我们介绍了利用HeLa细胞研究哺乳动物细胞周期中双链RNA结合蛋白激酶RNA激活型（PKR）的RNA相互作用分子的实验方法。该方法利用甲醛交联RNA-PKR复合物，并通过免疫沉淀富集与PKR结合的RNA。这些RNA可进一步通过高通量测序或定量逆转录PCR（qRT-PCR）进行分析。
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摘要
摘要
蛋白激酶RNA激活蛋白（PKR）是先天免疫反应蛋白家族的成员，能够识别病毒RNA的双链二级结构。当与病毒双链RNA（dsRNA）结合后，PKR会发生二聚化并随之发生自磷酸化。磷酸化的PKR（pPKR）被激活，进而诱导真核翻译起始因子2α亚基（eIF2α）的磷酸化，从而抑制全局翻译。越来越多的证据表明，PKR可在无感染的情况下被激活，例如在细胞周期过程中或多种应激条件下。然而，由于缺乏标准化的实验方法来捕获和分析与PKR相互作用的dsRNA，我们对PKR的RNA激活物仍知之甚少。本文中，我们提供了一种利用HeLa细胞特异性富集和分析细胞周期中PKR结合RNA的实验方案。我们利用甲醛高效的交联活性固定PKR-RNA复合物，并通过免疫沉淀法将其分离。随后可对PKR共免疫沉淀的RNA进行进一步处理，构建高通量测序文库。与PKR相互作用的一类主要细胞内dsRNA是线粒体RNA（mtRNA），其可通过重链RNA与轻链RNA之间的互补配对形成分子间dsRNA。为了研究这些双链mtRNA的链特异性，我们还提供了一种链特异性qRT-PCR的实验方案。本方案针对PKR结合RNA的分析进行了优化，但也可轻松修改用于研究其他细胞内dsRNA或其它dsRNA结合蛋白的RNA互作分子。
引言
蛋白激酶RNA激活型（PKR），也称为真核起始因子2-α激酶2（EIF2AK2），是一种特征明确的蛋白激酶，可传递RNA提供的信息。它属于真核翻译起始因子2α亚基（eIF2α）激酶家族，在感染发生时通过磷酸化eIF2α的丝氨酸51位点来抑制全局翻译1。在此过程中，PKR被病毒来源的双链RNA（dsRNA）激活，dsRNA为PKR的二聚化和自磷酸化提供了平台2。除了eIF2α外，PKR还可磷酸化p53、胰岛素受体底物1、抑制因子κB以及c-Jun氨基末端激酶（JNK），从而调控多种信号转导通路的活性3,4,5,6。
PKR最初被发现是一种激酶，在脊髓灰质炎病毒感染过程中通过识别病毒的双链RNA（dsRNA）使eIF2α发生磷酸化7,8。越来越多的研究发现，PKR在免疫反应之外也具有多种功能，其异常激活或功能障碍与多种人类疾病相关。活化/磷酸化的PKR（pPKR）在细胞凋亡过程中经常被观察到，也是退行性疾病患者（尤其....
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方案
1. 溶液和细胞的制备
- 溶液配制
- 对于细胞培养基，通过向500 mL的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中加入50 mL胎牛血清（FBS）来配制HeLa细胞培养用培养基。
注意：可向细胞培养基中添加抗生素，但我们不使用抗生素。 - 对于0.1%的多聚甲醛，将4%（w/v）多聚甲醛在热板上加热溶解于1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，并用1×PBS稀释以配制30 mL的0.1%（v/v）多聚甲醛溶液。
注意：所有操作均需在通风橱中进行，注意避免煮沸多聚甲醛溶液。0.1%溶液需避光保存，并于4 °C储存。溶液应在一个月内使用完毕。
注意：最终的0.1%（v/v）多聚甲醛溶液pH值应约为7。 - 配制fCLIP裂解缓冲液：20 mM Tris-HCl（pH 7.5）、15 mM NaCl、10 mM EDTA、0.5%（v/v）Nonidet-P40（NP-40）、0.1%（v/v）Triton X-100、0.1%（v/v）十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1%（w/v）脱氧胆酸钠。加入三蒸水（TDW）至40 mL。4 °C保存。
- 配制fCLIP洗涤缓冲液：20 mM Tris-HCl（pH 7.5）、150 mM NaCl、10 mM EDTA、0.1%（v/v）NP-40、0.1%（v/v）Triton X-100、0.1%（v/v）SDS和0.1%（w/v）脱氧胆酸钠。加入TDW至40 ....
- 对于细胞培养基，通过向500 mL的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中加入50 mL胎牛血清（FBS）来配制HeLa细胞培养用培养基。
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结果
在图1中展示了将HeLa细胞阻滞在细胞周期S期或M期的流程示意图。对于处于M期阻滞的样本，我们可在显微镜下清晰观察到呈圆形的细胞（图2A）。为了检测细胞周期阻滞的效率，可通过FACS分析细胞的核内DNA含量（图2B）。图3展示了免疫沉淀效率检测的代表性数据，其中D7F7抗体在免疫沉淀PKR方面表现出更优的能力。这种免疫沉淀效率的差异可能反映在使用两种不同PKR抗体构建的高通量测序文库在类别分布上的差异（图4）。D7F7抗体的特异性进一步通过PKR免疫沉淀物的全膜Western印迹分析（图5A）以及全细胞裂解液的分析（图5B）得到验证。图6显示了在高通量测序文库构建过程中去除rRNA前后放射性同位素信号的变化。图7显示了与PKR共免疫沉淀的RNA中mtRNA的富集情况，而在.......
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讨论
制备S期或M期阻滞样品的流程如图1所示。为将细胞阻滞在S期，我们采用胸腺嘧啶双阻滞法，即对细胞进行两次胸腺嘧啶处理，中间间隔9小时的释放期，以确保高效的阻滞效果（图1A）。对于M期阻滞，我们先用胸腺嘧啶处理一次细胞，随后释放9小时，再加入诺考达唑（nocodazole）以将细胞阻滞在前中期（图1B）。制备细胞周期样品的一个关键步骤是在第一次胸腺嘧啶阻滞后进行的释放步骤。为彻底去除胸腺嘧啶，必须使用新鲜PBS对细胞至少洗涤两次。洗涤不充分或残留的胸腺嘧啶可能导致细胞异质性增加和细胞活力下降。M期阻滞的成功可通过形态学观察来确认，即圆形细胞数量明显增多（图2A）。然而，根据形态判断，M期样品中仍含有大量间期细胞。为了仅收集M期阻滞的细胞，我们施加物理力使M期细胞从培养表面脱落。收获细胞的核含量进一步通过流式细胞术（FACS）检测，结果显示S期样品在2n至4n之间出现一个宽峰，而M期阻滞样品在4n处呈现一个.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由韩国国家研究基金会（NRF）通过韩国科技信息通信部资助的基础科学研究中心项目（NRF-2016R1C1B2009886）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5 M EDTA，pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
| 1 M Tris，pH 7.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| 1 M Tris，pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| 1.7 mL 微型离心管 | Axygen | MCT-175-C | |
| 10% Nonidet-p40 (NP-40) | Biosolution | BN015 | |
| 10X DNA 上样缓冲液 | TaKaRa | 9157 | |
| 15 mL 锥形管 | SPL | 50015 | |
| 3' 接头 | 5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3' | ||
| 3 M 醋酸钠，pH 5.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9740 | |
| 5' 接头 | 5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3' | ||
| 5 M NaCl | Thermo Fisher Scientific | AM9760G | |
| 50 mL 锥形管 | SPL | 50050 | |
| 酸性酚-氯仿，pH 4.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9722 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | 磁珠用于 DNA/RNA 纯化 |
| 南极碱性磷酸酶 | New England Biolabs | M0289S | |
| 抗-DGCR8 抗体 | 实验室自制 | ||
| 抗-PKR 抗体 (D7F7) | Cell Signaling Technology | 12297S | |
| 抗-PKR 抗体 (Milli) | Millipore EMD | 07-151 | |
| ATP (100 mM) | GE Healthcare | GE27-2056-01 | |
| 溴酚蓝钠盐 | Sigma-aldrich | B5525 | |
| 小牛肠碱性磷酸酶 | TaKaRa | 2250A | |
| 25 cm 两位置细胞刮刀 | Sarstedt | 83.183 | |
| CMV 启动子序列 | 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3' | ||
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | Welgene | LM001-05 | |
| dNTP 混合物 (2.5 mM) | TaKaRa | 4030 | |
| 乙醇，无水，ACS 级 | Alfa-Aesar | A9951 | |
| 胎牛血清 | Merck | M-TMS-013-BKR | |
| 甲酰胺 | Merck | 104008 | |
| 甘氨酸 | Bio-basic | GB0235 | |
| 甘油蓝共沉淀剂 (15 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | AM9516 | |
| 异丙醇 | Merck | 8.18766.1000 | |
| NEBNext rRNA 耗竭试剂盒 | New England Biolabs | E6318 | rRNA 耗竭试剂盒 |
| 诺考达唑 | Sigma-Aldrich | M1404 | |
| 正常兔 IgG | Cell Signaling Technology | 2729S | |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | 6148 | |
| PCR 正向引物 (RP1) | 5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3' | ||
| PCR 索引反向引物 (RPI) | 5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3' | ||
| 带平盖 PCR 管，0.2 mL | Axygen | PCR-02-C | |
| 磷酸盐缓冲液 (PBS) 片剂 | TaKaRa | T9181 | |
| Phusion 高保真 DNA 聚合酶 | New England Biolabs | M0530 | 高保真聚合酶 |
| 带摆动转子的 PlateFuge 微型离心机 | Benchmark | c2000 | |
| 多核苷酸激酶 (PNK) | TaKaRa | 2021A | |
| 蛋白酶 K，重组，PCR 级 | Sigma-Aldrich | 3115879001 | |
| qPCR 引物序列：CO1 重链 | 正向/反向：5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR 引物序列：CO1 轻链 | 正向/反向：5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR 引物序列：CO2 重链 | 正向/反向：5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR 引物序列：CO2 轻链 | 正向/反向：5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR 引物序列：CO3 重链 | 正向/反向：5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR 引物序列：CO3 轻链 | 正向/反向：5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR 引物序列：CYTB 重链 | 正向/反向：5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR 引物序列：CYTB 轻链 | 正向/反向：5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR 引物序列：GAPDH | 正向/反向：5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR 引物序列：ND1 重链 | 正向/反向：5′-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR 引物序列：ND1 轻链 | 正向/反向：5′-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR 引物序列：ND4 重链 | 正向/反向：5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR 引物序列：ND4 轻链 | 正向/反向：5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR 引物序列：ND5 重链 | 正向/反向：5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR 引物序列：ND5 轻链 | 正向/反向：5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR 引物序列：ND6 重链 | 正向/反向：5′-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR 引物序列：ND6 轻链 | 正向/反向：5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| 随机六聚体 | Thermo Fisher Scientific | SO142 | |
| 重组 Dnase I (Rnase-free) (5 U/μL) | TaKaRa | 2270A | |
| 重组 Rnase 抑制剂 (40 U/μL) | TaKaRa | 2313A | |
| Ribo-Zero rRNA 去除试剂盒 | Illumina | MRZH116 | rRNA 去除试剂盒 |
| 旋转混合器 | FINEPCR, ROTATOR AG | D1.5-32 | |
| RT 引物序列：CO1 重链 | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′ | ||
| RT 引物序列：CO1 轻链 | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′ | ||
| RT 引物序列：CO2 重链 | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′ | ||
| RT 引物序列：CO2 轻链 | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′ | ||
| RT 引物序列：CO3 重链 | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′ | ||
| RT 引物序列：CO3 轻链 | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′ | ||
| RT 引物序列：CYTB 重链 | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′ | ||
| RT 引物序列：CYTB 轻链 | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′ | ||
| RT 引物序列：GAPDH | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3′ | ||
| RT 引物序列：ND1 重链 | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′ | ||
| RT 引物序列：ND1 轻链 | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′ | ||
| RT 引物序列：ND4 重链 | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′ | ||
| RT 引物序列：ND4 轻链 | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3′ | ||
| RT 引物序列：ND5 重链 | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3′ | ||
| RT 引物序列：ND5 轻链 | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′ | ||
| RT 引物序列：ND6 重链 | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′ | ||
| RT 引物序列：ND6 轻链 | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3′ | ||
| 硅化聚丙烯 1.5 mL G 型管 | Bio Plas | 4167SLS50 | |
| 十二烷基硫酸钠 | Biosesang | S1010 | |
| 脱氧胆酸钠 | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SUPERase In Rnase 抑制剂 | Thermo Fisher Scientific | AM2694 | |
| SuperScript III 逆转录酶 | Thermo Fisher Scientific | 18080093 | 用于文库构建的逆转录酶 |
| SuperScript IV 逆转录酶 | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | 用于 qRT-PCR 的逆转录酶 |
| SYBR gold 核酸染色剂 | Thermo Fisher Scientific | S11494 | |
| T4 多核苷酸激酶 | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 RNA 连接酶 1 (ssRNA 连接酶) | New England Biolabs | M0204 | |
| T4 RNA 连接酶 2，截短型 KQ | New England Biolabs | M0373 | |
| 恒温混匀仪 | Eppendorf ThermoMixer C 配 ThermoTop | ||
| 胸苷 | Sigma-Aldrich | T9250 | |
| Tris-硼酸-EDTA 缓冲液 (TBE) | TaKara | T9122 | |
| 吐温 X-100 | Promega | H5142 | |
| Ultralink Protein A Sepharose 磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 22810 | Protein A 磁珠 |
| 超声波破碎仪 | Bioruptor | ||
| 尿素 | Bio-basic | UB0148 | |
| 涡旋混合器 | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| 二甲苯青 | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| γ-32P-ATP (10 μCi/μL, 3.3 μM) | PerkinElmer | BLU502A100UC |
参考文献
- Meurs, E. F., et al. Constitutive expression of human double-stranded RNA-activated p68 kinase in murine cells mediates phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2 and partial resistance to encephalomyocarditis virus growth. Journal of Virology. 66 (10), 5805-5814 (1992).
- Patel, R. C., Stanton, P., McMil....
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