利用细胞遗传学技术测定烟粉虱 Bemisia tabaci 的卵受精率

摘要

我们介绍一种使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的简单细胞遗传学技术，用于测定单双倍体入侵性害虫Bemisia tabaci的受精率和初级性比。

摘要

少数几种吸食植物汁液的粉虱是全球最具破坏性的陆生害虫之一，因其对农作物造成严重损害并传播植物病毒。尽管已有大量研究探讨了这些粉虱在不同环境中的生物学特性，但一个关键的生活史参数——子代性别比例——却鲜有关注，而该参数对于预测种群动态具有重要意义。Bemisia tabaci 的初级性别比例（产卵时的性别比例）迄今尚未见报道，但可通过测定这种单倍二倍体昆虫的卵受精率来确定。该技术包括使用次氯酸钠溶液去除卵的 chorion（去壳），一系列固定步骤，以及应用通用DNA荧光染料 DAPI（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚，一种DNA结合型荧光染料）对雌性和雄性原核进行染色。本文介绍了该技术及其应用实例，用于检验一种胞内共生细菌Rickettsia sp. nr.bellii是否影响了B. tabaci的初级性别比例。该方法可有助于粉虱种群研究，或用于判断特定环境刺激下是否存在性别分配现象。

引言

性别分配研究，即对雄性和雌性后代相对投资的研究，是行为生态学的基石^1,2,3除了在检验行为适应性模型方面具有重要意义外，了解生物体的性别分配策略还可能改进其种群动态模型。在许多物种中，性别分配由母体控制。要确定性别分配，关键在于明确初级性比，即卵产出时雌性个体所占的比例。尽管成虫羽化时的性比可为性别分配提供线索，但幼体阶段雌雄个体间不同的发育死亡率通常会显著扭曲成虫性比。在膜翅目（Hymenoptera）昆虫（包括蚂蚁、蜜蜂和黄蜂）的一些物种中，研究人员已通过细胞遗传学检测方法确定了初级性比，即对胚胎进行染色以观察其遗传DNA。由于膜翅目昆虫为单双倍体系统，即将发育为雄性的卵为单倍体（n），仅包含雌性原核；而将发育为雌性的卵为双倍体（2n），同时包含雄性和雌性原核。尽管粉虱科（Aleyrodidae）——一类以植物汁液为食的半翅目（Hemiptera）昆虫，通称粉虱——也具有单双倍体系统，但目前尚未建立可用于测定这类昆虫初级性比的可靠检测方法。考虑到该科中少数全球性重要害虫受到的广泛关注，以及性比在粉虱种间竞争相互作用中的重要性，这一现状或许令人意外。^{4,5,6,7,8,9,10} 以及在种群动态研究中普遍存在。在单双倍体昆虫中，性比不受性别决定系统的限制，因此可能存在选择性受精以及随环境变化的可变性比。². 本文介绍一种用于确定统称为烟粉虱的粉虱复合种初级性比的技术， B. tabaci 这一物种名称涵盖了全球超过28个物种¹¹并包含一些对全球危害最严重的入侵性害虫^12,13该技术在确定性别分配模式中的应用 B. tabaci 以及其他粉虱科昆虫将有助于更严格地研究各种可能影响粉虱初级性比和种群动态的变量，包括温度、寄主植物、内共生细菌或植物/粉虱病原体。

我们不了解有任何可与之相比的卵染色技术 B. tabaci与用于其他昆虫卵的染色方法相比，该方案更为便捷¹⁴ 因为它省略了过夜固定步骤，因此可在3小时内完成。作为一个应用示例，一种内共生细菌， 立克次体 近似种 贝利埃利希体， 与我们实验室品系中的雌性偏向相关 B. tabaci 中东-小亚细亚1型（MEAM1）^15,16。在一个 B. tabaci MEAM1 实验室品系（"MAC1," 来自马里科帕农业中心），我们测试了是否 立克次体-感染的（R⁺) 雌性受精的卵子数量多于未感染的（R^-雌性。

方案

注意：确保所有操作均在通风良好的环境或通风橱中于室温下进行。本方案中所有“滴”均定义为5–20 µL，具体体积取决于操作者的偏好。

1. 初始设置

1. 让雌性粉虱在干净的叶片上产卵。可用于产卵的装置示例包括夹式笼或裁剪后置于培养皿中琼脂上的叶片。在夹式笼或培养皿盖上制作一个可封闭的小孔，以便插入和移除成虫。 或者，将收集到的成虫容器迅速置于冰上，随后将其放置于叶片上。为确保能够观察到精子在卵中转变为雄性原核的过程，产卵与固定卵之间的时间应控制在60分钟以内。
   注意：未从叶片上移除的卵可继续培养至成虫，用于记录成虫的性别比例。
2. 在粉虱产卵前或产卵期间，先用肥皂和水清洗显微镜载玻片，充分干燥后，在一端拉伸覆盖一层石蜡膜，确保石蜡膜表面无破损（图1）。
   注意：石蜡膜具有疏水性和半不透明性，有助于液体形成液滴，并使卵更易于观察。

2. 脱膜处理

1. 使用玻璃巴斯德吸管，向石蜡膜上滴加次氯酸钠溶液（0.83% 次氯酸钠）。
   注意： 每滴中仅保留 2–3 个卵，有助于更清晰地追踪卵的状况。若需处理大量卵，可将卵收集于 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）的液滴中。
   警告： 次氯酸钠具有腐蚀性，操作时应佩戴手套，避免吸入。
2. 从叶片上移除成虫粉虱。
3. 将叶片置于显微镜下，以便清晰观察卵，并使用细探针小心地逐个收集卵。制作探针时，将微细针（minuten nadel ）以 45° 或便于操作的角度插入熔化的吸头中（图 2）。
4. 将卵转移至次氯酸钠溶液或 1× PBS 中。若使用 1× PBS，在所有卵收集完毕后，先用玻璃巴斯德吸管吸除 PBS，再向卵中加入次氯酸钠溶液。
   注意： 收集卵时，应缓慢从基部提起卵，直至卵柄从叶片脱离。卵柄具有黏性，卵通常会黏附在探针尖端，直至将其浸入次氯酸钠溶液中才会脱落。
   注意： 建议为每种试剂使用单独的玻璃巴斯德吸管，可通过加热改造吸管使尖端更细，以降低意外吸入粉虱卵的风险。为防止残留和污染，每次使用后需用去离子水清洗吸管。
5. 静置 10 分钟。若需研究超过 1 小时的卵的胚胎发育过程，可将卵在次氯酸钠溶液中保留长达 15 分钟。
   注意： 对于不超过 1 小时的卵，10 分钟处理已足够。

3. 固定

注意：这些步骤源自一种膜翅目昆虫的实验方案¹⁷。

1. 用玻璃巴斯德吸管移除含有卵壳碎片的漂白液，并弃去。用玻璃巴斯德吸管加入数滴冰醋酸，静置 3 分钟。
   注意：此步骤应在通风橱中进行。冰醋酸具有腐蚀性，操作时应佩戴手套，避免吸入，尤其需避免与残留的漂白液共同挥发产生的气体接触。
2. 用玻璃巴斯德吸管移除冰醋酸，再用玻璃巴斯德吸管加入数滴克拉克溶液（无水乙醇:冰醋酸 = 3:1）。静置直至大部分溶液挥发（或最长 10 分钟）。
3. 用玻璃巴斯德吸管向卵中加入数滴 70% 乙醇，静置直至大部分乙醇挥发（或最长 10 分钟）。

4. 染色

1. 用玻璃巴斯德移液管吸除残留的乙醇，并用玻璃巴斯德移液管向卵中滴加数滴 1× PBS，使 pH 接近 7.0。将显微镜载玻片置于湿度培养盒中以防止干燥，例如放入内有湿润纸巾的空移液器吸头盒中（图3）。静置至少30分钟。
   注意：若需暂停操作，此时为最佳节点，前提是湿度培养盒能有效防止样品干燥。
2. 用玻璃巴斯德移液管吸除 1× PBS，并用玻璃巴斯德移液管滴加 0.1 μg/mL DAPI（一种DNA荧光染料）。将载玻片置于避光的湿度培养盒中，静置至少15分钟。
   注意：DAPI 具有刺激性，操作时需佩戴手套。

5. 清洗

1. 用玻璃巴斯德吸管移除DAPI。
2. 用玻璃巴斯德吸管向卵中加入数滴1× TBST（由30 g Tris、43.8 g NaCl、5 mL 吐温-20、1.0 g NaN₃ [pH 7.5] 配制成5×溶液，再用PCR级水稀释至1 L）孵育。孵育5分钟后，用玻璃巴斯德吸管吸出1× TBST。重复此步骤2次。

6. 封片

1. 最后一次洗涤后，小心地将石蜡膜上的所有卵用移液器转移至显微镜载玻片的洁净区域。去除多余的1×TBST，然后加入20 µL封片剂（80%甘油、20% 1×TBST，含2%正丙基-没食子酸），并在卵上轻轻加盖一片洁净的盖玻片。
2. 如需长期保存，用透明指甲油密封盖玻片，随后将载玻片置于2 °C避光保存，或立即在荧光显微镜下观察。

结果

为了检验是否 立克次体 影响受精率 B. tabaci MEAM1 雌性，我们进行了培育 立克次体-感染（R⁺）或未感染（R^-) B. tabaci 在豇豆植株上（Vigna unguiculata) 分别置于27 °C、70%相对湿度、16小时光照/8小时黑暗光周期条件下的独立笼具中饲养。R⁺ 和 R^- 四龄若虫粉虱被小心地从叶片上移除，并分离至200 µL条状管中。成虫羽化后，按50%雌性比例分组收集，转移至培养皿中的洁净叶片上n = 每片叶约50–100只）进行4天交配。随后将约20只雌虫和若干雄虫转移至一片洁净的叶盘（每份R一个）^- 成人，用于R的一个⁺ 将成虫置于直径35 mm、底部铺有1%琼脂的培养皿中。培养皿的盖子已被切除，使用细密织物网进行封闭，既可防止成虫逃逸，又能减少冷凝水积聚。约45分钟后，移除所有成虫，收集部分卵...

讨论

本方案首次实现了对烟粉虱（B. tabaci）受精率或初级性别比例的检测。该方案的难点在于要求研究人员掌握快速处理粉虱卵的技术，确保从产卵到固定的时间不超过1小时。在预实验中发现，产卵后3小时或更久才固定的卵已过于成熟，无法观察受精情况，因为此时合子融合已完成，有丝分裂已经开始。在产卵后1至3小时之间，原核逐渐呈现更圆的形态。虽然早期出现两个核提示卵子已受精，但稍后两个原核在准备融合时可能紧贴在一起而看似单个核；更晚些时候，第一次有丝分裂的两个子核则在雄性和雌性卵中均可见到。因此，在这些较晚的时间点上，两性之间的区别不再明确，我们建议将产卵至固定的间隔严格控制在1小时内，以作为保守措施。此外，在每次液体转移过程中需学会轻柔操作卵，避免卵被意外吸入移液器中。在荧光显微镜下观察时，部分卵可能在操作过程中破裂，导致原核和卵黄外泄，此类卵无法进行性别鉴定和计数。然而，一旦操作者熟练掌握上述步骤，整个方案可在3小时内便捷完成，且无需过夜固定步骤。本方案还具有灵活性，可根据需要进行调整，用于染色较老的卵，适用于希望观察发育过程的研究人员。

该实验方案的一个应用是性别分配研究。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1x PBS	任意
1x TBST	任意		5x 溶液由 30 g Tris、43.8 g NaCl、5 mL Tween-20 和 1.0 g NaN3 溶于 PCR 级水定容至 1 L，pH 7.5
漂白剂	Clorox		任何家用漂白剂均可使用，只要可稀释至含 0.83% 次氯酸钠
透明指甲油	任意
DAPI 二乳酸盐	Santa Cruz Biotechnology	sc300415
乙醇	任意		稀释至 70% EtOH
荧光显微镜	Nikon		本实验使用 Nikon Eclipse 50i，但任何配备 340/380 nm 激发滤光片且放大倍数至少为 4–10 倍的荧光显微镜均可使用
冰醋酸	Mallinckrodt	UN2789
甘油	任意
显微镜	Wild		本实验使用 Wild M5A 显微镜，但任何能使操作者清晰观察到粉虱卵的显微镜均可使用
显微镜载玻片盖片	任意		本方法适用于 18 mm × 18 mm 的盖片。若使用更大的盖片，则需增加封片介质用量。
显微镜载玻片	任意
微型针（Minuten nadel pins）	BioQuip	1208SA	微型针可选，可用于与移液器吸头配合制成探针
NaCl	任意
NaN3	任意
正丙基没食子酸酯（n-propyl-gallate）	Sigma/Santa Cruz Biotechnology	P3130/sc-250794
Parafilm 封口膜	Bemis
巴斯德吸管	Fisher Scientific	13-678-20A	Fisherbrand 一次性硼硅酸盐玻璃巴斯德吸管，长 5.75 英寸。若操作者需延长并缩小吸管口径，可能还需使用本生灯
PCR 级水	任意
移液器吸头	任意		移液器吸头可选，可用于与微型针配合制成探针
小型滴管胶头	任意		必须能与巴斯德吸管匹配
Tris	任意
Tween-20	任意