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用于小鼠中枢神经系统鼻内递送siRNA时的小鼠定位装置

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DOI：

10.3791/59201

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2019年8月15日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering and Institute of Nanoscience and Technology, Hanyang University, 2Department of Internal Medicine, Section of Infectious Diseases, Yale University School of Medicine

本文内容

摘要

本文介绍了一种使用小鼠定位装置的实验方案，该装置可实现小鼠在经鼻给予靶向脑部的肽-siRNA 制剂时的准确定位，从而在中枢神经系统中实现有效的基因沉默。

摘要

鼻内（IN）给药作为一种有前景的方法，可绕过血脑屏障（BBB），实现将药物递送至中枢神经系统（CNS）。近期研究表明，一种包含狂犬病毒糖蛋白最小受体结合域的肽段RVG9R，可用于介导siRNA向脑内神经元的递送。在本实验方案中，使用优势手持移液器将肽-siRNA制剂经鼻内递送，同时用非优势手抓握麻醉小鼠的颈背部皮肤，使其保持“头向下并前倾”的体位，以避免吸入时药物流入肺部和胃部。这种精确抓握小鼠的方法可以学习掌握，但并不容易，需要经过练习和具备一定技巧，才能实现有效的中枢神经系统摄取。此外，该过程耗时较长，需约45分钟，以每次吸入1–2 µL的液滴体积，分次给予总计约20–30 µL的溶液，每次吸入之间需间隔3–4分钟休息。本研究的目的是介绍一种小鼠体位固定装置，可实现小鼠在高效鼻内给药过程中的准确定位。该装置设计包含多种功能，例如设有四个或八个可调节高度和倾斜角度的定位座椅，可将麻醉小鼠固定于头向下并前倾的位置，便于清晰观察小鼠鼻孔，并内置加热垫以维持小鼠在操作过程中的体温。重要的是，该装置可同时对四只或八只小鼠进行RVG9R-siRNA复合物的处理，显著加快实验进程，有利于鼻内siRNA治疗策略的快速测试。综上所述，该装置可实现对小鼠头部位置的准确且可控的固定，适用于RVG9R-siRNA及其他治疗分子（如纳米颗粒或抗体）经鼻内途径向中枢神经系统的递送。

引言

血脑屏障（BBB）可阻止分子量大于>400–600 Da的全身给药分子进入大脑，这对治疗中枢神经系统（CNS）和脑部疾病所需生物治疗分子的递送构成了重大挑战1。可通过立体定向注射实现药物向大脑的直接递送；然而，该方法需要外科手术技术，且药物递送范围仅限于注射部位附近区域，因此不适用于常规临床应用2。经鼻（IN）给药也可通过绕过血脑屏障实现直接向大脑递送，使多种物质能够直接且快速地转运至大脑3,4。这种转运被认为通过嗅神经和三叉神经介导，这些神经连接鼻腔与大脑、脑脊液以及淋巴系统5。由于直接的鼻-脑通路不涉及外周器官和组织，因此可显著减少全身性副作用并提高药效。经鼻给药是一种有前景的非侵入性替代途径，可用于治疗剂向大脑的局部或全身递送，可能成为应对阿尔茨海默病、帕金森病和脑癌等神经系统疾病的有效策略，目前已有多个临床试验正在探索其应用6,7,8。

多种实验因素，如接种体积、接种方法以及制剂pH值，均显著影响通过鼻-脑通路向中枢神经系统（CNS）递送药物的效果9。在小鼠研究中，经鼻（IN）给药的成功与否在很大程度上取决于正确的头部定位，这对于实现高效的脑部沉积并避免药物排入外部环境或气道至关重要。值得注意的是，大多数啮齿类动物研究采用头后仰位（仰卧位），并将头部倾斜70°–90°，以促进药物递送至嗅上皮；尽管如此，0°头部定位可能更易导致药物流入气管9。在清醒小鼠中进行经鼻给药会导致脑部沉积量降低，与仰卧位给药相比效果较差，这主要是由于研究人员难以长时间维持小鼠于理想体位所致。此外，对清醒小鼠采用皮肤抓握法所需的倒置体位，会导致药物主要沉积于三叉神经和嗅球，以及肾脏和肺等外周器官，此现象在接种后30分钟内即可观察到10。在临床研究中，对于非人灵长类等体型较大的动物，通过嗅神经或三叉神经递送治疗药物最合适的体位似乎是头下垂前倾位（即所谓"祈祷麦加姿势"）11。然而，该体位在小鼠模型中尚未得到充分研究，目前啮齿类动物研究中仍更广泛地使用仰卧位。

此前，我们已证明RVG9R是一种基于狂犬病毒最小受体结合域设计的多肽，能够靶向表达烟碱型乙酰胆碱受体亚基的细胞（如神经元和巨噬细胞），并通过受体结合及受体聚集部位质膜暂时去定位的机制介导siRNA的细胞内递送12,13。重要的是，静脉系统给药RVG9R-siRNA复合物可实现siRNA经血管进入中枢神经系统（CNS）14。然而，系统给药途径会稀释递送至CNS的siRNA量；近期数据显示，将RVG9R:siRNA复合物经鼻内（IN）给予呈头部向下前屈体位的小鼠，可在脑部多个区域引发广泛的靶基因沉默15。重要的是，该程度的基因沉默仅需在为期2天、共4次给药的方案中累计给予13.5 µg siRNA即可实现，而静脉注射途径则需每次注射约高出5倍的剂量才能达到相当的沉默效果。IN给药的唯一缺点是操作繁琐，需在给药过程中持续用手交替固定小鼠于头部向下前屈及放松体位，每次给药需经历多次呼吸周期，整个处理过程耗时较长（每只小鼠有效摄取约20–30 µL液体需30–45分钟）。采用本文所介绍的小鼠体位固定装置，可使小鼠在几乎无身体应激的情况下被准确安置，减轻实验人员的操作负担，并可在合理时间内同时处理多组小鼠，从而为深入研究在西尼罗河脑炎小鼠模型疾病晚期阶段应用siRNA作为治疗手段提供了可能15。

方案

所有实验均按照汉阳大学动物护理与使用委员会批准的指南和方案进行。本方案中使用6周龄、体重20-25 g的Balb/c小鼠（每组n = 3）。动物饲养于无病原体环境中，光照/黑暗周期为12小时，温度和湿度受控，可自由获取水和食物。

1. 设备组装

  1. 按照图1A所示，组装定位装置的各个部件。
    注意：该装置以独立部件形式提供，可轻松组装和拆卸。

2. 材料准备

注意：液态药物的鼻内给药需进行以下预处理步骤。

  1. 准备所需材料，包括定位装置、10 µL 微量移液器、10 µL 移液器吸头、处理溶液（例如 RVG9R-siRNA 复合物）、计时器和 70% 乙醇（参见图 2A）。
  2. 在实验开始前至少 15–20 分钟接通电源，启动设备加热系统。动物实验的最佳温度会自动维持在约 37 °C。
  3. 按 1:0.5:8.5 的比例配制麻醉剂（氯胺酮:赛拉嗪:磷酸盐缓冲液（PBS）），每只小鼠通过单次腹腔（i.p.）注射给予，最终剂量为每 20 g 小鼠 200 µL。
    注意：任何经优化可用于维持 30–45 分钟麻醉状态的药物均可使用。

3. 小鼠体位摆放

  1. 通过足底反射（用力捏脚趾）评估麻醉水平，以维持手术所需的麻醉深度。
  2. 将定位装置放置在适当的距离和高度，以便于方便地接触所有所需试剂。
  3. 小鼠充分麻醉后，用拇指和食指轻轻抓住其颈部皮肤提起，并将其放置在指定的固定椅上。
  4. 此阶段小鼠在固定椅上的正确体位至关重要。应使小鼠背部与椅背平行，并与椅座呈90°角。松开手，让动物自然处于头低位并前倾的姿势，不要施加推压，如图2B所示。确保小鼠在该放松体位下，前肢能提供自然支撑，且动物无任何不适。
  5. 小鼠正确固定后，立即用固定椅上的安全带将其绑好，并立即开始鼻内接种（IN inoculation）。

4. 鼻内给药

注意：本方案描述了使用小鼠固定装置经鼻内（IN）递送RVG9R:siRNA复合物的方法。采用本方案，可将最多20-30 µL的溶液以每滴2 µL的方式轻松给予每只小鼠。该体积小于小鼠鼻腔容积（0.032 cm3），因此不会导致致命性鼻孔阻塞或窒息。本方案允许同时对至少四只、最多八只小鼠进行接种（每台装置），从而实现时间优化并减少实验变异性。

  1. 取10 µL微量移液器，并将其调整至2 µL。
  2. 用移液器吸取2 µL的RVG9R:siRNA复合物溶液（例如，递送实验中为5.2 µg siCy5与104 µg RVG9R复合，沉默实验中为13.5 µg siSOD1与270 µg RVG9R复合，最终体积为含5%葡萄糖的25 µL PBS）。
  3. 用惯用手持移液器，通过将肘部置于实验台面上调整位置。用另一只手托住持移液器的手，以避免给药过程中产生不受控制的移动。
  4. 将约2 µL的液滴放置在靠近一侧鼻孔的位置，使小鼠可直接吸入该液滴（参见图2B）。若难以形成微小液滴，应更换新的移液器吸头并重复操作。使用秒表确认接种之间的时间间隔。
  5. 该装置可同时处理至少四只小鼠。若需另设一组小鼠重复步骤4.4，可在原有四把椅子的横杆上方或下方再设置另一根带有四把椅子的横杆，以便该装置可同时容纳最多八只小鼠。
  6. 在首次接种后3-4分钟，对另一侧鼻孔重复步骤4.4。此时间间隔足以让小鼠完成第一剂的吸入并恢复正常的呼吸。若因小鼠意外喷鼻导致吸入的溶液液滴脱落，应额外重新接种2 µL溶液。
  7. 交替使用双侧鼻孔重复整个过程，直至完成20-30 µL的给药剂量。整个接种过程约需30-45分钟。
  8. 在将小鼠放回指定笼具前，为其眼睛涂抹湿润眼膏。
    注意：在小鼠恢复足够意识以维持胸卧位之前，不得使其无人看管。

5. 数据分析

  1. 为确认荧光标记的 RVG9R 在脑内的沉积情况，按照步骤 2.3 所述方法麻醉小鼠，并分离脑组织及其他外周器官，如肺、肝、脾和肾。将各器官置于 ImageStation 上，利用 ImageStation 可视化荧光信号。
  2. 为观察 Cy5 标记产生的荧光，制备 20 µm 厚的冷冻切片，用 Hoechst 33342 共同染色，并使用共聚焦显微镜进行全脑扫描。
  3. 为评估基因沉默效果，使用 RNA 纯化试剂盒从不同脑区（如嗅球、皮层、海马、丘脑、下丘脑、小脑和脑干）提取 RNA，通过 cDNA 合成试剂盒将其反转录为 cDNA，并按照先前所述方法15使用特异性引物对进行 qPCR 检测。

结果

给药时的头部位置是影响药物经鼻递送至大脑效率的关键因素。本文中，我们采用小鼠固定装置，将小鼠头部置于下倾前屈位置，以经鼻给予靶向脑部的肽-siRNA复合物，实现该混合物向小鼠中枢神经系统的递送。为验证药物通过经鼻途径递送的效果，我们使用了RVG9R肽，该肽此前已被证明在体外和体内均能高效结合神经元细胞14,16。

我们首先利用本文所述的小鼠固定装置，测试了用 Alexa Fluor 488 标记的 RVG9R 肽（RVG9R-A488）通过鼻-脑递送的效果。接种后 48 小时，切除包括脑、鼻窦、肺、肝、脾和肾在内的多种器官，以检测组织相关的 A488 荧光。单独的 A488 或一种不结合 nAchR 的对照肽（RVM9R-A488）14 被用作阴性对照。正如预期，接种后 48 小时，在任何器官中均未检测到 A488 或 RVM9R-A488（图 3A，左）。另一方面，在接种 RVG9R 的小鼠组中，仅在脑组织中检测到强烈的 A488 荧光信号。此外，我们将本研究中使用的小鼠放置方式与先前报道的仰卧位方法17以及清醒状态下的给药方法在递送效率上进行了比较。我们给予固定剂量的 RVG9R-A488（100 µg），并在接种后 48 小时检测其生物分布。结果表明，将小鼠头部向下并前倾的体位可显著提高 RVG9R-A488 在整个脑组织中的穿透性和沉积量（图 3A，右）。相比之下，采用仰卧位接种的小鼠虽也有 RVG9R-A488 递送至脑部，但其强度不及使用固定装置的方法。为进一步验证 siRNA 向脑部的递送效果，我们在单次鼻内给予 RVG9R 与 400 pmol（5.2 µg）Cy5 标记的 siRNA 形成的复合物后，进行了全脑扫描。与 PBS 或 RVM9R 相比，RVG9R 复合物可导致 siRNA 在主要脑区（包括嗅球、皮层、海马、丘脑、下丘脑、中脑和小脑）中显著富集（图 3B）。

最后，我们采用RT-qPCR分析验证了靶向超氧化物歧化酶-1（SOD1）基因的功能性siRNA的细胞内递送效果。小鼠经鼻腔接种RVG9R:siSOD1（含13.2 µg siRNA），连续3天每日一次，末次接种后24小时检测SOD1 mRNA的表达水平。RVG9R:siSOD1给药显著降低了嗅球（63%）、皮层（47%）、海马（61%）、丘脑（53%）、下丘脑（55%）、中脑（39%）和小脑（30%）中的SOD1表达水平（图4）。综上所述，使用定位装置可实现RVG9R复合siRNA在小鼠中的简便经鼻接种，从而实现脑部特异性的siRNA递送，并诱导靶基因的功能性沉默。

定位装置的组装示意图，包含支架、定位座和加热系统。
图1：装置组装的实物图。 定位座通过螺丝固定在支架的适当高度位置。组装完成后，设备连接电源，以便在接种过程中加热至生理温度。请点击此处查看该图的放大版本。

使用微量移液器、乙醇、siRNA、定位装置的动物给药装置；实验示意图。
图 2：使用定位装置进行鼻内接种操作的实物图示。 （A）鼻内接种所需的实验设备。（B）动物置于装置上呈头部向下前屈位（左图），以及进行鼻内接种时滴加 2 µL 液滴的操作（右图）。 请点击此处查看该图的放大版本。

测试荧光剂在小鼠器官中的组织分布；脑荧光图像。
图 3：鼻内给药后荧光标记肽和siRNA的分布情况。 （A）单次鼻内接种RVG9R肽后48小时的体内分布。检测了经生理盐水（PBS）、A488、RVM-A488 和 RVG-A488 鼻内接种的小鼠脑组织及其他外周器官中的荧光信号（左图）。右图为上述处理后清醒状态下、仰卧位以及头部前倾向下固定于小鼠定位装置中的活体小鼠成像。 （B）RVG9R:siRNA复合物在脑内的分布（n = 每组3只）。通过共聚焦激光显微镜观察经生理盐水（PBS）、与对照肽复合的siRNA（RVM9R-siCy5）或靶向脑组织的肽RVG9R（RVG9R-siCy5）接种动物的全脑冷冻切片中Cy5标记的siRNA分布情况。比例尺为1 mm。缩写：o.b = 嗅球；ctx = 皮层；hippo = 海马；hypo = 下丘脑；tha = 丘脑；m.b = 中脑；cer = 小脑。 请点击此处查看本图的放大版本。

基因表达比较图表；皮层、海马体、丘脑；柱状图；统计结果。
图 4：经鼻给予 RVG9R:siSOD1 可在脑内多个区域诱导靶基因沉默。 在最后一次经鼻接种生理盐水（PBS）、RVG9R:siCD4（siCD4）、RVM9R:siSOD1（RVM9R）和 RVG9R:siSOD1（RVG9R）后 24 小时，通过 qPCR 检测小鼠指定脑区中 SOD1 mRNA 的表达水平。图中显示了嗅球、皮层、海马体（上排）、丘脑、下丘脑、小脑（中排）和中脑（下排）中 SOD1 的相对沉默效果。数据以 GAPDH 为内参进行归一化，并以生理盐水处理组小鼠对应数据为参照，表示为均值 ± 标准差（n = 每组 3 只）。右下角示意图展示了经鼻接种后各指定脑区中 SOD1 mRNA 的相对百分比。**P < 0.01，***P < 0.001。缩写：o.b = 嗅球；ctx = 皮层；hippo = 海马体；hypo = 下丘脑；tha = 丘脑；m.b = 中脑；cer = 小脑。 请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

我们开发了一种小鼠定位装置，可优化小鼠在鼻脑给药治疗中的体位。该装置具备多种功能，能够方便地同时操作多只动物。装置还配有加热垫，可在实验过程中维持动物的生理体温。通过专门设计的固定椅，可将麻醉后的小鼠保持在头低前倾的体位，同时最大程度减少动物的不适。定位椅的高度可调节，以便在给药时最佳地观察动物鼻孔。

经鼻给药（IN）在脑部递送方面存在若干固有局限性，包括鼻孔表面积较小（每次给药最大体积仅为20–30 µL）、鼻腔刺激、上皮损伤以及药物在鼻黏膜中吸收有限18。将小鼠置于仰卧位后经鼻给药，是一种通过移液器或连接至微量注射器的聚氨酯导管（24 G × 19 mm）将液态药物交替滴入动物鼻孔以实现脑部递送的方法19,20。尽管使用导管系统将药物释放至嗅觉上皮附近是一种潜在可行的策略，但重复给药易引起刺激或鼻腔炎症。此外，鼻腔空间狭小限制了该方法的应用，尤其在小鼠中，反复操作可能导致动物不适，且药物制剂可能滞留于鼻黏膜。另一种选择是对清醒小鼠进行经鼻治疗10。然而，该方法在经鼻接种过程中需要熟练的动物操作技术，同时会引起动物应激反应，因此不适合用于疾病模型，尤其是感染性疾病模型。此外，由于动物固定不充分，药物可能流入肺部或胃中，导致给药剂量不一致。本文所介绍的方法可帮助科研人员克服上述技术障碍。将小鼠头部置于下倾前屈的位置，可在吸气时减少药物从鼻腔向肺部的泄漏，有利于siRNA直接且选择性地递送至脑部。使用小鼠体位固定装置进行经鼻给药无需在接种过程中采用特殊手法抓持动物。该装置可同时处理四只动物，持续时间至少达30–45分钟。通过增加一个四工位支架条，可将通量扩展至同一实验周期内同时处理最多八只小鼠。因此，采用该方法，单名操作者即可在较长时间内对大量动物实现脑部药物递送。

鼻腔的解剖结构显著影响药物经鼻入脑的递送效果（如Merkus等人11和Ruigrok与de Lange21综述所述）。小鼠鼻腔的相对表面积是人类的15倍，嗅上皮的相对表面积则是人类的6倍。尽管人类与啮齿类动物在鼻腔解剖结构上存在显著差异，目前仍有约45项临床试验正在利用经鼻（IN）途径治疗多种脑部疾病（www.clinicaltrials.gov）。本研究所表明的是，在采用经鼻给药方式递送治疗药物时，科研人员应考虑多个因素，例如头部位置、睡眠状态以及合适的递送载体。

我们已证明荧光标记的siRNA可高效且特异性地沉积于小鼠脑组织中。此外，经鼻给予siRNA后观察到SOD1基因表达显著降低，证实了其功能效应。我们先前的研究一致表明，经鼻给予靶向西尼罗河病毒（WNV）RNA的RVG9R-siRNA复合物对WNV脑炎具有显著治疗效果15。值得注意的是，siRNA从鼻腔向脑部递送需要细胞靶向配体（RVG）和带正电荷的分子（9R）与siRNA形成复合物。若缺乏这些组分，分子将在给药后48小时通过体循环和淋巴管被清除（图3A）15。因此，在本研究所描述的实验设计中，我们在接种后48小时检测肽/siRNA的定位情况，以成像仅特异性保留在脑内的水平。该策略可轻松拓展应用于其他分子的递送，例如蛋白质、肽段、纳米颗粒或其他治疗剂，用于多种脑部相关疾病的治疗。

披露

P.K. 和 S.K.L. 是 Signet Biotech 的联合创始人。P.K. 是专利 PCT/US07/12,152 的共同发明人，该专利部分权利要求涉及 RVG9R。I.U.、K.C.、P.K. 和 S.K.L. 被列为一项已提交专利（PCT/KR2016/014220）的共同发明人，该专利包括与一种小鼠固定装置相关的权利要求。

致谢

本工作由韩国卫生部资助 & 福利（HI17C1046）资助项目，负责人：S.K.L.

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
商用检测试剂盒
iScript cDNA合成试剂盒BioRad货号# 1708891
RNAiso plusTaKaRa Bio货号# 9108
SYBR Premix ExTaqTaKaRa Bio货号# RR420A
染料
Alexa Fluor 488ThermoFisher货号# A30052
小鼠品系
Balb/cOrient Bio无6-8周龄，20-30克
寡核苷酸与引物
人CD4ST Pharm无正向：5’-GAUCAAGAGACUCCUCAGU-3’
siSOD1ST Pharm无正向：5’-GGUGGAAAUGAAGAAAGUA-3’
GAPDH引物ST Pharm无F: 5’-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3’ R: 5’-GGAGACAACCTGGTCCTCAG-3’
SOD1引物ST Pharm无F: 5’-CCAGTGCAGGACCTCATTTT-3’ R: 5’-CACCTTTGCCCAAGTCATCT-3’
多肽
RVG9RPeptron无YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSR
GKRASNGGGGRRRRRRRRR
RVM9RPeptron无MNLLRKIVKNRRDEDTQKSS
PASAPLDGGGGRRRRRRRRR
软件、算法与设备
FlowJo软件 4.3FlowJO, LLC无http://docs.flowjo.com/vx/
小鼠固定装置Signet Biotech无
Prism软件Graphpad无https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/
Prism软件Graphpad无https://www.graphpad.com/scientificsoftware/prism/

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