哺乳动物细胞周期内蛋白质激酶 rna 激活的 rna 相互作用研究

蛋白激酶 rna 激活 (pkr), 也被称为真核起始因子2α激酶 2 (EIF2AK2), 是一种特征良好的蛋白激酶, 传输 rna 提供的信息。它属于真核翻译起始2亚基α (eif2α) 激酶家族和磷酸酯 eif2α在丝氨酸51响应^感染,以抑制全球翻译1。在此背景下, pkr 被病毒双链 rna (dsrna) 激活, 为 pkr 二聚和自磷酸化²提供了一个平台。除了 eif2α, pkr 还可以磷酸化 p53, 胰岛素受体底物 1, 抑制剂 b, 和 c-jun n-端子激酶 (jnk) 调节活性的许多信号转导^{途径 3,4,5, 6}。

pkr 最初被确定为一种在脊髓灰质炎病毒感染过程中磷酸化 eif2α的激酶, 通过识别脊髓灰质炎病毒的 dsrna 7^,8。pkr 越来越多地被发现在免疫反应之外发挥着多方面的作用, 其异常激活或故障在许多人类疾病中都隐含着。在细胞凋亡过程中经常观察到活着的磷酸化 pPKR (ppkr), 是退行性疾病患者的共同特征, 尤其是亨廷顿病、帕金森症和阿尔茨海默病等神经退行性疾病^{9 10,11,12, 13.}此外, pkr 在代谢应激和热休克等各种压力条件下被激活, 14^{、15、16、17}。另一方面, pkr 的抑制导致细胞增殖甚至恶性转化的增加 18^,19。pPKR 功能在正常大脑功能和细胞周期中也很重要, 因为在 m 期^{20、21、22 期间}, ppkr 水平升高。在这种情况下, ppkr 抑制全局转换, 并为正确的细胞分裂20所需的关键有丝分裂信号系统提供提示。此外, 长时间激活 pkr 导致 g2m 相细胞周期停止在中国仓鼠卵巢 23.因此, pkr 磷酸化由负反馈回路调节, 以确保在 mg1 过渡^期间快速失活21。

尽管 pkr 功能范围广泛, 但由于缺乏能够激活 pkr 的标准化高吞吐量实验方法来捕获和识别 dsrna, 我们对 pkr 激活的理解有限。先前的研究表明, pkr 可以与由两个倒置 alu 重复 (iralus)^20、24形成的 dsrna 相互作用, 但存在额外的细胞 dsrna 的可能性, 这些细胞 dsrna 可以在细胞周期内或以下激活 pkr。人类细胞的应激条件尚未探索。识别 rna 结合蛋白 (rbp) rna 相互体的常规方法是利用紫外光将 rna-rbp 复合物^交联 25^、26、27。最近的一项研究将这种紫外交联方法应用于小鼠系统, 并确定小核子蛋白 rna 可以调节 pkr 激活在代谢应激¹⁶。利用甲醛的高交联效率, 提出了一种在 hela 细胞²⁸细胞周期中识别 pkr 相互作用 rna 的替代方法。在其他 dsRBPs (如 staufen 和 drosha^29、30、31) 的研究中也采用了类似的方法。我们发现 pkr 可以与各种类型的非编码 rna 相互作用, 如短插层核元件 (sine)、长穿插核元素 (line)、内源性逆转录病毒元素 (erv), 甚至α-卫星 rna。此外, 我们还表明 pkr 可以与线粒体 rna (mtrna) 相互作用, 线粒体 rna 通过重链和光链 rna²⁸之间的互补相互作用形成分子间 dsrna。最近的一份出版物进一步支持了我们的数据, 即一些 mtrna 以双工形式存在, 并可以激活 dsrna 传感器, 如黑色素瘤差异相关的蛋白质 5, 以诱导干扰素³²。更重要的是, mtrna 的表达和亚细胞定位在细胞周期和各种压力源中被调节, 这可能对它们调节 pkr 激活²⁸的能力很重要。

在本文中, 我们提出了一个详细的协议, 最近开发的甲醛交联和免疫沉淀 (fCLIP) 方法来捕获和分析 pkr 相互作用的 rna 在细胞周期。我们演示了用胸苷和诺加唑制备细胞周期抑制样本的方法。然后, 我们提出了分离 pkr 绑定 rna 的 fclip 过程, 以及一种准备高吞吐量测序库以识别这些 rna 的方法。此外, 我们还描述了使用 qrt-pcr 分析 pkr 绑定 rna 的详细过程。具体而言, 我们提出了一个字符串特定的逆转录过程来分析 mtrna 的字符串。所述协议针对 hara 细胞和 pkr 进行了优化, 但可轻松修改细胞周期样本、fclip 和特异性 qrt-pcr 分析等关键步骤, 以研究细胞 dsrna 或识别其他 dsRNAs 的 rna 干扰体。

1. 溶液和细胞制备

1. 解决方案准备
   1. 对于细胞培养培养基, 在杜尔贝科改良鹰培养基 (dmem) 的500毫升中加入50毫升的胎儿牛血清 (fbs), 制备平细胞培养培养基。
      注: 抗生素可以添加到细胞培养基中, 但我们不使用抗生素。
   2. 对于0.1% 的甲醛, 在1x 磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 中溶解 4% (w/v), 在热板上加热并稀释, 通过添加 1x pbs 使30% 毫升的甲醛。
      注意: 在烟罩中执行所有步骤, 并注意不要将甲醛溶液煮沸。保护0.1% 溶液不受光线的影响, 并存储在4°c。在一个月内使用该解决方案。
      注: 最终 0.1% (v/v) 聚甲醛溶液的 ph 值应在7左右。
   3. 准备 fclip 裂解缓冲液:20 mm Tris-HCl (ph 7.5), 15 mm 氯化钠、10 mm edta、0.5% (v/v) 非偏数-p40 (np-40)、0.1% (v/v) triton x-100、0.1% (v/v) 十二烷基硫酸钠 (sds) 和 0.1% (w/v) 脱氧胆酸钠。将三重蒸馏水 (tdw) 加入40毫升。存放在4°c。
   4. 准备 fclip 洗涤缓冲液:20 mm Tris-HCl (ph 7.5)、150 mm 氯化钠、10 mm edta、0.1% (v/v) np-40、0.1% (v/v) triton x-100、0.1% (v2) sds 和 0.1% (w/v) 脱氧胆酸钠。加入 tdw 到40毫升。存放在4°c。
   5. 准备 4x pk 缓冲液: 400 mm Tris-HCl (ph 7.5)、200 mm 氯化钠、40 mm edta 和 4% (v/v) sds。加入 tdw 到40毫升。在室温下存放。
   6. 准备 fclip 洗脱缓冲液: 4 x pk 缓冲液20毫升, 尿素21克, tdw 8.5 毫升。准备新鲜的。
   7. 制备 rna 洗脱缓冲液: 0.3 m naoac 和 2% (w/v) sds。在室温下存放。
   8. 制备 2x rna 加载染料: 0.025 (w/v) 溴酚蓝, 0.025 (w/v) 二甲苯氰醇, 5 mm edta, 0.025 (w/v) sds, 95% (v/v) 甲酰胺。储存在-20°c。
   9. 准备 1x tbe 缓冲液: 0.089 mm Tris-Borate 和 0.002 m edta。准备500毫升的 tbe 缓冲器。
2. s 或 m 相抑制细胞的制备
   1. 种子 ~ 750, 000 或 ~ 1, 000, 000, 000 平底细胞, 分别为 s 或 m 相抑制样本。在37°c 和 5% co2 下生长24小时细胞 。
   2. 用 2 mm 胸苷治疗细胞, 在37°c 孵育18小时。
   3. 用 pbs 清洗细胞两次。在37°c 下加入新鲜培养基并孵育9小时。
   4. 对于 s 相停止细胞, 用 2 mm 胸苷治疗细胞。对于 m 相抑制细胞, 用 100 ngml nocodazole 唑治疗细胞。在37°c 下孵化 15小时, 收获细胞。
      注: 可以使用流式细胞仪检查细胞周期样本的均匀性。

2. 甲醛交联和免疫沉淀

1. 细胞收获
   1. 对于 s 相样品, 用细胞刮刀收集细胞, 并转移到15毫升的锥形管中。对于 m 相样本, 点击细胞培养盘的一侧分离 m 相抑制细胞, 并将其转移到15毫升的锥形管中。
      注: 为了增加 m 相抑制细胞的均匀性, 请不要使用细胞刮刀。
   2. 在室温下以 380 x克离心细胞 3分钟, 取出上清液, 用1毫升的冷 pbs 重新悬浮, 转移到 1.5 ml 的微离心管中。
   3. 在4°c 条件下, 以 10, 000 x g的温度离心细胞 30秒, 完全去除上清液。
2. 甲醛交联
   1. 在室温下加入 750μl 0.1% 的甲醛, 10分钟, 固定细胞。
   2. 加入250μl 的 1 m 甘氨酸, 在室温下额外孵育 10分钟, 以淬火反应。在4°c 条件下, 以 10, 000 x g的温度离心细胞 30秒, 完全去除上清液。
   3. 用1毫升的 pbs 重新暂停。在4°c 下以 10, 000 x g的温度离心细胞 30秒, 并去除上清液。
   4. 用400μl 的 fclip 裂解缓冲液重新悬浮, 辅以 0.2% (v/v) 蛋白酶抑制剂和 2% (v/v) rnase 抑制剂。在冰上加血 10分钟, 用超声波机进行声纳。
   5. 加入11μl 的5m 氯化钠, 将氯化钠浓度调整到 ~ 150 mm。旋涡短暂, 离心机在 21,130 x g在4°c 下 15分钟, 将上清液转移到预冷 1.5 ml 微离心管中。
      注: 将40μl 上清液保留在新的离心管中作为输入样品。将输入样品存放在4°c。
3. 免疫沉淀
   1. 在 1.5 ml 微离心管中加入20μl 的蛋白质 a 珠。
   2. 用400μl 的 fclip 裂解缓冲液清洗珠子。在4°c 条件下以 1, 000 x g离心珠子 1分钟, 取出上清液, 小心添加400μl 的 fclip 裂解缓冲液。通过倒置 3 ~ 4次轻轻重新悬浮珠子。
   3. 重复清洗步骤三次。最后清洗后, 完全取出上清液。
   4. 在300μl 的 fclip 裂解缓冲液中重新悬浮珠子。加入8.3μl 的 5 m 氯化钠, 将氯化钠浓度调整到 ~ 150 mm。加入10μl 的 pkr 抗体, 在4°c 的旋转器上孵育3小时。
   5. 在4°c 下以 1, 000 x g离心珠子 1分钟, 取出上清液, 加入400μl 的 fclip 洗涤缓冲液。通过倒置 3 ~ 4次轻轻重新悬浮珠子。
   6. 重复两次清洗步骤。最后清洗后, 完全取出上清液。
      注: 切勿使用涡流混合器。用双手轻轻反转管子。
   7. 加入300μl 的裂解液, 在4°c 时在旋转器上孵育3小时。
      注: 较长的孵育时间可能会导致背景结合增加。
   8. 在4°c 下以 1, 000 x g离心珠子 1分钟, 取出上清液, 加入400μl 的 fclip 洗涤缓冲液。通过倒置 3 ~ 4次轻轻重新悬浮珠子。
   9. 重复清洗步骤三次。最后清洗后, 完全取出上清液。
   10. 加入300μl 的 fclip 洗脱缓冲液。在25°c 的温度下在热敏器中培养 3小时, 从珠子中洗脱 pkr。
       注: 准备新鲜的 fclip 洗脱缓冲液。
   11. 在室温下以 1, 000 x克离心, 并将上清液转移到干净的硅化管中。
       注: 微离心管也是确定的, 但硅化管是首选, 以防止蒸发在交联步骤 (步骤 2.3.12)。
   12. 加入300μl 蛋白酶 k (20mg/ml), 在65°c 下孵育过夜。
       注: 使用热敏管与加热盖, 以避免蒸发。
4. rna 提取
   1. 加入580μl 的酸性-苯酚氯仿和涡旋, 在37°c 下进行1年的培养。
   2. 涡流为 30秒, 离心机在室温下为 12, 000 x g , 为10分钟。
   3. 将顶层转移到干净的 1.5 ml 微离心管中。加入 3 m naoac 的半容量, 0.5 微米的共沉淀剂 (如糖蓝), 以及等量的异丙醇。在-20°c 下过夜。
   4. 以最高速度在4°c 离心 1小时, 沉淀颗粒。
      注: 如果没有观察到 rna\ dna 颗粒, 则再添加0.5μl 的共沉淀剂和离心机, 再增加 1小时, 继续这一步骤, 直至观察到 rna/dna 颗粒。
   5. 去除上清液, 加入75% 乙醇1毫升。在4°c 下以 12, 000 x g 离心5分钟. 再重复一次清洗步骤。完全取出上清液, 在室温下干燥颗粒。
   6. 加入42μl 的 tdw、5μl 的 dnase i 缓冲液、1μl 的 rnase 抑制剂和2μl 的 dnase i. 在37°c 下培养1小时。
   7. 加入150μl 的 tdw 和200μl 的酸性-苯酚氯仿。涡流为 30秒, 在室温下离心 10分钟.
   8. 将顶层转移到干净的 1.5 ml 微离心管中。加入20μl 的 3 m naoac, 0.5μl 的共沉淀剂, 和1毫升的100% 乙醇。在-80°c 下过夜。
   9. 沉淀颗粒和清洗与75% 乙醇如步骤所述 2.4.4 2.4.5。
   10. 以适当数量的 tdw 重新暂停。

3. 测序库准备

1. rrna 去除
   1. 用28μl 的 tdw 从步骤2.4.10 重新悬浮 rna 颗粒。
      注: 总 rna 的最大数量应小于5微克。
   2. 按照 rrna 去除试剂盒的参考指南提供的程序进行删除 rrna。
   3. 通过添加160μl 的磁珠来清理 rrna 耗尽的 rRNA。
      1. 通过移液量 ~ 15次混合, 在室温下孵育15分钟。
      2. 将管子连接在磁性棒上, 并取出上清液。
      3. 加入300μl 的80% 乙醇, 而珠子仍然附着在磁条上, 孵育30秒。
      4. 用新鲜的300μl 溶液取代乙醇。在室温下, 空气干燥磁棒上的珠子12分钟。
      5. 将珠子重新悬浮在12μl 的 tdw 中, 然后通过移液15次混合。
      6. 将磁珠连接在磁条上, 并将上清液移动到干净的 pcr 管上。
   4. 按照 rrna 消耗试剂盒提供的程序, 检测分散的核糖体 rna (rrna)。
   5. 通过添加110μl 磁珠和重复步骤 3.1.3.1 3.1.3.6 来清洁 rna。
2. rna 标记和适应剂结扎
   1. 在 rra-耗尽 rna 上, 加入2μl 的 10倍 ciap 缓冲液、1μl 的 rnase 抑制剂和2μl 的南极碱性磷酸酶。在37°c 下孵化 1小时, 然后在65°c 下孵化5分钟以激活磷酸酶。
   2. 加入3μl 的 10倍 pnk 缓冲液、1.5μl 的 rnase 抑制剂、1.5μl 的 t4 pnk 酶、0.8μl 的 r-atp 和1.7μl 的 tdw。在37°c 下孵化50分钟。
   3. 加入1.5 μl 的 10 mm atp, 在37°c 孵育, 再延长40分钟。
   4. 通过添加170μl 的 rna 洗脱缓冲液来停止反应。
   5. 加入200μl 的酸性苯酚氯仿和涡旋, 30s. 在室温下离心 10分钟, 离心时间为 12, 000 x 克。
   6. 将顶层转移到干净的 1.5 ml 微离心管中。加入20μl 的 3 m naoac, 0.5μl 的共沉淀剂, 和1毫升的100% 乙醇。在-80°c 下过夜。
   7. 沉淀 rna 颗粒, 并在 2.4.4 2.4.5 的步骤中所述, 用75% 的乙醇进行洗涤。在 tdw 的4.5μl 中重新悬浮, 并加入9μl 的 2x rna 加载染料。
   8. 在95°c 下加热样品 5分钟, 并在 10% urea-page 凝胶上加载。
   9. 在 370 v 处运行凝胶40分钟。
      注: 在加载样品之前, 请将凝胶在 370 v 处预置90分钟。
   10. 在 ~ 100–500核苷酸区域切割凝胶并破坏凝胶。
   11. 加入 300μl 0.3 m 氯化钠, 在4°c 下旋转孵育过夜。
   12. 在室温下以最高速度将溶液转移到色谱柱和离心机上5分钟。
   13. 将洗脱液转移到干净的 1.5 ml 微离心管中。加入 3 m naoac 的半体积, 0.5μl 的共沉淀剂, 和等量的异丙醇。在-20°c 下过夜。
3. 3 ' 适配器结扎
   1. 沉淀 rna 颗粒, 并在 2.4.4 2.4.5 的步骤中所述, 用75% 的乙醇进行洗涤。
   2. 在6.5μl 的 tdw 中重新悬浮 rna 颗粒, 并添加 1μl 10μm3 的适配器。
   3. 将溶液转移到 pcr 管, 在70°c 孵育2分钟。
   4. 加入1μl 的10倍结扎缓冲液, 0.5μl 的 rnase 抑制剂, 1μl 的 t4 rna 连接酶2。在28°c 下培养 1小时, 25°c 6小时, 22°c 6年。
   5. 加入12μl 的 2x rna 加载染料, 并在95°c 下加热5分钟。
   6. 凝胶净化 3 ' 适配器结扎的 rna, 如3.2.9 所述, 以3.2.13。
4. 5 ' 适配器结扎
   1. 沉淀 rna 颗粒, 并在 2.4.4 2.4.5 的步骤中所述, 用75% 的乙醇进行洗涤。
   2. 在 tdw 的4.2μl 中重新悬浮 rna 颗粒, 并添加 1μl 5μm 5 的适配器。
   3. 将溶液转移到 pcr 管, 在70°c 孵育2分钟。
   4. 加入0.8μl 的10倍连接酶缓冲液, 0.4μl 的 rnase 抑制剂, 0.8μl 的 10 mm atp, 0.8μl 的 t4 rna 连接酶1。在28°c 下培养 1小时, 25°c 6小时, 22°c 6年。
5. 逆转录酶和 pcr 扩增
   1. 在 5 ' 适配器连接 rna 上, 加入 1μl 4μm 逆转录引物。在70°c 下孵化 2分钟, 立即冷却至4°c。
   2. 加入4μl 的 5x fs 缓冲液、4μl 的 2.5 mm dntp、1μl 的 0.1 m dNTP、1μl 的 rnase 抑制剂和1μl 的逆转录酶。在50°c 下孵化 1小时, 70°c 孵化15分钟。
   3. 准备 pcr 扩增
      1. 混合 rt 产品的1μl、25μm rpi 底漆的1μl、25μm rp1 底漆的1μl、5xhf 缓冲液的10μl、2.5 mm dntp 的4μl、32.5μl 的 tdw 和0.5μl 的高保真聚合物酶。
      2. 运行 pcr 程序 11 ~ 13个周期。
         注: pcr 程序为: 98°c 为 30秒, 98°c 为 10秒, 60°c 为 30秒, 72°c 为 45秒, 72°c 为5分钟。放大步骤重复11-13 周期。
   4. 使用40μl 的磁珠清洁 pcr 产品, 并按照以下步骤 3.1.3.1 3.1.3.6 但使用10μl 的 tdw 来清除 dna。
   5. 加入2μl 的 10倍 dna 加载染料。将样品装上6% 的丙烯酰胺凝胶, 以 200 v 的速度运行30分钟。
   6. 在室温下, 用 sybr 金染色 5分钟 (1x tbe 缓冲液中的 0.01% (v/v)。
   7. 在室温下在 1x tbe 缓冲液中脱层5分钟。
   8. 在 ~ 200–700核苷酸区域切割凝胶并破坏凝胶。
   9. 加入 300μl 0.3 m 氯化碳, 在室温下孵育一夜, 以洗脱 dna。
   10. 在室温下, 以最高速度将所有内容加载到立柱和离心机上, 时间为5分钟。
   11. 将洗脱液转移到干净的 1.5 ml 微离心管中。加入 3 m naoac 的半体积, 0.5μl 的共沉淀剂, 和等量的异丙醇。在-20°c 下过夜。
   12. 如 2.4.4 2.4.5 的步骤所述, 用75% 的乙醇沉淀 dna 颗粒并进行洗涤。在20μl 的 tdw 中重新悬浮。
   13. 使用排序器分析示例。

4. 利用 qrt-pcr 分析 pkr 相互作用的 rna

1. 方法 1: 随机六边形逆转录酶
   1. 用8.5μl 的 tdw 从步骤2.4.10 重新悬浮 rna 颗粒, 并将溶液转移到 pcr 管中。
   2. 加入0.5μl 的100μm 随机高架, 加入4μl 的 2.5 mm dntp 混合。
   3. 在65°c 下加热溶液 5分钟, 并立即在冰上孵育至少1分钟。
   4. 反应混合: 5x ssiv 缓冲液的4μl、100 mm dtt 的1μl、rnase 抑制剂的1μl 和逆转录酶的 1μl (200uμ-l)。将反应混合物添加到 rna 溶液中。
   5. 将混合物在23°c 下培养 10分钟, 50°c 10分钟, 80°c, 10分钟。
   6. 使用实时 pcr 系统分析 cdna。
      注: 实时 pcr 程序为: 95°c 为热启动 3分钟, 95°c 为 5秒, 60°c 为 10秒, 95°c 为 30秒, 65°c 为 30秒, 95°c 为熔体。放大步骤重复40个周期。
2. 方法 2: 征方特异性逆转录酶
   1. 制备反向引物的主混合物: 混合含有 cmv 启动子序列的基因特异性逆转录引物的等量, 然后是基因特异性序列的 ~ 20个核苷酸。
      注: 所有基因特异性 rt 引物的联合浓度为4μm。
   2. 用8.5μl 的 tdw 从步骤2.4.10 重新悬浮 rna 颗粒, 并将溶液转移到 pcr 管中。
   3. 加入0.5μl 的4μm 主混合逆转录酶引物和 4μl 2.5 mm dntp 混合。
   4. 在65°c 下加热溶液 5分钟, 并立即在冰上孵育至少1分钟。
   5. 通过混合4μl 的 5倍 ssiv 缓冲液、1μl 的 100 mm dtt、1μl 的 rnase 抑制剂和1μl 的逆转录酶 (200 ueμl) 来制备反应溶液。将反应溶液添加到 rna 底漆混合物中。
   6. 在50°c 下将溶液生也就是 10分钟, 在80°c 下孵化10分钟。
   7. 利用实时 pcr 系统对 cdna 进行分析。
      注: 实时 pcr 程序与方法1中描述的程序相同。

图 1显示了在细胞周期的 s 或 m 阶段逮捕 hela 细胞的过程示意图。对于 m 相抑制样本, 我们可以在显微镜下清楚地显示圆形细胞 (图 2a)。为了检查细胞周期抑制的效率, 可以使用流式细胞仪分析细胞的核含量 (图 2b)。图 3显示了免疫沉淀效率测试的代表性数据, d7f7 抗体显示出优于免疫沉淀 pkr 的能力。免疫沉淀效率的这种差异可能反映在使用两种不同的 pkr 抗体制备的高通量测序库的类别分布的差异上 (图 4)。d7f7 抗体的特异性进一步证实了使用整个 blot 西方分析的 pkr 免疫沉淀 (图 5a) 和总细胞裂解物 (图 5A)。图 6显示了在高通量测序库准备过程中去除 rrna 前后的放射性同位素信号。图 7显示了 rna 中 mtrna 的富集与 pkr 共同沉淀, 但不在 rna 中的富集与兔 igg 或 diorge 综合征染色体区域 8 (dgcr8) 共同免疫沉淀。图 8显示了 s 或 m 相夹紧样本中 pkr 约束 mtrna 的代表性链特异性 qrt-pcr 分析。

图 1: 制备细胞周期抑制样本的示意图.(A、B)准备 s (a) 或 m (b) 相环被捕的 hela 细胞的原理图。请点击这里查看此图的较大版本.

图 2: 细胞周期被抑制样本的分析.(a) s 或 m 相抑制样本的相位对比图像。条形图为250微米。(b) 显示样品核含量的流式细胞仪分析。请点击这里查看此图的较大版本.

图 3: pkr 抗体的免疫沉淀效率试验.为了成功地丰富 pkr 结合 rna, 应使用具有明确免疫沉淀效率的抗体, 如 d7f7 抗体。请点击这里查看此图的较大版本.

图 4: 使用不同 pkr 抗体制备的测序库的 rna 类分布.使用不同的 pkr 抗体进行 fCLIP 导致了不同的映射测序读取类分布。这种差异可能是由于免疫沉淀效率的差异造成的。这一数字已从 kim 等人 28人的报告中修改。请点击这里查看此图的较大版本.

图 5: d7f7 pkr 抗体的特异性。(A、B)对 pkr 免疫沉淀 (a) 或总热拉裂解液 (b) 的全 blot 西方分析显示, 只有一个与 pkr 大小相对应的强带, 表明 d7f7 抗体在识别 pkr 方面具有高度的特异性。请点击这里查看此图的较大版本.

图 6: pkr 共免疫沉淀 rna 的放射性同位素信号.(a) pkr 联合免疫沉淀 rna 可以通过标记其 5 ' 端标记为 r-atp 来检测。(b) 在成功去除 rrna 后, 观察到放射性信号减少。请点击这里查看此图的较大版本.

图 7: 验证 pkr-mrna 相互作用.记录 2倍富集 mtrna 在 rna 共同免疫沉淀与指示抗体。只有 pkr 联合免疫沉淀 rna 样本显示出强的 mtrna 富集。用家兔 igg 和 dgcr8 抗体作为阴性对照。这一数字已从 kim 等人 28人的报告中修改。请点击这里查看此图的较大版本.

图 8: pkr-trna 的应变特异性 qrt-pcr 分析.(A、B)利用应变特异性逆转录酶分析了 s (a) 或 m (b) 相抑制细胞与 pkr 共同免疫沉淀的 mtrna 的狭窄性。这一数字已从 kim 等人 28人的报告中修改。请点击这里查看此图的较大版本.

作者没有什么可透露的。