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方法文章

小鼠脑干诱发电位听觉测试中的数据采集与分析

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DOI：

10.3791/59200

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2019年5月10日

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1Experimental Neuropsychopharmacology, Federal Institute for Drugs and Medical Devices, 2KBRwyle GmbH, 3Cognitive Neurophysiology, Department of Psychiatry and Psychotherapy, Faculty of Medicine, University of Cologne, 4Molecular and Cellular Cognition, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 5Institute of Neurophysiology, Faculty of Medicine, University of Cologne, 6Federal Institute for Drugs and Medical Devices (BfArM), 7Thescon GmbH

本文内容

摘要

脑干诱发电位测听是临床神经生理学中的重要工具。如今，脑干诱发电位测听也广泛应用于基础科学研究和涉及药理学及遗传学动物模型的临床前研究中。本文详细描述了如何在小鼠中成功记录和分析听觉脑干反应。

摘要

脑干听觉诱发电位（BERA）在临床神经生理学中具有核心意义。与其他诱发电位（EP）技术（如视觉诱发电位（VEPs）或体感诱发电位（SEPs））类似，听觉诱发电位（AEPs）通过重复呈现相同的刺激来诱发，随后对脑电图（EEG）反应进行平均处理，从而产生明显的正相（p）和负相（n）偏转波形。在人类中，各个波峰的波幅和潜伏期均可用于表征潜在神经回路中同步性和传导速度的变化。重要的是，AEPs 也被应用于基础与临床前科学研究，以识别和评估药理学及遗传性动物模型中的听觉功能。此外，结合药理学测试的动物模型还被用于探索治疗感音神经性听力损失（如年龄或噪声引起的听力障碍）的潜在益处。本文提供了在小鼠中使用短声和短音脉冲刺激记录听觉脑干诱发电位（ABRs）的详细且整合性的操作描述。本实验方案特别关注实验前的动物饲养、麻醉、ABR 记录、ABR 滤波处理、基于小波变换的自动化振幅增长函数分析以及潜伏期检测。

引言

大脑生理学的一个核心特征是其处理环境信息的能力，从而产生不同的内在或外在输出，例如学习、记忆、情绪反应或运动反应。可采用多种实验和诊断方法来表征特定刺激相关神经环路中单个神经元类型或神经元集群/群体的电生理反应性。这些电生理技术涵盖了微观、介观和宏观尺度上的不同时空维度1。微观尺度包括使用不同膜片钳模式进行的电压钳和电流钳实验，例如在培养神经元或急性分离神经元中开展的研究1。这些体外技术可用于表征单个电流成分及其药理学调控特性2,3。然而，其主要局限在于无法获取有关微环路和宏环路信息整合与处理的系统性信息。这一缺陷部分可通过介观尺度的体外技术加以弥补，例如多电极阵列技术，该技术可在培养神经元以及急性脑片中实现同步的细胞外多电极记录4,5。尽管脑片可在一定程度上保留局部微环路结构（例如海马区），但通常会丧失长距离的神经连接6。最终，要研究神经环路中的功能性连接，系统性的宏观尺度体内电生理技术仍是首选方法7。这些方法包括在人类和动物模型中均广泛应用的脑表面（硬膜外）和深部（颅内）脑电图（EEG）记录1。脑电图信号主要来源于不同皮层中锥体神经元接收到的同步突触输入，这些输入本质上既可能是抑制性的，也可能是兴奋性的，尽管总体上以兴奋性输入占主导8。当发生同步化时，基于兴奋性突触后电位的细胞外电场变化被叠加，形成足够强度的信号，从而可通过头皮表面电极记录到。值得注意的是，单个电极要记录到可检测的头皮信号，需要约一万个锥体神经元的协同活动，以及一套复杂的技术设备和信号处理工具，包括放大器、滤波处理（低通滤波、高通滤波、陷波滤波）和具有特定导电特性的电极。

在大多数实验动物物种（例如小鼠和大鼠）中，基于人类头皮的脑电图（EEG）方法在技术上不可行，因为由皮层下方产生的信号过于微弱，这是由于同步活动的锥体神经元数量有限所致9,10,11。在啮齿类动物中，表面（头皮）电极或皮下电极会严重受到心电图以及主要是肌电图伪迹的干扰，导致无法获得高质量的脑电图记录9,11,12。因此，在使用未麻醉且自由活动的小鼠和大鼠时，必须通过硬膜外电极直接记录皮层信号，或从深部脑内结构进行记录，以确保引线/植入电极的感应端与产生信号的神经元细胞簇之间建立直接的物理连接。这些脑电图方法既可在限制性有线系统装置中实施，也可采用非限制性的可植入脑电图无线遥测方法9,10,11。这两种技术各有优缺点，均可有效用于癫痫易感性/癫痫活动、昼夜节律、睡眠结构、振荡活动及同步性的定性和定量特征分析，包括时频分析、源分析等9,10,13,14,15,16,17。

虽然有线系统和无线电遥测技术分别能够在束缚/半束缚或非束缚条件下进行脑电图（EEG）记录，但这些实验条件并不符合听觉脑干反应（ABR）记录的要求。后者需要在时间上重复呈现定义明确的声学刺激，并对扬声器和实验动物的位置以及声压级（SPL）进行精确控制。这可以通过在束缚条件下固定头部或在麻醉状态下实现18,19。为了减少实验应激，动物在ABR实验中通常处于麻醉状态，但应注意麻醉可能对ABR产生干扰19,20。

通常情况下，脑电图（EEG）由不同频率的电活动构成，其电压范围为50-100 µV。背景频率和振幅在很大程度上取决于实验动物的生理状态。在清醒状态下，以振幅较低的β（beta）和γ（gamma）频率为主。当动物进入昏昏欲睡或入睡状态时，α（alpha）、θ（theta）和δ（delta）频率出现，并表现出脑电图振幅的升高21。当某一感觉通路（例如听觉通路）受到刺激时，信息通过外周和中枢神经系统中的神经元活动进行传递。此类感觉刺激（例如听觉刺激）会引发所谓的诱发电位（EP）或诱发电反应。值得注意的是，事件相关电位（ERP）的振幅远低于脑电图（即仅有几微伏）。因此，基于单次刺激的单个ERP信号会被更高振幅的脑电图背景活动所掩盖。因此，记录ERP需要重复施加相同的刺激（例如ABR记录中的咔嗒声），并进行后续平均处理，以消除脑电图背景活动和伪迹。若在麻醉动物中进行ABR记录，则可方便地使用皮下电极。

听觉诱发电位（AEP）主要包括短潜伏期诱发电位，通常与听觉脑干反应（ABR）或脑干听觉诱发电位（BERA）相关；此外还包括中潜伏期诱发电位（中潜伏期反应，MLR）和长潜伏期诱发电位22。重要的是，听觉信息处理过程中的障碍通常是神经精神疾病（如脱髓鞘疾病、精神分裂症等）的核心特征，并与AEP的改变密切相关23,24,25。行为学检查仅能揭示功能损害，而AEP研究则能够对特定神经解剖结构相关的听觉功能障碍进行精确的时空分析26。

听觉脑干反应（ABR）是一种早期、短潜伏期的听觉诱发电位，通常在施加中等到高强度的短声刺激后被检测到，最多可出现七个ABR波峰（WI-WVII）。其中最重要的波形（WI-WV）与以下神经解剖结构相关：WI对应听神经（内耳内的远端部分）；WII对应耳蜗核（听神经的近端部分，脑干终止区域）；WIII对应上橄榄复合体（SOC）；WIV对应外侧丘系（LL）；WV对应外侧丘系（LL）在对侧下丘（IC）的终止区域27（补充图1）。需要注意的是，WII-WV可能由听觉上行通路中的多个解剖结构共同参与形成。值得注意的是，各波峰与听觉通路潜在结构之间的精确对应关系目前尚未完全明确。

在听力学中，听觉脑干反应（ABR）可作为筛查和诊断工具，也可用于手术监测28,29。它在识别听觉异常、听力减退和耳聋方面尤为重要（例如，与年龄相关的听力损失、噪声性听力损失、代谢性和先天性听力损失，以及因畸形或发育异常、损伤和肿瘤导致的不对称性听力损失和听力障碍）28。ABR 还可作为多动、智力障碍儿童或其他无法配合常规听力测试的儿童的筛查手段（例如，患有注意缺陷多动障碍（ADHD）、多发性硬化（MS）、自闭症等神经或精神疾病者）29,30，同时也应用于人工耳蜗的开发与手术植入过程28。最后，ABR 还可用于评估神经精神类药物（如抗癫痫药）潜在的耳毒性副作用31,32。

从药理学或转基因小鼠模型获得的神经生理学知识在众多研究背景下已显示出向人类转化的重要价值，尤其是在小鼠和大鼠听觉范式中的事件相关电位（ERPs）水平上33,34,35。因此，关于小鼠和大鼠早期听觉诱发电位（AEPs）的异常及其相关的听觉信息处理改变的新认识，可被转化为人类研究，并对未来听觉、神经及神经精神疾病的特征描述和内表型分型具有核心意义。本文详细描述了如何成功记录和分析小鼠听觉脑干反应（ABRs），以服务于基础科学研究、毒理学及药理学研究目的。

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方案

所有动物实验均按照德国动物护理委员会的指南进行，所有实验方案均获得当地机构和国家动物护理委员会（德国北莱茵-威斯特法伦州自然、环境与消费者保护局 [LANUV NRW]，自然、环境与消费者保护部门）的批准。作者进一步确认，所有动物实验均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》（NIH 出版物编号 80-23，1996 年修订版）、英国《动物（科学程序）法案》1986 及相关指南，或欧洲共同体理事会 1986 年 11 月 24 日指令（86/609/EEC）以及 2010 年 9 月 22 日指令（2010/63/EU）。特别努力减少了实验动物的使用数量并减轻其痛苦（遵循“3R”[替代、减少和优化]策略）。

1. 实验动物

  1. 实验动物及物种的选择
    1. 在符合特定人类疾病同源性、同形性及可预测性要求的啮齿类动物/啮齿类动物模型（即小鼠或大鼠）中开展听觉脑干反应（ABR）研究。这一点在转化神经科学的基础研究中具有重要意义。
      注意：需考虑现有的各种小鼠和大鼠品系在基本生理学和病理生理学特征上可能存在差异36,37,38在实验设计中必须考虑这些与小鼠/大鼠品系相关的特异性。
    2. 考虑小鼠和大鼠品系特异性的生理学与药理学改变，这些改变可能影响电生理实验结果（例如麻醉敏感性、昼夜节律、[声源性]癫痫易感性、年龄和遗传背景的差异）39,40,41,42.
    3. 在研究设计中纳入性别分层分析。需注意动情周期可能显著影响麻醉敏感性、中枢节律性、昼夜节律依赖性以及癫痫发作活动（听觉性癫痫）和感觉（听觉）信息处理43,44,45因此，进行性别特异性分析。
      注意：如果经费和实验条件有限，可仅使用雄性小鼠，尽管正常动情周期雌性小鼠的多种神经生理参数与雄性相比似乎并未表现出更高的变异性46.
  2. 动物饲养与操作
    1. 动物实验室内独立通风笼具中的家鼠或大鼠。
    2. 将实验动物从动物房转移至位于专用实验室房间内的通风柜中，这些房间用于麻醉、ABR电极放置和ABR记录。
    3. 确保动物饲养于通风柜内，并处于标准环境条件下（即温度为 21 ± 2 °C，50%–60% 相对湿度，以及标准的 12/12 小时光照/黑暗循环）。在进行后续实验前，让动物在此昼夜节律条件下适应至少 14 天。
    4. 使用透明聚碳酸酯II型笼具（26.7 cm × 20.7 cm × 14.0 cm，面积410 cm²）2）用于以每组3-4只的方式饲养小鼠，使用III型透明聚碳酸酯笼具（42.5 cm × 26.6 cm × 18.5 cm，面积800 cm²）2）用于大鼠。提供 随意摄取 可自由获取饮用水和标准饲料颗粒。
    5. 在听觉脑干反应（ABR）记录前后均应避免实验动物的单独隔离，因为隔离可能引起严重应激，影响实验结果。因此，在麻醉、ABR电极放置及ABR记录完成后，应立即将动物放回其原饲养笼中。
    6. 不要采用开放式饲养条件，因为这会带来多种实验缺陷，尤其是在听觉研究中。相反，通风柜可在实验性听觉操作之前及之间保护动物免受声学应激，否则可能导致感音神经性听力损失（如噪声性听力损失），从而影响实验结果。
    7. 使用针对小鼠和大鼠的专用消毒、麻醉及技术设备，以确保小鼠与大鼠无法感知彼此的存在，因为不同物种间的相互感官刺激可能在研究中引发可避免的混杂因素。

2. 小鼠麻醉

  1. 使用注射用麻醉剂进行麻醉。将盐酸氯胺酮（啮齿类动物剂量：100 mg/kg）和盐酸赛拉嗪（啮齿类动物剂量：10 mg/kg）用0.9% NaCl或林格氏液配制，根据动物体重经腹腔注射给药。
    注意：不推荐使用异氟烷吸入麻醉，因为ABR实验通常需要隔音屏蔽室和法拉第笼，这会导致记录装置内部空间受限。尽管许多麻醉剂作用于NMDA系统并明显影响ABR记录结果，但也不推荐在ABR记录中采用非麻醉束缚方式，因为在清醒状态下束缚动物会引起显著应激反应，导致ABR中产生严重干扰伪迹。
  2. 通过尾部夹捏、足部夹捏以及监测呼吸频率（小鼠：150–220次/分钟）仔细观察动物的麻醉深度。注意是否有呼吸急促现象，并在必要时进行干预。
    注意：不同小鼠品系或药理学小鼠模型对麻醉的敏感性可能存在差异，突变小鼠模型同样如此。在此实验条件下，气管插管并非必需，且不推荐使用。由于插管会增加气管创伤和感染风险，因此在ABR实验过程中进行气管插管的获益/风险比为负。

3. 围麻醉期准备与器械的总体要求

  1. 在ABR记录期间及之后，使用恒温加热毯为动物提供额外保暖，以维持其核心体温。将体温保持在36.5–38.0 °C（98.6–100.4 °F）。
    注意：由于小型啮齿类动物体表面积与体积之比较高（小鼠体表面积 = 10.5 ×（体重g）2/3；大鼠体表面积 = 10.5 ×（体重g）2/3），低体温是其主要风险因素。
  2. 在整个ABR记录过程中，使用石油基人工泪膏或5%泛醇覆盖动物眼睛，以防止角膜干燥。该操作应持续至眨眼反射完全恢复。
  3. 使用高压灭菌器或消毒剂对实验器械（参见材料表）进行灭菌。
    注意：推荐使用基于高温的玻璃珠手术器械灭菌器。
  4. 为实现精确的ABR电极定位，应采用带有冷光源的双目手术放大显微镜，并通过柔性或自支撑可移动导光管提供强照明。
  5. 在实验动物操作和实验过程中，穿戴洁净的实验服、口罩、头套及无菌手套。
    注意：最佳仪器和耗材可能因实验室而异，必须符合各实验室及机构的具体标准。

4. ABR 记录

注意：此处描述的实验方案基于一种 commercially available ABR 系统，用于单耳和双耳记录。重要的是，所要解决的科学问题必须符合所用 ABR 系统的技术规格。例如，双耳记录的 ABR 分析可用于研究听觉通路中听觉刺激的侧向编码，以及神经精神疾病中的外周侧向不对称性。

  1. 每次记录当天均需进行刺激频率的校准：将连接至前置放大器和处理系统的麦克风（参见材料表）放置于隔音屏蔽箱内，位置和方向应与实验小鼠耳部实际所处位置一致。
    1. 在校准开始前至少5分钟开启连接麦克风的前置放大器，以确保系统达到平衡状态。
    2. 打开示波器。
    3. 将连接前置放大器的麦克风置于隔音屏蔽箱内，模拟实验中小鼠耳部的位置。
    4. 打开商用信号处理与采集软件（参见材料表）。
    5. 在软件中选择校准文件Cal200K，以激活校准配置模式，并根据实验条件设置相应参数。
    6. 使用处理器系统执行校准程序。确保麦克风和扬声器在声压级（SPL）限制、频率范围及分布特性方面的技术规格相匹配。
    7. 选择并启动预设的点击刺激方案。
    8. 运行单次点击SPL（建议使用最大SPL），通过示波器的在线快速傅里叶变换（FFT）分析确认声音刺激频谱符合要求（具备足够的能量范围）。
    9. 选择并启动预设的短音突发刺激方案，频率范围应覆盖目标区间（例如1–42 kHz）。
    10. 使用示波器和在线FFT确认所记录声学测试刺激的频率谱。
      注：每日对系统及刺激频率进行校准，是确保刺激频率和声压级处于可接受工作范围内的必要步骤。
  2. 将麻醉后的小鼠置于内衬声学泡沫的隔音屏蔽箱中。
    注：整个屏蔽箱应覆盖法拉第笼（可为定制金属网或商用产品），以屏蔽外部电干扰，保护听觉脑干反应（ABR）记录免受噪声影响。
  3. 为记录单耳脑干诱发听觉电位，将皮下不锈钢电极插入头部顶点、耳廓轴线位置（正极[+]电极），以及右侧或左侧耳廓腹外侧（负极[-]电极），具体取决于待测耳侧。对于双耳记录，将负极电极分别置于左右耳廓处。接地电极应置于动物髋部（补充图1）。
    1. 插入前，将不锈钢电极尖端弯成钩状，以确保电极在皮下的固定性47。
  4. 每次记录前应对所有电极进行阻抗测量，以验证电极位置是否正确及导电性是否良好。使用四通道前置放大器头盒上的阻抗检测按钮，逐一检查各电极的阻抗水平。
    注：电极阻抗应低于5 kΩ。
  5. 在自由场条件下使用单个扬声器（例如频率带宽为1–65 kHz）记录ABR，扬声器应置于动物吻部前方10 cm处（扬声器前缘垂直于小鼠双耳连线轴）。确保小鼠头部/耳部位置与校准时麦克风的位置一致，具体取决于校准时扬声器与麦克风之间的设定距离。
    注：除自由场条件外，也可使用耳管系统。但在这些设置下需采取特殊预防措施并进行测试，以确定实际声压级。
  6. 使用自编或商用软件（参见材料表）编程点击和短音突发刺激方案。以下所列各项刺激参数需输入至相应的图形用户界面。
    1. 首先配置点击刺激参数（即持续时间为100 μs、极性交替[在压缩与稀疏之间切换]且具有明确能量范围的刺激）。使用该刺激参数用于后续分析点击阈值、左右耳ABR对称性、ABR波I–IV的振幅及波I–IV的潜伏期。
    2. 启动软件，通过配置窗口输入点击刺激参数，点击执行以运行该方案。
    3. 继续配置第二个刺激参数，即持续时间为4.5 ms的短音突发（瞬态正弦脉冲），极性交替，采用汉宁窗包络，上升和下降时间各为1.5 ms（门控/斜坡时间）。对于低频短音突发，建议最短持续时间不少于3 ms。使用该刺激参数用于分析和识别所有基因型的频率特异性听力阈值。
    4. 与步骤4.6.2类似，通过配置窗口输入短音突发刺激参数，并点击执行以运行方案（按制造商说明48）。
    5. 针对短音突发研究，根据科学问题设定待测试的适当频率范围（例如以6 kHz为步长，从1–42 kHz）。确保所用频率范围符合扬声器的技术能力（本例中为多磁场扬声器，在自由场或封闭场条件下频率带宽为1–65 kHz）。
    6. 为信号平均设置连续声刺激（点击或短音突发）的次数，例如300次，刺激速率设为20 Hz。
    7. 点击刺激以5 dB为步长、短音突发以10 dB为步长递增声压级，从0 dB开始逐步增加至90 dB（递增SPL模式）。
      注：文献中已有采用递增和递减SPL模式的描述。SPL步长可根据具体科学问题进行调整。
  7. 设定ABR数据采集时程为25 ms，包括声刺激开始前5 ms的基线期（ABR前基线），以及在10 ms ABR信号段后额外延长10 ms的基线期（ABR后基线）（补充图1）。
  8. 采用适当的ABR数据采样率（例如24.4 kHz）和带通滤波器（高通：300 Hz，低通：5 kHz），使用6极巴特沃斯滤波器。必要时启用陷波滤波器。
    注：采样率和滤波器特性可根据实验需求进行调整。
  9. 将皮下电极记录到的生物电信号传输至前置放大头盒，再进一步送至具有适当增益（例如20倍）的前置放大器。
  10. 使用专用ABR系统处理软件，协调扬声器控制、ABR信号采集、处理、平均及数据管理。
  11. 尽量在约45分钟内完成全部ABR实验流程（包括点击和短音突发诱发的听力阈值、波峰振幅和波峰潜伏期分析等），该时间大致对应腹腔注射100/10 mg/kg氯胺酮/赛拉嗪后深度麻醉的持续时间。
  12. 在对动物实施麻醉并开始正式记录前，务必确认校准、刺激呈现与采集的编程/调整、滤波设置等各项操作均正常运行。

5. ABR 分析

  1. 由咔嗒声和短音突发诱发的听觉脑干反应（ABR）听力阈值分析
    1. 根据先前发表的研究采用自动阈值检测方法，以避免通过视觉检查/估测确定ABR阈值时可能出现的不一致性49,50,51,52。
    2. 定义三个不同的时间窗口（TWs）用于计算信噪比（SNR）：TW1（0–5 ms）、TW2（5–15 ms）和TW3（15–25 ms）（补充图1）。
    3. 在两个未观察到听觉诱发电位（AEPs）的独立时间窗口（即TW1和TW3）内，计算基线噪声的标准差。该计算可通过自编程序软件完成。
    4. 针对每条ABR记录设置中的每个声压级（SPL）测量值，分别计算TW1和TW3合并数据的均值和标准差。
    5. 使用相应计算得到的均值对所有记录样本进行单独重置，以消除任何直流偏移（DC offset）。
    6. 在听力阈值确定过程中，识别出ABR反应时间窗（TW2）内至少有一个波形幅度值（WI–WIV）超过先前计算标准差四倍的最低SPL（dB）。
      注：若在最大SPL下对咔嗒声和频率阈值分析均未检测到ABR波形，则将该耳的名义阈值设定为100 dB。
  2. ABR波形幅度与波潜伏期分析
    1. 采用基于小波的方法，使用墨西哥帽小波（Mexican hat wavelet），通过基于连续小波变换（CWT）的模式匹配算法中的默认小波，确定正相（p）波（峰）和负相（n）波（谷）的时间顺序排列52（补充图1）。
      1. 数学上，CWT表示如下53。
        显示C(a,b)的小波变换方程，包含积分和缩放函数ψ。
        其中，s(t)为信号，a为尺度，b为平移，ψ(t)为母小波，ψa, b(t)为缩放和平移后的小波，C为小波系数的二维矩阵。
    2. 初始阶段，使用每次ABR记录中55 dB的测量数据，确定传递给CWT的各波最佳尺度参数，从而形成三类参数：所有n波的尺度为0.5–4，所有p波的尺度为0.5–6，而WIV的尺度为0.5–12，因为该波在样本中是最宽的。
      注：选择55 dB SPL是因为在此强度下波形通常最为显著，且可被可靠检测。
    3. 验证所有三类参数，确保在全部55 dB测量数据中可靠地检测出WI–WIV的正确时间位置。
    4. 为在55 dB测量数据中准确确定ABR的WI–WIV时间顺序，采用先前已识别峰的相对位置，按固定序列识别p峰和n峰（谷），以限制后续扫描的时间窗口。
    5. 当在55 dB下识别出全部九个峰后，将相关数值作为相邻声压级测量值（50 dB和60 dB）时间搜索范围的起始点，随后重复进行1–9号峰的识别。
    6. 以类似方式，尽可能确定所有dB水平（55–0 dB及60–90 dB）下的p峰和n峰。一旦小波分析无法再识别出某个p峰或n峰，则通过计算该峰相对于前一dB水平中已识别峰的时间偏移量来设定其时间位置。
    7. 将当前分贝水平下未定义峰的时间偏移量应用于其他任意p峰或n峰，最多可获得八个确定的时间位置，取其均值作为最接近的近似值。
    8. 为评估所有波形（WI–WIV）的幅度增长函数和潜伏期比较，需在对应n峰的时间范围内，表征各p峰的最大幅度和平均潜伏期。
    9. 在使用自编程序的自动小波工具完成分析后，需对所有结果进行视觉核查；如有必要，对于不符合严格纳入/质量标准的个体ABR记录，应从统计分析中排除。
      注：在ABR的自动分析和视觉检查过程中，建议采用双盲法。

6. 术后护理与听觉脑干反应（ABR）检测后处理

  1. 持续监测动物，直至其恢复意识并能够维持胸卧姿势。
  2. 在动物完全恢复之前，不得将其放回与其他动物同处的环境中。
  3. 注射卡洛芬用于术后镇痛（小鼠：5–10 mg/kg，皮下注射，单次；大鼠：2.5–5.0 mg/kg，皮下注射，单次）。
    注意：由于听性脑干反应（ABR）记录电极仅需皮下植入，无需长期镇痛治疗。
  4. 术后提供湿润颗粒饲料以促进进食。仔细观察食物摄入量（约15 g/100 g体重/天；约5 g/24小时）和饮水量（约15 mL/100 g体重/天；约5 mL/24小时）。
  5. 密切监测动物恢复正常姿势和行为的情况。
    注意：由于皮下电极植入属于微侵入性操作，不建议常规全身使用抗生素（如恩诺沙星或甲氧苄啶-磺胺类药物）。除非出现局部或全身性炎症迹象，否则不应使用抗生素。
  6. 通过监测动物体重变化，评估听性脑干反应（ABR）记录后的实验后恢复情况。

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结果

通过点击声和短音诱发的听性脑干反应（ABR）记录，可用于评估听力阈值差异、振幅增长函数以及潜伏期比较。在声压级（SPL）递增模式下，对照组及两种代表性突变小鼠品系（缺乏Cav3.2 T型电压门控Ca2+通道，即Cav3.2+/-和Cav3.2功能缺失突变体[Cav3.2-/-]）的点击声诱发ABR结果如图1所示。如上所述，由于人类54,55和小鼠56,57听觉参数存在性别差异，通常建议进行性别特异性分析。按照本方案所述，记录了自由场点击声（0.1 ms）和短音刺激（1–42 kHz，以6 kHz为步长，总时长4.5 ms，上升/下...

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讨论

本方案详细且系统地描述了如何在小鼠中记录听觉诱发电位脑干反应。重点介绍了动物的预处理、麻醉方法以及可能影响实验结果的方法学混杂因素。这些因素包括但不限于性别、小鼠品系、年龄和饲养条件。需要注意的是，所有这些因素均可能影响感音神经性听力损失及听觉信息处理的基本特征。因此，对听觉表型分析研究进行适当的分层是必不可少的。

听觉诱发电位（AEP）记录技术在过去的50至60年中取得了巨大发展，如今已有商用的听觉脑干反应（ABR）记录系统，这些系统增强了该技术的应用性并使其操作更为简便，但同时也引入了一些新的潜在问题。本文讨论了其中的一些方面。首先，使用者应熟悉ABR系统，即由台式或笔记本电脑、前置放大器、放大器、电极输入盒以及潜在的换能器（例如扬声器、插入式耳机、耳罩式耳机和骨导振荡器）组成的仪器设备。值得注意的是，记录条件至关重要。由于ABR记录具有高度敏感性，必须进行屏蔽，以防止受到外部电噪声的干扰，并确保足够的信噪比。

另一个重要方面是仪器设备本身（例如刺激发生器、换能器和触发信号）。在小鼠中，最常用的刺激类型包括100 µs的咔...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨此感谢克里斯蒂娜·科尔布博士（德国神经退行性疾病中心 [DZNE]）和罗伯特·斯塔克博士（DZNE）在动物繁育与动物健康护理方面提供的协助。本研究由德国联邦药品和医疗器械机构（Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte, BfArM，德国波恩）提供资金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
用于RZ6的AEP/OAE软件（BioSigRZ软件）Tucker-Davis Technologies (TDT)BioSigRZ
双目手术放大显微镜Zeiss Stemi 20000000001003877, 4355400000000, 0000001063306, 4170530000000, 4170959255000, 4551820000000, 4170959040000, 4170959050000
笼具（Macrolon）Techniplast1264C, 1290D
卡普洛沙兽用，50 mg/mlVirbac 动物药品有限公司PZN 11149509
冷光源Schott KL2500 LCD9.705 202
棉签（无菌）Carl RothEH12.1
定制金属网状法拉第笼（不锈钢，2 mm 厚度，1 cm 网格尺寸）定制定制
5% 泛醇（Bepanthen 眼鼻霜）拜耳医药保健有限公司PZN: 01578681
一次性皮下不锈钢针
电极，27GA，12mm		Rochester Electro-Medical, Inc.S03366-18
手术铺巾（无菌）HartmannPZN 0366787
70% 乙醇Carl Roth9065.5
1/4'' 自由场测量校准麦克风套件Tucker-Davis Technologies (TDT)PCB-378C0
手套（无菌）优尼手套1570
Graefe 镊子—弯曲，带齿强迫游泳实验11052-10
GraphPad Prism 6 软件，V6.07GraphPad Prism Software, Inc.https://www.graphpad.com/
基于热力的手术器械灭菌器强迫游泳实验18000-50
恒温的
加热毯		ThermoLux461265 / -67
氯胺酮（Ketamine），25 mg/mlPfizerPZN 08707288
林格氏液’s 溶液（无菌）B.BraunPZN 01471434
Matlab 软件MathWorks, Inc.https://de.mathworks.com/products/matlab.html
Medusa 4通道低阻抗前置放大器Tucker-Davis Technologies (TDT)RA4LI
Medusa 四通道前置放大器/数字转换器Tucker-Davis Technologies (TDT)RA4PA
麦克风PCB Pieztronics378C01
多场声源-立体声Tucker-Davis Technologies (TDT)MF1-S
示波器TektronixDPO3012
Optical PC1 express卡（用于Optibit接口）Tucker-Davis 系统（TDT）PO5e
Askina Braucel 敷料（纤维素吸收垫）B.BraunPZN 8473637
前置放大器PCB Pieztronics480C02
RZ6 多功能输入/输出处理器系统（BioSigRZ）Tucker-Davis Technologies (TDT)RZ6-A-PI
0.9% 氯化钠溶液（NaCl，无菌）B.BraunPZN:8609255
SigGenRZ 软件Tucker-Davis Technologies (TDT)https://www.tdt.com/
软件 R（版本 3.2.1）+ Reshape 2（版本 1.4.1）+ ggplot 2（版本 1.0.1）+ datatable（版本 1.9.4）+ gdata（版本 2.13.3）+ pastecs（版本 1.3.18）+ waveslim（版本 1.7.5）+ MassSpecWavelet（版本 1.30.0）R 基金会，R 核心团队 2015开源软件（可免费分发）
隔音屏蔽室Med Associates 公司ENV-018V
标准型镊子，12 cm 和 14.5 cm 长度强迫游泳实验11000-12, 11000-14
Leukosilk 胶带BSN medical GmbH & Co. KGPZN 00397109
组织镊 - 1×2 齿，12 厘米强迫游泳实验11021-12
Uniprotect 通风柜BioscapeTHF3378
通风柜Tecniplast9AV125P
赛拉嗪（Rompun），2%Bayer Vital GmbHPZN 1320422

参考文献

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