，并将溶液pH调节至7.2。通过缓慢移液混匀溶液，避免产生气泡。
7. 加入20 μL浓度为19 mg/mL的生物素-（聚乙二醇（PEG））₂-胺和5 μL浓度为20 mg/mL的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）。通过缓慢移液混匀溶液，避免产生气泡。在室温下避光孵育1小时，并轻轻振荡。
   注意：该生物素化步骤对于将蛋白质分子以固定密度且无蛋白种类偏好性地固定在显微镜盖玻片上是必要的。
8. 按照制造商说明，使用截留分子量为10 kDa的超滤柱去除未反应的标记试剂并浓缩样品。
   注意：此处可暂停实验流程。样品可在-80 °C保存数周。

3. 蛋白质组分离与回收

1. 加入4倍SDS上样缓冲液（200 mM Tris-HCl pH 6.8，4% SDS，4%甘油和0.4%溴酚蓝）。
   注意：为避免染料损伤，蛋白样品不应像标准SDS-PAGE中那样加热，应保持在室温。
2. 使用20%丙烯酰胺凝胶对蛋白样品和分子量标记物进行标准SDS-PAGE电泳，在恒定电压（160 V）下运行，直至前沿刚好移出凝胶。
3. 对凝胶成像以确定蛋白条带的位置（图3）。
4. 根据条带位置，使用锋利刀片切下包含目标蛋白组分的凝胶区域。在16、23、55和120 kDa峰处，以及19–25、25–32、32–42、42–54、54–69、69–97、97–136和136–226 kDa区段进行分段的操作如图3所示。
5. 使用截留分子量为6–8 kDa的透析器，按照制造商说明通过电洗脱法提取蛋白。
   注意：提取后的样品可在-80 °C保存数周。

4. 显微镜盖玻片的制备

1. 为每个样品准备 200 μL 链霉亲和素缓冲液（5 mM HEPES-NaOH，pH 7.2，含 10 ng/mL 链霉亲和素和 2 mg/mL 牛血清白蛋白（BSA））。
2. 准备尺寸为 22 mm × 22 mm、厚度为 0.15 mm 的盖玻片。使用等离子清洗仪对盖玻片进行 1 分钟的空气等离子处理，以清洁并活化其表面。
3. 通过旋涂法在盖玻片上包被链霉亲和素：使用旋涂仪将 200 μL 链霉亲和素缓冲液以 500 rpm 旋涂 5 秒，随后以 1,000 rpm 旋涂 30 秒。室温孵育 15 分钟，使其干燥。
4. 准备用于蛋白样品的盖玻片。
   1. 将蛋白样品（来自步骤 3.5）用 5 mM HEPES-NaOH（pH 7.2）稀释 100 倍。
   2. 取 100 μL 稀释后的样品，加至链霉亲和素包被的盖玻片（来自步骤 4.3）中心表面。
   3. 室温避光孵育 15 分钟。
5. 准备阳性对照。
   1. 取 100 μL 含 10 ng/mL 纯化的荧光标记生物素的溶液（溶于 5 mM HEPES-NaOH，pH 7.2），加至链霉亲和素包被的盖玻片（来自步骤 4.3）中心。
   2. 室温避光孵育 15 分钟。
      注：该阳性对照盖玻片用于提供链霉亲和素结合位点的密度，以用于计算 LO。
6. 准备阴性对照。
   1. 使用旋涂法将 200 μL 不含链霉亲和素的 5 mM HEPES-NaOH 缓冲液（含 2 mg/mL BSA）旋涂至经等离子清洗的盖玻片上。
   2. 室温孵育 15 分钟使其干燥。
   3. 加入 100 μL 含 10 ng/mL 纯化的荧光标记生物素的溶液（溶于 5 mM HEPES-NaOH，pH 7.2）。
   4. 室温避光孵育 15 分钟。
      注：该阴性对照盖玻片用于评估荧光标记生物素在无链霉亲和素存在下对盖玻片的非特异性结合量。
7. 用移液器吸取 200 μL 去离子水，从盖玻片边缘冲洗每个盖玻片，避免枪头接触盖玻片中心区域。重复此洗涤步骤三次。
   注：在吸除盖玻片上的水后，应立即重新加入水，以防止盖玻片完全干燥。
8. 对与步骤 4.2 相同数量的盖玻片进行空气等离子处理。
9. 将经清洗的盖玻片放置于步骤 4.7 中已结合样品的盖玻片上，以防止其干燥。

5. 单分子荧光显微镜观察

1. 启动宽场或全内反射荧光显微镜。
   警告：直接或散射的激光辐射可能造成眼睛或皮肤损伤。请佩戴合适的防护眼镜，并屏蔽激光光路。
   注：有关显微镜的设置，请参考我们之前的出版物¹⁶。简而言之，可使用配备高功率488 nm激光激发光源、高数值孔径物镜和高灵敏度相机的宽场或全内反射荧光显微镜进行本项测量。此外，为实现自动化测量，建议安装由计算机控制的XY平移样品台、用于激光激发的机械快门以及自动聚焦系统。
2. 将盖玻片置于显微镜上并找到焦平面。
3. 执行拼图扫描以获取至少100张图像。
   注：应使用机械快门控制激光照射，仅在用相机记录图像时才对样品曝光，以尽量减少光漂白。若样品数量较多，建议使用计算机程序控制显微镜设备进行自动化测量。当使用60倍物镜时，每幅图像通常包含100–500个单分子荧光点。

6. 图像分析与信息提取

1. 如果图像因激光照明模式导致不均匀，需进行图像处理以校正¹⁸。
   1. 使用与步骤 5.3 相同的相机设置，通过测量由均匀分布的染料构成的盖玻片样品获得参考图像。
   2. 在无激光激发条件下，使用相同的相机设置测量以获得偏移图像。
   3. 从每个样品图像和参考图像的每个像素值中减去偏移图像的对应像素值。
   4. 将经减法处理后的样品图像中每个像素值除以经减法处理后的参考图像中对应像素值。
2. 收集正确获取的图像并去除图像背景。
   1. 手动剔除包含大量荧光聚集体的图像。
   2. 使用 ImageJ²⁰ 中的滚动球算法¹⁹，设置球半径为 50 像素，去除图像背景。
   3. 使用 ImageJ（锐化图像功能）通过减去模糊图像的方式增强图像清晰度。
3. 在图像中识别并分析单分子荧光点。
   1. 使用 ImageJ 中的 Yen 阈值算法²¹识别单分子荧光点。
   2. 使用 ImageJ（ROI 管理器）筛选荧光点：排除小于 2 像素的点以消除相机暗噪声，排除大于 20 像素的点以剔除蛋白质聚集体。
   3. 统计每幅图像中荧光点的数量。使用经过照明校正的图像（步骤 6.1.4），利用 ImageJ 分析每个荧光点所在像素区域的总强度。
4. 使用以下公式计算标记占有率（LO）：
   LO = （样品中的计数 / 阳性对照中的计数）× 100
5. 计算单个蛋白质分子上结合的荧光染料平均数量（n̄_dye）。
   1. 分析每个荧光点强度的直方图。
      注：直方图通常呈现多个峰，每个峰代表不同数量的染料分子结合到蛋白质上。直方图中的第一、第二和第三峰分别对应 1、2 和 3 个染料分子。
   2. 根据直方图计算平均强度。同时，通过高斯拟合计算第一个峰的峰值强度。
   3. 将平均强度除以第一个峰的峰值强度，计算得到 n̄_dye。

结果

图4展示了来自HeLa细胞裂解液的不同分子量蛋白质组分以及阳性和阴性对照的原始图像数据。蛋白质样品和阳性对照每幅图像均显示出100–500个荧光点，而阴性对照则无或仅有极少荧光点，表明该实验方案能有效抑制染料在盖玻片表面的非特异性结合。蛋白质样品和阳性对照的荧光点强度直方图均呈现多个峰，分别代表染料随机结合至蛋白质中的伯胺基团以及亲和素四聚体结构²²。所有荧光点在持续激光激发下均表现出闪烁和逐步光漂白现象，表明实现了单分子水平的观测（图5A、B）。

LO 通过每个蛋白质样品中的斑点数量与阳性对照中斑点数量的比值计算得出。在 HeLa 细胞裂解液样品中测得的 LO 值从低分子量（16 kDa）组分的 50% 到高分子量（120 kDa）组分的 90% 不等...

讨论

本文描述了一种在通过SDS-PAGE分离细胞蛋白（步骤3）后，定量分析每种标记蛋白在细胞中标记均一性的实验方案。该分离方法可替换为其他高分辨率的蛋白分离与分级技术，例如液相色谱或毛细管电泳，但这些方法需要特殊设备²³。当前方案中使用的NHS酯标记方法，也可替换为其他标记策略，例如马来酰亚胺酯或抗体标记法。

标记均一性分析的需求取决于标记过程在多大程度上偏离了偶联效率分析中假设的简单随机过程。我们最近的研究¹⁶表明，蛋白质的NHS-酯标记会因反应条件（如pH值和去垢剂）的不同而偏离随机过程。我们观察到，某些条件会因染料与蛋白质发生协同结合，或由于蛋白质溶解不完全或对染料亲和力降低而导致部分蛋白质不具反应活性，从而引发异质性。相比之下，其他条件则可通过蛋白质内所有反应性残基完全与染料结合，从而降低异质性。

我们认为pH是影响标记均一性最重要的因素之一。高pH可能导致蛋白质中赖氨酸残基去质子化，从而增加其与NHS酯染料的反应活性。此外，高...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
22x22x0.15 mm 盖玻片	VWR	470019-004
488 nm 氩离子激光器	Coherent	Innova 70C
488 nm 二向色镜	Semrock	FF495-Di03
488 nm 发射滤光片	Semrock	FF02-520/28
560 nm 二向色滤光片	Semrock	Di02-R561
560 nm 发射滤光片	Semrock	FF02-617/73
560 nm 光纤激光器	MBP Communications	F-04306-2
60x 油浸物镜	Olympus	PLAPON 60x
亲和素（Avidin）	Nacalai-tesque	03553-64
生物素-PEG-胺（Biotin-PEG-amine）	Thermo Scientific	21346
生物素标记的 Alexa Fluor 488	Nanocs
硼酸盐（Borate）	Nacalai-tesque
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A9547
CHAPS	Dojindo	C008-10
Cy3 NHS-酯染料	GE Healthcare	PA13101
透析装置  - D型管，6-8 kDa	Merck Millipore	71507-M
DMEM	Sigma-Aldrich
二硫苏糖醇（DTT）	Nacalai-tesque	14112-94
EDC	Nacalai-tesque
EMCCD 相机	Andor	IiXon 897
落射荧光显微镜	Olympus	IX81
凝胶成像仪	GE Healthcare	ImageQuant LAS 4000
青霉素、链霉素和两性霉素混合液	Gibco
等离子清洗机	Diener Electronic
十二烷基硫酸钠（SDS）	Wako	NC0792960
10K 尺寸纯化柱	Merck Millipore	UFC5010
吐温 20（Tween 20）	Sigma-Aldrich	P9416