中等通量筛选实验用于评估对人精子Ca2+信号传导和顶体反应的影响

摘要

本文描述了两种用于评估化合物对人精子Ca²⁺信号传导和顶体反应影响的中通量检测方法。这些方法可用于快速、简便地筛选大量化合物对人精子Ca²⁺信号传导和顶体反应的影响。

摘要

Ca²⁺信号传导对精子细胞的正常功能和男性生育力至关重要。同样，顶体反应对于人类精子穿透透明带并使卵子受精的能力也极为关键。因此，研究化合物（如环境化学物质或候选药物）对人类精子中Ca²⁺信号传导和顶体反应的影响具有重要意义，既可以评估其对精子功能可能产生的不利影响，也可探索其作为避孕剂的潜在用途。本文介绍了两种中等通量检测方法：1）基于荧光的检测法，用于评估化合物对人类精子Ca²⁺信号传导的影响；2）图像细胞计量学检测法，用于评估人类精子的顶体反应。这些检测方法可用于大规模筛选化合物对人类精子Ca²⁺信号传导和顶体反应的影响。此外，还可利用这些方法为单个化合物生成高度特异性的剂量-反应曲线，确定两种或多种化合物之间可能存在的相加或协同效应，并通过使用CatSper抑制剂进行竞争性抑制实验来研究其药理作用机制。

引言

本文所述的两种检测方法旨在研究多种化合物对人类精子中Ca²⁺信号传导和顶体反应的影响，已有若干文献在使用这些检测方法时报道过此类研究结果^{1,2,3,4,5,6,7}。Ca²⁺信号传导和顶体反应均对正常人类精子细胞功能及男性生育力至关重要。

人类精子细胞的总体目标是使卵子受精。为了能够成功且自然地完成卵子受精，精子细胞在通过女性生殖道的过程中，其各项功能必须受到严密调控^8,9。许多精子细胞功能通过细胞内 Ca²⁺ 浓度 [Ca²⁺]_i 进行调控（例如精子运动能力、趋化性以及顶体反应）¹⁰。此外，一种称为获能的成熟过程（使精子获得受精能力）也部分受 [Ca²⁺]_i 调控¹⁰。Ca²⁺ 外排型 Ca²⁺-ATP 酶泵¹¹ 在人类精子细胞膜上维持约 20,000 倍的 Ca²⁺ 浓度梯度，静息状态下的 [Ca²⁺]_i 为 50–100 nM。当 Ca²⁺ 被允许跨膜进入细胞时（例如通过 Ca²⁺ 通道的开放），将发生显著的 Ca²⁺ 内流，导致 [Ca²⁺]_i 升高。然而，精子细胞还含有细胞内 Ca²⁺ 储存库，这些储存库可释放 Ca²⁺，从而同样引起 [Ca²⁺]_i 的升高¹²。有趣的是，迄今为止在人类精子细胞中发现的所有通道介导的 Ca²⁺ 内流均通过 CatSper（精子阳离子通道）实现，该通道仅在精子细胞中表达¹¹。在人类精子细胞中，CatSper 可被内源性配体孕酮和前列腺素通过不同的配体结合位点激活^13,14,15，从而引发 Ca²⁺ 快速内流进入精子细胞。卵子附近的两个主要来源可提供高水平的这些内源性配体：其一是卵泡液，其中含有高浓度的孕酮¹⁶。排卵时，卵泡液随成熟卵泡与卵子一同释放，并与输卵管内的液体混合¹⁷；另一个主要来源是包围卵子的卵丘细胞，它们释放高水平的孕酮和前列腺素。研究表明，精子细胞中由孕酮诱导的 Ca²⁺ 内流可介导精子向卵子的趋化性^9,18，调控精子运动能力^19,20，以及促进顶体反应²¹。这些由 [Ca²⁺]_i 调控的精子功能必须在正确的时间以正确的顺序依次被激活，这对成功实现卵子受精至关重要⁸。与此一致的是，研究发现孕酮诱导的 Ca²⁺ 内流若处于次优水平，将与男性生育力下降相关^{22,23,24,25,26,27,28,29}，而功能正常的 CatSper 对男性生育力至关重要^{26,30,31,32,33,34,35,36}。

当精子细胞到达卵子时，受精过程需要依次发生一系列事件：1）精子细胞必须穿透周围的卵丘细胞层，2）与透明带结合，3）胞吐顶体内容物，即所谓的顶体反应。³⁷，4）穿透透明带，以及 5）与卵细胞膜融合以完成受精³⁸要完成这些步骤并使卵子受精，精子必须首先经历获能过程。¹¹，当精子细胞离开含有精液的液体环境时开始 "去获能" 因素³⁹ 并游入含有高浓度碳酸氢盐和白蛋白的雌性生殖道液体中³⁷获能使精子细胞能够发生超激活，即一种鞭毛剧烈摆动的运动形式，以及顶体反应。³⁷超激活运动是穿透透明带所必需的⁴⁰，顶体含有多种水解酶，有助于精子穿透过程⁴¹此外，顶体反应通过暴露精子表面某些特定的膜蛋白，使精子具备与卵子融合的能力，而这些膜蛋白是精卵融合所必需的。⁴²因此，精子必须具备超激活能力和顶体反应能力，才能成功使卵子受精。^40,42与小鼠精子细胞中观察到的情况相反^43,44,45只有顶体完整的精子细胞才能与透明带结合⁴⁶当人类精子细胞与透明带结合后，必须发生顶体反应才能穿透透明带⁴¹ 并暴露与卵细胞融合所必需的特定膜蛋白³⁸因此，人类精子顶体反应的发生时机对于受精能否成功至关重要。

如上所述，Ca²⁺信号转导对精子细胞的正常功能至关重要⁸，因此，能够大规模筛选化合物对人精子细胞中Ca²⁺信号转导的影响具有重要意义。同样，只有在正确的时间和位置发生顶体反应的人精子细胞才能穿透透明带并使卵子受精^46,47，因此，能够检测化合物对人精子细胞顶体反应影响的能力也具有重要意义。为此，本文描述了两种中通量筛选方法：1）用于检测化合物对人精子细胞Ca²⁺信号转导影响的实验；2）用于检测化合物诱导人精子细胞发生顶体反应能力的实验。

Assay 1 是一种中通量 Ca²⁺-信号检测实验。该技术基于荧光酶标仪，可同时在多个孔中监测荧光随时间的变化。Ca²⁺-敏感的荧光染料，Fluo-4 的 K_d 用于 Ca²⁺≈ 335 nM，且以AM（乙酰氧基甲酯）形式存在时具有细胞膜通透性。使用Fluo-4可检测[Ca²⁺]_i 随着时间推移以及向精子细胞中添加感兴趣化合物后进行检测。该检测方法由 Timo Strünker 实验室于 2011 年开发¹³ 并已在此后多项研究中用于筛选对Ca有影响的化合物²⁺人类精子中的信号传导^1,2,3,4,5此外，类似的方法已被用于筛选多种候选药物⁴⁸此外，该检测方法还可用于评估药物的作用机制^1,2,3,4,5，剂量-反应曲线^1,2,3,4,5，竞争性抑制^1,2，加性^1,2，以及协同作用³ 目标化合物

实验2是一种中通量的顶体反应检测方法。该基于图像细胞仪的技术使用三种荧光染料——碘化丙啶（PI）、异硫氰酸荧光素偶联的豌豆凝集素（FITC-PSA）和Hoechst-33342，用于测定样品中发生顶体反应的活精子细胞数量。该方法由Zoppino等人⁴⁹报道的类似流式细胞术方法改进而来，并已在多项研究中应用^6,7。与钙离子（Ca²⁺）信号检测类似，该顶体反应检测也可用于评估目标化合物的剂量-反应曲线、抑制作用、加和效应以及协同效应。

方案

本方案中人类精液样本的采集与分析遵循丹麦首都地区研究伦理委员会的指导原则。所有精液样本均在志愿者捐赠者知情同意后获取。样本送达后即进行完全匿名化处理。每位捐赠者因参与研究的不便，每份样本获得500丹麦克朗（约合75美元）的酬金。样本在送达当日进行分析，并在实验室实验结束后立即销毁。

注意：中通量 Ca²⁺-信号检测在步骤 4-5 中描述，中通量顶体反应检测在步骤 6-7 中描述。人输卵管液（HTF⁺）培养基的制备方案见步骤 1，用于检测的精子细胞纯化过程见步骤 2-3。

1. 人输卵管液（HTF⁺）培养基的制备

注意：使用适当规格的容量瓶、1 L 量筒、磁力搅拌器、表 1 和 表 2 中列出的盐类、纯化水、0.2 µm 孔径滤器以及 50 mL 塑料管。

1. 用纯化水配制盐类的储备溶液（表1）。
   1. 加入所列数量的盐 表1 将适量纯化水加入适当体积的容量瓶中，至略低于目标体积处，使用磁力搅拌器充分混匀。
   2. 当盐完全溶解后，移除磁子，并加入纯化水至所需最终体积。
2. 将储备液转移至瓶中，保存至使用。
   注意： 储备液可长期保存并重复使用：葡萄糖和HEPES置于-20 °C保存，其余储备液于室温（RT）保存。
3. 配制1升HTF⁺ 来自储备液的培养基（表2）。
   1. 确保所有储备液在使用前完全溶解并充分混匀。
   2. 加入所列的储备液和盐的量 表2 加入1升量筒中，并加纯水至900毫升。
   3. 使用磁力搅拌器充分混匀，并用 NaOH 溶液调节 pH 至 7.35。
   4. 移除磁铁，并加入纯化水至1,000 mL。
4. 无菌滤液 HTF⁺ 通过0.2 µm孔径滤器过滤培养基，分装HTF⁺ 将培养基转移至50 mL塑料管中，4 °C保存备用。
5. 实验开始前，向50 mL等分试样中加入165 µL的Na-丙酮酸盐，使Na-丙酮酸盐的终浓度为0.33 mM。
   注意： 人类输卵管液培养基也可从多家商业供应商处获得。使用 4 mM HCO₃⁻ 时₃^- 培养基中，样品可在孵育箱中闭盖孵育，无需额外补充CO₂₂ 在空气中保持pH无显著漂移。若CO₂ 孵箱可用时，相应量的 CO₂ 可使用 Henderson-Hasselbalch 方程计算，并加以利用。若使用 25 mM HCO₃^- 培养基中，样品应在开放盖子的条件下于CO₂培养箱中孵育₂ 含相应浓度CO₂的培养箱₂ （取决于大气压，通常为5-10%），以避免pH值漂移。CO₂的具体含量₂ 可以使用 Henderson-Hasselbalch 方程进行计算。

2. 通过上游法纯化活动精子细胞（图1）

注意：使用洁净的广口塑料容器收集精液样本，并准备一个培养箱、50 mL 塑料离心管、可将 50 mL 塑料离心管以 45° 角放置的管架、HTF⁺ 培养基（按步骤 1 配制或从商业供应商获取）、离心机以及人血清白蛋白（HSA）。

1. 获取通过手淫方式新鲜捐献的人类精液样本，并射入洁净的广口塑料容器中。仅使用符合世界卫生组织（WHO）人类精液检查与处理实验室手册所规定参数的精液样本。
2. 将样本在 37 °C 下孵育 15–30 分钟，使其充分液化。
3. 将 50 mL 含 4 mM HCO₃^- 的 HTF⁺ 培养基加热至 37 °C。
4. 将洁净的 50 mL 塑料离心管以 45° 角度置于试管架中（以增加液体间的表面积）。每毫升原始精液使用 1 支试管。
5. 向每支试管中加入 4 mL 预热的 HTF⁺ 培养基。
6. 小心地将 1 mL 液化后的精液样本用移液器加至含有 4 mL 预热 HTF⁺ 的每支试管底部。避免产生气泡。
7. 盖紧管盖，并在 37 °C 下孵育 1 小时。
8. 轻柔地吸取并尽可能多地将上层液体部分（含活动精子的 HTF⁺）转移至新的 15 mL 塑料离心管中，注意不要混入底层部分（含不动和死亡细胞的精液）。通常，安全转移 3.5 mL 上层液体而不扰动底层部分是可行的。为避免吸液时产生湍流，可将移液器吸头最末端以 45° 角剪去 1–2 mm，以获得更大的开口。
9. 用 HTF⁺ 补充 15 mL 塑料离心管至满，以洗涤细胞，并在室温下以 700 × g 离心 10 分钟。
10. 轻柔地吸除并弃去上清液，将精子细胞沉淀重悬于 2 mL HTF⁺ 中。
11. 取 20 µL 精子悬液转移至两个小型塑料管中，用于精子浓度测定（见步骤 3）。
12. 用 HTF⁺ 补充 15 mL 塑料离心管至满，以洗涤细胞，并在室温下以 700 × g 离心 10 分钟。
13. 轻柔地吸除并弃去上清液，将精子细胞沉淀重悬至 10 × 10⁶ 个细胞/mL（根据步骤 2.11 测定的细胞浓度进行调整）。
    1. 对于使用未获能精子细胞的实验（常规 Ca²⁺ 信号检测）
       1. 将细胞重悬于含 4 mM HCO₃^- 的 HTF⁺ 中。
       2. 每毫升 HTF⁺ 中加入 30 µL 人血清白蛋白（HSA）（100 mg/mL），使终浓度为 3 mg/mL。
       3. 盖紧管盖，并在 37 °C 下孵育 ≥1 小时。
    2. 对于使用获能精子细胞的实验（顶体反应检测）
       1. 将细胞重悬于含 25 mM HCO₃^- 的 HTF⁺ 中。
       2. 每毫升 HTF⁺ 中加入 30 µL HSA（100 mg/mL），使终浓度为 3 mg/mL。
       3. 松盖放置，并在 37 °C 下孵育 ≥3 小时，同时提供相应浓度的 CO₂（见步骤 1，通常为 5–10% CO₂）。

3. 精子细胞计数

注意：精子细胞可采用手动计数⁵⁰，或如本文所述使用影像细胞计数仪⁵¹进行计数。请使用影像细胞计数仪、涡旋振荡器、S100缓冲液、SP1样本盒以及经游上法纯化的精子细胞（按步骤2制备）。

1. 根据预期浓度（通过步骤 2.10 中对沉淀物的目测评估），在圆底 2 mL 管中用 S100 缓冲液将 20 µL 等分试样稀释 10、20、30、50 或 90 倍。选择最接近预期浓度的稀释倍数（例如，若预计上泳后精子浓度为每毫升 15 × 10⁶ 个精子细胞，则将 20 µL 精子样本与 380 µL S100 缓冲液混合，稀释倍数为 20）。
2. 使用涡旋振荡器在最大 700 rpm 条件下充分混匀 10 秒，将 SP1-检测盒浸入样本中，并完全按下白色推杆，将一定量样本吸入检测盒内。
3. 打开图像细胞仪，将检测盒放入托盘中，并根据所选稀释倍数（步骤 3.1 中确定）运行“PI 染色人精子细胞计数检测”Count of PI Stained Human Sperm Cells Assay。
4. 用另一份 20 µL 样本重复步骤 3.1–3.3，使用与第一次 20 µL 样本测得浓度最接近的稀释倍数。
5. 根据两次测量结果计算精子细胞浓度的平均值。
6. 将精子细胞浓度的平均值乘以原始体积，得到总精子细胞数（在步骤 2 中，该原始体积为 2 mL）。

4. 胞内游离Ca²⁺浓度变化的测定²⁺-浓度（[Ca²⁺]_i使用 Ca²⁺-荧光测定法（图2）

注意：使用荧光酶标仪、384孔板、Fluo-4 AM、上游泳法纯化的精子细胞（步骤2中制备）、待测化合物以及阳性和阴性对照品、自动重复移液器和12通道移液器。

1. 将22.7 µL二甲基亚砜（DMSO）加入含50 µg Fluo-4 AM的试剂瓶中，配制成2 mM Fluo-4 AM储备液，并充分混匀。
2. 向新试管中加入700 µL上浮法回收的精子悬液（按步骤2所述为已获能或未获能状态）。700 µL精子样本量可用于分析384微孔板中24个孔组成的一行（用于检测3个对照和9种化合物，每种设两个复孔）。
3. 向700 µL精子悬液中加入3.5 µL Fluo-4 AM储备液，使Fluo-4 AM的终浓度为10 µM。
4. 37 °C 避光孵育 45 分钟。
5. 以 700 x g 离心样品 g 孵育10分钟，吸除上清液以去除过量的Fluo-4。
6. 在HTF中重悬染色后的沉淀⁺ 至 5 × 10⁶ 细胞/mL（即, 使用第4.2步中所取细胞悬液体积的2倍
7. 在步骤4.4和4.5的孵育和离心期间，分别配制化合物和对照品的稀释液。
   1. 在HTF中稀释化合物，同时设置阴性对照（含载剂的缓冲液）和阳性对照（孕酮）⁺将化合物和对照品稀释至所需终浓度的3倍，因为在步骤4.16中将其加入精子细胞时会进行1:3的稀释。
   2. 将稀释液的试管放置于试管架上，试管之间的间距应与4.16步骤中使用的12通道移液器的移液头间距相对应。
8. 使用自动重复移液器（24步，每步50 µL）。
   1. 用移液器将经Fluo-4染色的精子样品轻轻吹打混匀，上下吹打一次即可。
   2. 向384孔微孔板的一行中的24个孔各加入50 µL等分试样。
9. 将微孔板放入30 °C的荧光酶标仪中，并关闭抽屉。
10. 选择适用于Fluo-4的实验方案。在480 nm处激发荧光，并在520 nm处记录发射光信号。使用该设置下尽可能快的循环时间。
    注意： 每个孔和底部光学元件至少使用10次闪光，条件允许时。
11. 选择一行中的一个孔，并调节增益至目标值20%。
12. 开始测量。
13. 在前5个循环中控制基线。
    1. 如果荧光信号随时间逐渐增强或减弱，应立即停止实验，重新调整增益参数，然后重新开始实验。
    2. 如果某一行中各个孔的基线差异较大，则可能是步骤 4.8 中移液操作不够准确，或样品在移液前未充分混匀。应弃用该次实验。
    3. 如果该行各孔的荧光读数在前5个循环期间保持一致且稳定，则继续进行下一步操作。
14. 经过10个循环（用于基线）后，暂停实验。
15. 推出装有微孔板的抽屉。
16. 使用12通道移液器（分两步，每步25 µL），迅速将25 µL已配制的化合物和对照品溶液（来自步骤4.7）加入同一行的12个孔的双复孔（共24孔）中。由于各孔中已含有50 µL染色精子样本，溶液将被稀释至1:3。
17. 尽快继续测量（抽屉将自动关闭），以避免遗漏添加化合物和对照物后诱导的任何荧光信号。添加化合物和对照物后的荧光变化（ΔF）将被记录。
18. 运行实验，直至记录到阳性对照和目标化合物的荧光信号。
19. 停止实验，并将原始荧光数据导出，按步骤5进行分析。
    注意： 通常使用 Fluo-4 AM 作为 Ca²⁺-敏感的荧光团在该检测中，但其他Ca²⁺-敏感的荧光染料也可使用，前提是其激发和发射光谱与荧光酶标仪的滤光片匹配。根据所选荧光染料的不同，需确保增益水平设置在一个“安全”范围内，使诱导产生的荧光信号峰值处于仪器的检测量程之内。可通过在特定增益设置下向一个孔中加入离子霉素来测试：若由此产生的荧光信号超过阈值，则应降低增益后重新尝试。部分研究者使用Pluronic F-127以促进Fluo-4的加载^1,13，但研究发现这并非必要²同时测量的最大行数取决于两个因素。1）仪器的循环时间：如果循环时间过长，[Ca²⁺]_i 可能会被遗漏。每次最多测量两行，以保持较短的循环时间；2）步骤4.16中的移液速度：使用12通道移液器，可快速将12种不同溶液加入1或2行的12个重复孔（共24孔）中（例如，一行预先用溶剂预孵育，另一行预先用抑制剂预孵育），而不会错过诱导的Ca²⁺ 峰。然而，不建议尝试将24种不同的溶液同时加入两行以进行并行测量，因为在连续的两次移液步骤之间必须更换移液吸头，这会引发Ca²⁺ 峰可能被遗漏。

5. 钙数据的分析²⁺-荧光光度法

1. 打开在步骤4中获得并导出的原始荧光数据。
2. 计算复孔的平均值。如果复孔之间存在较大差异，则舍弃该特定孔的数据。
3. 将前10个循环定义为基线。
4. 计算ΔF/F₀ (%)，即在加入化合物和对照后，荧光随时间的变化量（ΔF）相对于前10个循环（基线）期间平均基础荧光（F₀）的百分比变化。
5. 如果使用该数据生成剂量-反应曲线，需从其他孔的读数中减去阴性对照的读数，以消除加样误差。

6. 顶体反应的检测

注意：使用成像细胞仪、培养箱、荧光染料：碘化丙啶（PI）、FITC-PSA 和 Hoechst-33342，待测化合物以及阳性和阴性对照品，含有 0.6 M NaHCO₃ 和 0.37%（v/v）甲醛的蒸馏水固定液，A2 载玻片，以及经梯度上浮法纯化并完成获能处理的精子细胞（按步骤 2 制备）。

1. 在HTF⁺中配制含有PI（5 µg/mL）、FITC-PSA（50 µg/mL）和Hoechst-33342（100 µg/mL）的染色液，使用涡旋振荡器充分混匀，并避光保存至使用。
2. 将待测化合物及对照品配制成目标终浓度10倍的储备液，因为在步骤6.5中会进行1:10稀释。实验中必须包含一个阴性对照（溶剂对照），以及两个阳性对照：黄体酮（终浓度10 µM）和离子霉素（终浓度2 µM）。
3. 将240 µL已获能的精子细胞（按步骤2制备）分装至塑料离心管中。
4. 向每根试管中加入30 µL染色液。染料的终浓度为：PI 0.5 µg/mL，FITC-PSA 5 µg/mL，Hoechst-33342 10 µg/mL。
5. 向每根试管中加入30 µL含对照品或化合物的溶液（1:10稀释）。
6. 通过反复吹打或轻微涡旋轻柔混匀样品。由于机械应力可能影响结果，请避免过度混匀。
7. 在37 °C下孵育30分钟。
8. 准备新的塑料离心管，每管加入100 µL固定液（含0.6 M NaHCO₃和0.37%（v/v）甲醛的蒸馏水溶液），每支测试管对应一管。
9. 孵育结束后，通过吹打充分混匀样品，然后取50 µL测试样品加入含100 µL固定液的试管中。
10. 在加载A2载玻片的样品室前，先通过吹打充分混匀样品。小心加入约30 µL样品，避免产生气泡。
    注意： 孵育过程中，活动精子容易发生聚集。细胞团块可能干扰检测结果（即使被排除分析）。因此，孵育后充分吹打混匀至关重要。同样，样品室中的气泡也会影响检测结果。因此，加样时应缓慢操作，当液体边缘即将交汇形成气泡时，应调整移液器角度以避免气泡产生。
11. 将加样完成的载玻片放入图像细胞仪的载物盘中，并关闭载物盘。
12. 选择FlexiCyte程序并点击运行。
    1. 设置FlexiCyte程序参数如下：分析通道数：2；分割图像所用通道：UV（LED365）；通道1：蓝色（LED475），曝光时间3,000 ms，发射滤光片560/35；通道2：绿色（LED530），曝光时间500 ms，发射滤光片675/75；最低分析细胞数：5000；排除聚集细胞：是。
13. 重复步骤6.9–6.12，直至所有样品检测完毕。

7. 图像流式细胞术数据分析

1. 打开步骤6中获得的数据。
2. 创建以下两个图以评估测量结果。
   1. 在双指数尺度上创建Hoechst-33342强度与Hoechst-33342面积的散点图。该图可用于排除那些过小或过大、不符合人类精子细胞特征的Hoechst-33342阳性物体。
   2. 在双指数尺度上创建FITC-PSA强度与PI强度的散点图。该图可通过四象限门控法评估发生顶体反应的精子细胞比例，从而将图中的细胞分为四组（图3）：1）PI阳性且FITC-PSA阳性组：顶体反应且非活精子细胞；2）PI阴性且FITC-PSA阳性组：顶体反应且活精子细胞；3）PI阳性且FITC-PSA阴性组：顶体完整且非活精子细胞；4）PI阴性且FITC-PSA阴性组：顶体完整且活精子细胞。

结果

测试4种化合物（A、B、C和D）对[Ca²⁺]_i 使用中等通量钙检测法在人类精子中²⁺信号检测实验可见于 图4a在 图4b，显示了由峰值 ΔF/F 得出的黄体酮剂量反应曲线₀ (%) 数据由黄体酮系列稀释浓度在另一项中通量钙检测实验中测得²⁺-信号检测实验。对Ca信号检测实验数据的分析²⁺信号检测实验的说明见步骤5。在中等通量顶体反应检测实验中，使用阴性对照（DMSO）和两种阳性对照（孕酮和离子霉素）处理已获能的人类精子细胞，以检测顶体反应的诱导情况，其代表性结果如上图所示 图3来自三种测试条件的象限门控散点图如图所示。顶体反应数据的分析方法详见步骤7。

讨论

中通量 Ca²⁺ 信号检测基于对单个微孔的荧光测量，每个微孔含有约 250,000 个精子细胞。所捕获的信号来自孔内所有单个精子细胞的平均值。因此，该检测无法提供关于精子细胞内 [Ca²⁺]_i 变化具体发生位置、发生 [Ca²⁺]_i 变化的精子细胞比例，以及单个细胞间反应异质性的空间信息。要获得此类信息，必须采用单细胞分辨率的实验方法（例如，如文献^50,52所述）。该技术的另一局限性在于时间分辨率，其量级为秒级。尽管在加入 25 µL 溶液时 50 µL 的精子样品已充分混匀，但测量只能在微孔板所在的抽屉重新放回荧光酶标仪后才可开始。若需更高的时间分辨率，则必须采用其他技术（例如停流式荧光测定法^13,50）。与单细胞或单孔方法相比，中通量 Ca²⁺ 信号检测的优势在于，利用微...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.2 µm 孔径滤膜	Thermo Fisher Scientific, USA	296-4545
1 L 量筒	Thermo Fisher Scientific, USA	3662-1000
1、4 和 2 mL 塑料管	Eppendorf, Germany	30120086 和 0030120094
12 道移液器	Eppendorf, Germany	4861000813
384 孔多孔板	Greiner Bio-One, Germany	781096
15 和 50 mL 塑料管	Eppendorf, Germany	0030122151 和 30122178
A2 载玻片	ChemoMetec, Denmark	942-0001
自动重复移液器	Eppendorf, Germany	4987000010
CaCl2
离心机
用于精液样本的洁净广口塑料容器
二甲基亚砜（DMSO）
异硫氰酸荧光素标记的豌豆凝集素（FITC-PSA）	Sigma-Aldrich, Germany	L0770
Fluo-4 AM	Thermo Fisher Scientific, USA	F14201
FLUOstar OMEGA 荧光酶标仪	BMG Labtech, Germany
无水葡萄糖
HEPES
Hoechst-33342	ChemoMetec, Denmark	910-3015
人血清白蛋白（HSA）	Irvine Scientific	9988	用于添加至 HTF+ 中
固定液，含 0.6 M NaHCO3 和 0.37%（v/v）甲醛的蒸馏水溶液
培养箱
KCl
KH2PO4
磁力搅拌器
MgSO4
乳酸钠
NaCl
NaHCO3
NC-3000 图像细胞仪	ChemoMetec, Denmark	970-3003
移液器及吸头
碘化丙啶（PI）	ChemoMetec, Denmark	910-3002
纯化水
用于放置 50 mL 塑料管并呈 45° 角的支架
S100 缓冲液	ChemoMetec, Denmark	910-0101
SP1-卡盒	ChemoMetec, Denmark	941-0006
适当规格的容量瓶
涡旋振荡器