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方法文章

用于可重复图案形成的混合凝胶立方体装置中初始三维细胞簇的控制

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DOI：

10.3791/59214

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2019年3月21日

 ,  , 
1NanoSquare Research Institute, Osaka Prefecture University, 2Department of Bioscience and Informatics, Osaka Prefecture University, 3Department of Biological Functions Engineering, Kyushu Institute of Technology

本文内容

摘要

我们介绍一种在三维细胞外基质中控制初始细胞簇形状的方法，以获得可重复的模式形成。采用包含两种不同水凝胶的立方体装置，实现组织模式形成的多方向成像。

摘要

体外三维培养在细胞/组织培养中具有重要意义，但其实验重复性差是主要限制因素之一。图案形成的可重复结果较少，影响了对自组织机制的分析。减少初始培养条件（如细胞密度和细胞在细胞外基质（ECM）中的分布）的差异，对于提高三维培养的重复性至关重要。本文展示了一种简单而稳健的方法，用于控制三维细胞外基质中初始细胞簇的形状，以获得高度可重复的图案形成。通过光刻或机械加工工艺制备具有目标形状的微模具，并在包含于杂化凝胶立方体（HGC）中的ECM内形成三维孔腔。随后将高浓度细胞注入该孔腔，使细胞簇的形状与所制备的模具形状一致。所采用的HGC可通过旋转实现多方向扫描，即使使用低倍物镜，也能实现高分辨率成像并完整捕获整个组织结构。本研究以正常人支气管上皮细胞为例，验证了该方法的可行性。 

引言

相较于二维培养，三维培养能更真实地模拟生物环境，因此在细胞/组织培养中备受重视1,2,3。细胞与细胞外基质（ECM）之间的相互作用为形态发生提供了重要的信号提示4,5。许多组织结构的形成仅在三维环境中才能出现，例如折叠过程6,7、内陷8以及管状结构形成9,10。然而，诸多困难阻碍了研究人员从培养皿上的二维实验转向三维实验。其中，三维实验面临的主要难题之一是三维样本的成像问题。与平面实验相比，在许多情况下获取高质量的三维图像仍然具有挑战性。特别是当样本尺寸达到毫米量级时，由于低倍物镜的焦深较大，获得合适三维图像尤为困难。例如，使用10倍物镜时焦深可超过50 µm，而单个细胞的尺寸通常小于10 µm。为提高成像质量，高技术显微系统正在不断开发（如双光子显微镜11和光片显微镜系统12），但因其价格昂贵，应用受到限制。作为替代方案，我们此前开发了一种杂化凝胶立方体（HGC）装置13。该装置由两种水凝胶组成：琼脂糖作为支撑凝胶，ECM（如胶原蛋白或Matrigel）作为培养凝胶。HGC可在培养过程中收集样本，并通过旋转立方体实现多方向成像，从而解决焦深问题14。

3D 实验的另一个难点在于其重复性较低，这是由于 3D 环境的可控性较差所致。与塑料培养皿上的平面培养不同，在由软性材料包围的 3D 空间中，初始培养条件容易出现差异。实验结果的显著变异会降低后续分析的可靠性，并掩盖潜在的作用机制。目前已开发出多种工程技术用于实现单细胞的空间排列，例如生物打印15,16、纤维编织17和支架构建18，但这些方法通常需要复杂的预处理步骤或专门设计的设备。相比之下，我们开发了一种在 HGC19中实现 3D 细胞排列的方法。

在本实验方案中，我们介绍了一种利用常规设备在HGC中控制三维初始细胞聚集体形状的简单方法。首先，展示了HGC的制备过程。随后，将通过光刻或机械加工方法制备的微模具置于HGC中，以在细胞外基质（ECM）中形成具有任意形状的腔室。接着，将离心后高密度的细胞注入该腔室，从而在HGC中控制初始细胞聚集体的形状。由于HGC的结构特性，可从多个方向对精确控制的细胞聚集体进行成像。实验中使用正常人支气管上皮（NHBE）细胞，以展示对初始细胞聚集体形状的控制能力，并通过多角度成像提高分支结构的成像质量。

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方案

1. 杂化凝胶立方体装置的制备

  1. 通过机械加工或3D打印制备一个聚碳酸酯（PC）立方框架。PC框架的尺寸取决于样品大小。本研究中使用的框架每边长5 mm，以便在培养过程中为分支提供足够的伸长空间。
  2. 将PC框架放置于冰盒中预冷的载玻片或其他光滑表面上（<0 °C）（图1A）。
  3. 用移液器将12 µL预热的1.5%琼脂糖（w/v）从立方框架的顶面加入到底面。轻划移液器头，使琼脂糖铺展形成平整表面（图1B）。
  4. 数分钟内琼脂糖将凝固。用镊子将框架沿载玻片边缘水平滑动取起。注意：若垂直从载玻片上提起框架，由于琼脂糖与载玻片之间的粘附力，可能导致琼脂糖脱离立方框架（图1C）。
  5. 将立方框架翻转，使开口面向下，再次放置于载玻片上（图1D）。
  6. 重复步骤1.3–1.5，直至三个面均填充琼脂糖（图1E）。
  7. 在第四和第五个面上形成琼脂糖壁时，需从开口面滴加琼脂糖（图1F）。当第五个面形成琼脂糖壁后，HGC的制备即完成。

2. 通过光刻或机械加工工艺制备微模具

  1. 通过光刻进行制备
    1. 将硅（Si）晶圆依次在丙酮、异丙醇（IPA）和去离子水（DI水）中各超声清洗5分钟。用氮气吹干Si晶圆后，在140 °C的烘箱中脱水20分钟（图2A(i)）。
    2. 在黄光环境下，使用旋涂仪将牺牲层材料（如LOR和Az光刻胶）旋涂在Si晶圆上（2,000 rpm，30秒）。旋涂后立即在热板上以90 °C加热3分钟（图2A(ii)）。牺牲层所需厚度应超过1 µm，以便于后续剥离工艺的进行，但无需精确控制厚度。
    3. 将晶圆置于70 °C热板上，然后用手动滚轮将所需厚度的厚型负性光刻胶薄膜贴合到牺牲层上（图2A(iii)）。
    4. 贴膜5分钟后，将晶圆置于掩模对准仪上进行紫外光曝光。将带有目标图案的掩模放置在光刻胶膜上，并用紫外光照射适当时间。曝光时间由光刻胶厚度和紫外光强度决定。随后将晶圆置于热板上，在60 °C下进行曝光后烘烤5分钟，再在90 °C下烘烤10分钟（图2A(iv)）。
    5. 将晶圆浸入丙二醇单甲醚醋酸酯（PGMEA）中显影负性光刻胶，直至未曝光区域完全溶解（约20分钟）（图2A(v)）。
    6. 使用IPA进行超声清洗以溶解牺牲层，实现微结构的剥离。一旦微结构从晶圆上剥离，再用去离子水超声清洗10分钟（图2A(vi)）。
    7. 将模具浸入30 µL MPC聚合物中，在室温（约20 °C）下放置30分钟，使其完全干燥。图2B展示了所制备的棱镜模具。
  2. 圆柱形模具的制备
    1. 通过机械加工工艺制备所需尺寸的钢制圆柱模具，或使用市售的不锈钢材料（本研究中使用φ 600 µm的圆柱）。
    2. 将钢制圆柱浸入30 µL MPC聚合物中，在室温（约20 °C）下放置30分钟，使其完全干燥。
    3. 将聚二甲基硅氧烷（PDMS）的基础树脂与其催化剂按10:1的比例混合（参见材料表），并在真空脱气系统中脱气20分钟，制得液态PDMS。然后将PDMS倒入12孔板中。
    4. 将钢制圆柱垂直于基准面放置，并固定在直线z轴平台上，通过移动z轴平台，可将圆柱垂直插入放置在同一基准面上的12孔板中的未固化PDMS表面。将带有钢制圆柱的PDMS置于90 °C烘箱中固化20分钟。切割PDMS以形成侧壁表面，以便在后续步骤中插入移液管（图2C）。

3. 控制水凝胶中初始细胞簇的形状

  1. 向HGC中注入适合目标细胞培养的适当细胞外基质（ECM），例如胶原蛋白和人工基底膜，以填满培养空间（图3A）。
  2. 如图3B所示，将制备好的微模具直接或通过合适的支架间接放置在HGC上。随后将HGC置于37 °C的CO2培养箱中孵育25分钟，使其固化。
  3. 小心取出微模具，避免ECM受损（图3C）。ECM中将形成与所需模具形状一致的凹腔。
  4. 根据细胞类型，使用胰蛋白酶–EDTA或其替代试剂从培养皿中收集细胞。随后离心细胞以获得高浓度细胞悬液（对于NHBE细胞培养，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA处理3分钟，然后用含FBS的培养基中和，并在300 × g条件下离心4分钟）。
  5. 离心后，弃去上清液以浓缩细胞，并将高浓度细胞（NHBE细胞为3.0 × 104 个细胞/µL）注入ECM中的凹腔内（图3D）。
  6. 将含有细胞的HGC置于37 °C的CO2培养箱中孵育20分钟，使细胞沉降至ECM凹腔中，填充微模具所形成的空隙。若顶部表面存在过多培养基或细胞，需小心使用移液器去除。
  7. 将HGC置于24孔板中，并加入100 µL适当培养基（图3E）。对于NHBE细胞，使用市售专用NHBE培养基与内皮细胞培养基按1:1比例混合的培养液（参见材料表）。
  8. 注入额外的ECM以封闭ECM中的凹腔，随后在37 °C孵育25分钟。
  9. 将预热的1.5%琼脂糖冷却至室温（约20 °C），取约10 µL滴加至HGC顶部表面，以封闭表面并防止培养和成像过程中ECM从HGC中脱落（图3F）。然后将HGC再于37 °C孵育20分钟，使琼脂糖固化。
  10. 加入培养基以完全覆盖HGC，使渗透压有助于为HGC内部的细胞提供营养。

4. 多方向成像

  1. 通过多方向观察实现非侵入性三维形态识别
    1. 将含有 HGC 的培养皿或孔板置于显微镜下，调整 HGC 位置使其面向相机视野，然后通过明场或相差模式获取样本图像。
    2. 拿起并旋转 HGC，使另一表面朝下放置。
    3. 重复步骤 4.1.1 和 4.1.2，直至获得六个侧面的全部图像。
  2. 通过多方向观察进行免疫荧光成像
    1. 固定时，在室温（约 20 °C）下将 4% 多聚甲醛作用于 HGC 上的样本 20 分钟，随后用 PBS 洗涤两次，每次 10 分钟。
    2. 在 4 °C 下，使用含 0.5% Triton X-100 的 PBS 对 HGC 进行 10 分钟透化处理，然后用 PBS 洗涤 3 次，每次 10 分钟。
    3. 将 HGC 在 IF 缓冲液（含 0.2% Triton X-100、0.1% 牛血清白蛋白和 0.05% Tween-20 的 PBS）中与 10% 山羊血清于室温孵育 60 分钟，进行一抗封闭。
    4. 针对特定分子染色时，使用相应的抗体；为观察细胞整体几何结构，可使用 Alexa Fluor 488 Phalloidin 对肌动蛋白进行染色。
    5. 将 HGC 置于玻璃底培养皿中，在激光共聚焦或荧光显微镜下从六个侧面进行扫描，以获取完整的样本图像。

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结果

采用正常人支气管上皮（NHBE）细胞来演示本研究所示的方法，并在细胞外基质（ECM）环境中分别控制初始群体细胞的几何形态，以形成圆柱形和棱柱形。通过相差显微成像以及对圆柱形（图4A、B）和棱柱形（图4C、D）进行鬼笔环肽染色所获得的多向成像结果已展示。细胞在ECM环境中被适当地排列，以形成所需的三维形态。随后，细胞培养四天以形成特定形状，并通过多向成像进行分析。由于样本尺寸较大，从单一方向获取整个组织的完整图像非常困难；然而，HGC技术可实现最多六个侧面的成像，从而揭示出组织的整体形态。图5展示了由NHBE细胞发育形成的支气管树的免疫荧光染色结果。NHBE细胞最初在HGC中被控制为圆柱形，随后大多数分支沿垂直于圆柱轴的方向延伸。

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讨论

本文介绍的方法简单，无需使用高精尖设备即可完成。同时，可在水凝胶的三维空间中实现精确的细胞簇形态控制。初始控制完成后，细胞在水凝胶培养装置（HGC）中的生长情况可达到与培养皿中相当的水平。通过使用任意显微镜系统旋转带有HGC的样品，可实现多方向成像，显著提升成像质量。只要材料具有生物相容性，HGC框架和微模具的材料选择具有较大灵活性。若3D打印机的精度满足应用需求，亦可使用3D打印机制造HGC框架或微模具。该方法可与多种图像增强技术兼容，例如透明试剂20,21和光片显微镜系统。结合这些技术，可进一步提高图像质量。

琼脂糖、细胞外基质（ECM）和高密度细胞的注射体积取决于HGC和模具尺寸。操作时需仔细手动注射，避免引入气泡，否则产生的气泡将影响控制的准确性、细胞生长以及成像质量。

微模具的制备工艺取决于所需控制的形状。光刻技术能够制备具有特定深度的精确二维形状，例如微米级的棱柱形结构；然而，该方法在制备三维形状（...

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披露

作者及大阪府立大学、九州工业大学已就一种杂化凝胶立方体装置申请了专利，日本日医学工株式会社近期已将该立方体实现商业化。该公司未对本文所述的任何设计、工艺和方法产生影响。

致谢

本工作由日本JSPS科研费（18H04765）和日本文部科学省终身教职制度推广项目资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
12孔板Corning  Inc.3513
2-甲氧基-1-甲基乙基醋酸酯FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.130-10505PGMEA，CAS：108-65-6 
4% 多聚甲醛FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.161-20141CAS：30525-89-4
低凝胶温度琼脂糖，生物试剂 Sigma-AldrichA9414
Alexa Fluor 488 鬼笔环肽Thermo Fisher ScientificA12379
AZ1512Merck
BEGM 完全培养基套装LonzaCC-3170NHBE 细胞专用培养基
牛血清白蛋白溶液（10%）Sigma-AldrichA1595
EGM-2 完全培养基套装LonzaCC-3162内皮细胞专用培养基
LipidureNOF co.MPC 聚合物
生长因子减少型 Matrigel 基底膜基质Corning  Inc.354230
正常山羊血清（10%）Thermo Fisher Scientific50197Z
正常人支气管上皮细胞LonzaCC-2541
SILPOT 184 W/CDow Corning Co.3255981PDMS 的基础树脂与催化剂
SUEX D300DJ MicroLaminates, Inc厚型负性光刻胶（厚度：300 mm）
吐温 X-100（1%）Thermo Fisher ScientificHFH10
胰蛋白酶-EDTA（0.25%）Thermo Fisher Scientific25200056
吐温 20Sigma-AldrichP9416

参考文献

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