一种使用定制外固定架稳定的、可靠且可重复的大鼠股骨临界尺寸节段性骨缺损模型

摘要

体内哺乳动物大段骨缺损模型对于研究骨愈合机制和骨科治疗方法的研究人员至关重要。本文介绍了一种通过外固定装置稳定大鼠股骨节段性缺损的可重复造模方案。

摘要

骨科研究高度依赖动物模型，以在活体（in vivo）条件下研究骨愈合机制并探索新的治疗方法。临床上，节段性骨缺损达到临界尺寸时治疗难度较大，而建立一种可靠且可活动的小型动物节段性股骨缺损模型将有助于相关研究。本研究提出了一种优化的手术方案，可稳定、可重复地在大鼠股骨上创建一个5 mm的临界皮质骨缺损，并使用外固定架进行固定。通过定制导向装置将4枚克氏针以双侧皮质固定方式置入，再连接改良的外固定装置实现稳定。使用摆动式骨锯制造骨缺损。将仅含胶原海绵或经重组人骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）浸润的胶原海绵植入缺损区域，并通过X线片对骨愈合过程进行为期12周的监测。12周后处死大鼠，对切除的对照组和治疗组股骨进行组织学分析。结果显示，仅植入胶原海绵的骨缺损未实现骨性连接（形成骨不连），而接受rhBMP-2治疗的缺损则出现骨膜性骨痂形成及新骨重塑。动物在植入术后恢复良好，外固定装置在12周内有效维持了股骨缺损的稳定性。该简化的手术模型可广泛应用于活体（in vivo）骨愈合机制研究，以及新型骨科生物材料和再生疗法的评估。

引言

骨科创伤外科专注于治疗各种复杂的骨折。临床上，由于周围肌肉和骨膜的再生能力降低以及局部血管生成失败，大段骨干骨缺损的治疗一直较为困难¹。现代治疗方法包括手术固定联合植骨、延迟植骨（Masquelet技术）、骨搬运、融合或截肢^2,3,4。对于创伤后仍保留行走功能且远端肢体功能良好的大多数患者而言，保肢显然是更优的治疗选择⁵。这些保肢治疗通常需要在较长的治疗过程中进行分期手术干预。一些学者认为，与内固定相比，外固定在这些应用中更具优势，因其植入时对组织的损伤更小、植入物表面积更小，且术后固定器更具可调节性⁶。然而，目前一项前瞻性随机对照试验正在进行中，旨在澄清在胫骨严重开放性骨折治疗中内固定与外固定之间的争议⁷。遗憾的是，无论选择哪种治疗方法，并发症和治疗失败的发生率仍然较高^8,9。无论采用何种治疗方式，针对节段性骨缺损，外科医生都必须应对节段性骨干缺损所带来的重大挑战。矫正节段性缺损时，必须在最大程度稳定骨骼的同时，促进成骨过程

方案

本研究中使用的大鼠每日护理均遵循《美国兽医协会动物安乐死指南：2013年版》¹⁶。在项目开始前，威斯康星大学麦迪逊分校机构动物护理和使用委员会已对本实验方案进行评估并批准实施。

1. 动物

1. 使用体重约为 350 g 的远交系 Sprague-Dawley 雄性大鼠。

2. 骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）浸渍海绵支架的制备

注意：支架制备应在植入股骨前立即进行（参见步骤 6.14）。

1. 按照已上市的rhBMP-2骨移植试剂盒的使用说明操作，该试剂盒包含胶原海绵、冻干rhBMP-2和用于重悬的无菌水¹⁷。在保持无菌条件下，用无菌水将rhBMP-2重悬至浓度为1.5 mg/mL。
2. 使用无菌剪刀和无菌尺，修剪浸有rhBMP-2的胶原海绵，使其重塑为适合5 mm × 3 mm × 3 mm缺损的形状。
3. 使用注射器将rhBMP-2溶液均匀滴加在胶原海绵上，使其充分吸收。

3. 自定义外固定装置的制备

注意：更完整的尺寸列表请参见

结果

手术由一名外科医生在一名助手的协助下进行，耗时约一小时。经过手术优化后，术中和术后并发症显著减少，且使用定位夹具装置可确保股骨缺损的尺寸（5 × 3 × 3 mm）和位置的一致性。大鼠在麻醉苏醒后立即恢复行走，未表现出任何异常行为模式；其步态无痛性跛行，且未见对外固定器产生不适反应。

最靠近近端的克氏针选用无螺纹克氏针（图2B），因为当使用带螺纹克氏针时，近端克氏针断裂的风险最高。在某些情况下，特别是在未使用rhBMP-2或支架的对照动物中，其骨缺损未表现出任何愈合或骨形成迹象，约8周后出现一根或多根克氏针尖端断裂，如仅植入海绵的对照组股骨X线片所示（图3）。

通过放射影像和组织学（H&E 染色）分析骨愈合.......

讨论

骨科损伤（如完全性骨折）的小型动物模型能够支持探索成骨机制以及评估生物材料治疗潜力的研究²⁰。本研究介绍了一种通过定制外固定器稳定的节段性骨缺损大鼠模型，该模型可由实验室与生物医学工程团队轻松复制，用于进一步研究承重条件下的骨修复过程。

以往在大鼠模型中使用临界尺寸骨缺损的研究通常依赖于内固定钢板^21,22,23,24。尽管两种固定方法在临床上均可接受，但外固定具有明显优势，包括造成更少的软组织损伤和失血量，减少总的植入物表面积以最大限度降低细菌定植的机会，并允许术后调节以及分阶段的外科干预⁶。以往的动物骨折外固定模型采用了不同的钢板材料、钢针固定方式和/或骨切割方法^12,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.9% 无菌生理盐水	Baxter	2F7124	用于伤口冲洗和补液
10% 碘/聚维酮	Carefusion	1215016	用于皮肤准备
10% 中性缓冲福尔马林	VWR	89370094	用作固定剂
1mm 无螺纹克氏针	DePuy Synthes	VW1003.15	已灭菌，用于最靠近近端的针孔
1mm 有螺纹克氏针	DePuy Synthes	VW1005.15	已灭菌，用于最远端的3个针孔
2×2 纱布	Covidien	4006130	已灭菌，用于皮肤准备和吸收血液
4-0 Vicryl 缝合线	Ethicon	4015304	用于关闭肌肉层和皮肤层
4-40 x 0.25", 18-8 不锈钢圆头内六角螺钉	通用		外固定架组件
4200 无线驱动器	Stryker	OR-S-4200	用于钻入克氏针
4×4 纱布	Covidien	1219158	已灭菌，用于吸收血液
70% 乙醇			用于皮肤准备
Baytril	Bayer Healthcare LLC, 动物保健部门	312.10010.3	作为抗生素加入饮水中
头孢唑啉	Hikma Pharmaceuticals	8917156	术前抗生素
CleanCap Gaussia 荧光素酶 mRNA (5moU)	TriLink Biotechnologies	L-7205	编码 Gaussia 荧光素酶的修饰 mRNA，使用时需保持在冰上
天然腔肠素	NanoLight Technology	303	Gaussia 荧光素酶的底物，用于体内评估荧光素酶活性
双效抗生素软膏	Johnson & Johnson consumer Inc	8975432	术后应用于针孔部位作为伤口护理
双切口微型刀片	Stryker	5400-003-410	用于在股骨上制造5mm缺损
乙二胺四乙酸 (EDTA)	Fisher	BP120-500	用于脱钙骨组织以进行组织学准备
缓释布托啡诺	ZooPharm		用作为期3天的镇痛药
带孔洞的手术巾	3M	1204025	用于建立无菌区域
TPS 手持式连接线	Stryker	OR-S-5100-4N	用于在股骨上制造5mm缺损
加热垫	K&H Pet Products	121239	维持大鼠体温
六角头螺丝刀	Wiha	263/1/16 " X 50	用于紧固外固定架
诱导室	通用		用于大鼠麻醉
用重组人骨形态发生蛋白-2浸润胶原海绵	Medtronic	7510200	临床上相关治疗，作为阳性对照
异氟烷	Clipper	10250	用于大鼠麻醉
IVIS	Perkin Elmer	124262	生物发光成像方式
定位夹具	定制		用于放置双皮质骨针
Lipofectamine MessengerMAX	Fisher Scientific	LMRNA003	mRNA 复合剂，可实现 mRNA 递送
Sensorcaine-MPF（布比卡因 (0.25%) 和肾上腺素 (1:200,000)）	APP Pharmaceuticals, LLC	NDC 63323-468-37	应用于手术部位以缓解疼痛并实现血管收缩
无菌水	Hospira	8904653	用作头孢唑啉粉末的溶剂
钛制外固定板	定制		使用废弃钛材料和铣床在实验室自制
全面性能系统 (TPS) 控制台	Stryker	OR-S-5100-1	用于在股骨上制造5mm缺损
TPS 微型矢状锯	Stryker	OR-S-5100-34	用于在股骨上制造5mm缺损
配备 DXA 的 Ultrafocus Faxitron	Faxitron		高分辨率放射成像方式
Uniprim 大鼠饲料	Envigo	TD.06596	含药大鼠饲料
TPS 通用手控开关	Stryker	OR-S-5100-9	用于在股骨上制造5mm缺损
Vetbond 组织粘合剂	3M	1469	用于皮肤闭合