中等通量筛选实验用于评估对人精子Ca2+信号传导和顶体反应的影响

摘要

本文描述了两种用于评估化合物对人精子Ca²⁺信号传导和顶体反应影响的中通量检测方法。这些方法可用于快速、简便地筛选大量化合物对人精子Ca²⁺信号传导和顶体反应的影响。

摘要

Ca²⁺信号传导对精子细胞的正常功能和男性生育力至关重要。同样，顶体反应对于人类精子穿透透明带并使卵子受精的能力也极为关键。因此，研究化合物（如环境化学物质或候选药物）对人类精子中Ca²⁺信号传导和顶体反应的影响具有重要意义，既可以评估其对精子功能可能产生的不利影响，也可探索其作为避孕剂的潜在用途。本文介绍了两种中等通量检测方法：1）基于荧光的检测法，用于评估化合物对人类精子Ca²⁺信号传导的影响；2）图像细胞计量学检测法，用于评估人类精子的顶体反应。这些检测方法可用于大规模筛选化合物对人类精子Ca²⁺信号传导和顶体反应的影响。此外，还可利用这些方法为单个化合物生成高度特异性的剂量-反应曲线，确定两种或多种化合物之间可能存在的相加或协同效应，并通过使用CatSper抑制剂进行竞争性抑制实验来研究其药理作用机制。

引言

本文所述的两种检测方法旨在研究多种化合物对人类精子中Ca²⁺信号传导和顶体反应的影响，已有若干文献在使用这些检测方法时报道过此类研究结果^{1,2,3,4,5,6,7}。Ca²⁺信号传导和顶体反应均对正常人类精子细胞功能及男性生育力至关重要。

人类精子细胞的总体目标是使卵子受精。为了能够成功且自然地完成卵子受精，精子细胞在通过女性生殖道的过程中，其各项功能必须受到严密调控^8,9。许多精子细胞功能通过细胞内 Ca²⁺ 浓度 [Ca²⁺]_i 进行调控（例如精子运动能力、趋化性以及顶体反应）¹⁰。此外，一种称为获能的成熟过程（使精子获得受精能力）也部分受 [....

方案

本方案中人类精液样本的采集与分析遵循丹麦首都地区研究伦理委员会的指导原则。所有精液样本均在志愿者捐赠者知情同意后获取。样本送达后即进行完全匿名化处理。每位捐赠者因参与研究的不便，每份样本获得500丹麦克朗（约合75美元）的酬金。样本在送达当日进行分析，并在实验室实验结束后立即销毁。

注意：中通量 Ca²⁺-信号检测在步骤 4-5 中描述，中通量顶体反应检测在步骤 6-7 中描述。人输卵管液（HTF⁺）培养基的制备方案见步骤 1，用于检测的精子细胞纯化过程见步骤 2-3。

1. 人输卵管液（HTF⁺）培养基的制备

注意：使用适当规格的容量瓶、1 L 量筒、磁力搅拌器、表 1 和 表 2 中列出的盐类、纯化水、0.2 µm 孔径滤器以及 50 mL 塑料管。

1. 用纯化水配制盐类的储备溶液（表1）。
   1. 加入所列数量的盐 表1 将适量纯化水加入适当体积的容量瓶中，至略低于目标体积处，使用磁力搅拌器充分混匀。
   2. 当盐完全溶解后，移除磁子，并加入纯化水至所需最终体积。
   ....

结果

代表性实验结果展示了4种化合物（A、B、C和D）与阳性对照（progesterone）及阴性对照（buffer）对[Ca²⁺]_i 使用中等通量 Ca 检测法检测人精子中的钙离子²⁺信号转导实验可参见 图4a. 在 图4b，显示了由峰值 ΔF/F 得出的黄体酮剂量反应曲线₀ (%) 数据由黄体酮系列稀释浓度在另一项中通量钙检测实验中测得²⁺-信号检测实验。对Ca²⁺-信号检测实验的说明见步骤5。在中等通量顶体反应检测实验中，使用阴性对照（DMSO）或两种阳性对照（孕酮和离子霉素）处理已获能的人类精子细胞以诱导顶体反应，其代表性实验结果如上图所示 图3. 从3种测试条件下获得的象限门控散点图如图所示。顶体反应数据的分析方法在第7步中说明。

讨论

中通量 Ca²⁺ 信号检测基于对单个微孔的荧光测量，每个微孔含有约 250,000 个精子细胞。所捕获的信号来自孔内所有单个精子细胞的平均值。因此，该检测无法提供关于精子细胞内 [Ca²⁺]_i 变化具体发生位置、发生 [Ca²⁺]_i 变化的精子细胞比例，以及单个细胞间反应异质性的空间信息。要获得此类信息，必须采用单细胞分辨率的实验方法（例如，如文献^50,52所述）。该技术的另一局限性在于时间分辨率，其量级为秒级。尽管在加入 25 µL 溶液时 50 µL 的精子样品已充分混匀，但测量只能在微孔板所在的抽屉重新放回荧光酶标仪后才可开始。若需更高的时间分辨率，则必须采用其他技术（例如停流式荧光测定法^13,50）。与单细胞或单孔方法相比，中通量 Ca²⁺ 信号检测的优势在于，利用微.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.2 µm 孔径滤膜	Thermo Fisher Scientific, USA	296-4545
1 L 量筒	Thermo Fisher Scientific, USA	3662-1000
1、4 和 2 mL 塑料管	Eppendorf, Germany	30120086 和 0030120094
12 道移液器	Eppendorf, Germany	4861000813
384 孔多孔板	Greiner Bio-One, Germany	781096
15 和 50 mL 塑料管	Eppendorf, Germany	0030122151 和 30122178
A2 载玻片	ChemoMetec, Denmark	942-0001
自动重复移液器	Eppendorf, Germany	4987000010
CaCl2
离心机
用于精液样本的洁净广口塑料容器
二甲基亚砜（DMSO）
异硫氰酸荧光素标记的豌豆凝集素（FITC-PSA）	Sigma-Aldrich, Germany	L0770
Fluo-4 AM	Thermo Fisher Scientific, USA	F14201
FLUOstar OMEGA 荧光酶标仪	BMG Labtech, Germany
无水葡萄糖
HEPES
Hoechst-33342	ChemoMetec, Denmark	910-3015
人血清白蛋白（HSA）	Irvine Scientific	9988	用于添加至 HTF+ 中
固定液，含 0.6 M NaHCO3 和 0.37%（v/v）甲醛的蒸馏水溶液
培养箱
KCl
KH2PO4
磁力搅拌器
MgSO4
乳酸钠
NaCl
NaHCO3
NC-3000 图像细胞仪	ChemoMetec, Denmark	970-3003
移液器及吸头
碘化丙啶（PI）	ChemoMetec, Denmark	910-3002
纯化水
用于放置 50 mL 塑料管并呈 45° 角的支架
S100 缓冲液	ChemoMetec, Denmark	910-0101
SP1-卡盒	ChemoMetec, Denmark	941-0006
适当规格的容量瓶
涡旋振荡器