方法文章

一种用于研究病原体或药物穿越血脑屏障及其与大脑相互作用的人源性血脑界面模型

DOI：

10.3791/59220

⸱

2019年4月9日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institut Pasteur, CNRS UMR 3569, Unité de Neuroimmunologie Virale, 2Institut Pasteur, Unité d’Epidémiologie et de Pathophysiologie des Virus Oncogènes, Université Sorbonne Paris Cité/Paris Diderot, 3Institut Pasteur, PFIA, DTPS

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种在细胞内构建血脑屏障-微型脑聚酯多孔膜培养插入系统的方法，用于评估生物分子或感染性物质穿过人血脑屏障的转运过程及其对邻近脑细胞的生理影响。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

针对神经系统药物在相关且可靠的细胞内血脑屏障（BBB）模型中进行早期筛选，以评估其穿透能力以及与屏障和脑实质的相互作用，目前仍是一项未被满足的需求。为填补这一空白，我们设计了一种二维细胞内模型——BBB-Minibrain，该模型将聚酯多孔膜培养小室构建的人源血脑屏障模型与由三种人源脑细胞（神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞）共培养形成的Minibrain相结合。利用BBB-Minibrain模型，我们能够检测一种神经保护候选药物（例如Neurovita）穿越血脑屏障的转运过程，确定该分子对神经元的特异性靶向性，并证明药物在穿越血脑屏障后仍保留其神经保护特性。我们还证实，BBB-Minibrain是一种有价值的模型，可用于检测病毒颗粒穿过内皮细胞屏障的过程，并监测神经侵袭性病毒颗粒对Minibrain的感染情况。BBB-Minibrain是一种可靠且易于操作的系统，适用于掌握细胞培养技术的研究人员，且能够预测药物处理或损伤后脑细胞的表型变化。此类细胞内检测模型的应用具有双重意义：一方面可在药物研发早期引入降低风险的步骤，另一方面有助于减少动物实验的使用。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

大脑被一种非通透性结构与体循环隔离开来，该结构限制了脑实质与血液之间的物质交换，这种结构称为血脑屏障（BBB）。血脑屏障主要由脑内皮细胞构成，并与邻近脑实质中的星形胶质细胞、血管周围小胶质细胞以及神经元动态相互作用。血脑屏障的三大主要功能是为神经元活动建立并维持离子稳态、向大脑供应营养物质，以及防止有毒损伤或病原体入侵1,2，这些功能共同维持了大脑的稳态及其正常功能3。该屏障极为有效，仅有极少数药物能够穿越血脑屏障4,5。目前，预测某种分子是否能够通过血脑屏障并扩散至大脑的方法包括：利用尸体组织进行离体研究、通过磁共振成像（MRI）或正电子发射断层扫描（PET）对人脑志愿者进行体内示踪成像，或在动物中开展药效学与药代动力学的临床前研究6,7,8。这些技术与模型均存在一定局限性，例如PET分辨率有限、MRI灵敏度较低6,8，难以定量检测脑内穿透能力较差的分子（例如基于抗体的分子）7，而临床前研究还存在成本高昂以及需使用动物实验等问题。

最后一点非常重要，因为根据“3R原则”（替代、减少和优化动物实验），监管机构已要求研究人员紧急开发出科学上准确的动物实验替代方法9,10,11,12,13,14,15。

近几十年来，已提出多种血脑屏障（BBB）的体外模型16,17,18，其方法是在滤膜插件上培养来自不同物种（如小鼠、大鼠、牛和猪）的内皮细胞。对于人类血脑屏障模型而言，由于原代细胞来源稀少且获取困难，研究人员转而开发基于永生化脑微血管内皮细胞或人源性干细胞的模型19,20,21。这些体外模型若能表达内皮细胞标志物、紧密连接蛋白标志物、外排转运蛋白、溶质载体、受体，并对内皮细胞刺激产生响应，则可作为合适的血脑屏障替代模型20。已有若干研究检测了使用滤膜插件并接种内皮细胞与其他细胞类型（如星形胶质细胞、神经元或周细胞22,23,24）构建的血脑屏障模型。此类共培养模型的目标是利用星形胶质细胞/神经元或周细胞分泌的可溶性因子，以增强血脑屏障的物理特性。

然而，这些模型均未包含脑实质，无法用于研究和预测药物候选物穿过屏障后的去向。因此，我们的目标是将血脑屏障模型与混合脑细胞培养相结合，构建一种细胞内的血脑界面——BBB-Minibrain，集成于单一试剂盒中。BBB-Minibrain采用一种培养系统，该系统由插入多孔细胞培养板孔中的多孔滤膜组成。滤膜上包被hCMEC/D3细胞——一种已被证实高度可靠的用于血脑屏障药物测试的人脑微血管内皮细胞系25,26,27，以形成血脑屏障。Minibrain则由来源于NTera/Cl2.D1细胞系的人类神经元与星形胶质细胞共分化培养物28,29，与人小胶质细胞系CHME/Cl530按脑组织中小胶质细胞与神经元-星形胶质细胞比例混合构成31，培养于培养板孔底部。

除了研究药物通过血脑屏障（BBB）及其在脑实质中的命运外，体外细胞模型中的血脑界面还可作为研究病原体进入大脑（神经侵袭性）、在脑内扩散（神经趋向性）以及对脑实质细胞产生毒性作用（神经毒力）的有力工具。神经毒力和神经侵袭性研究将受益于高效的体外细胞模型的建立，并有望替代动物模型。利用BBB-Minibrain试剂盒32，我们证实了罕见黄热病毒（Yellow Fever Virus）突变株的神经侵袭表型，这些突变株富集于用于制备已停用的黄热病毒活疫苗的法国嗜神经病毒株（FNV-YFV33,34），同时也验证了一种名为Neurovita（文中简称为NV）的具有神经再生和神经保护功能的生物分子的跨BBB能力35。由于NV本身无法自然穿过细胞膜或血脑屏障，因此将其与羊驼单链抗体的可变区（VHH）融合，该VHH能够穿透包括血脑屏障在内的生物膜，并作为细胞穿透分子（CPM）发挥作用36。VHH的细胞穿透特性似乎取决于其等电点及长度37。

这种细胞内检测方法有望在对动物（理想情况下也包括人体）进行药代动力学和药效学分析之前，筛选出可能穿过血脑屏障（BBB）的分子，同时还能预测这些分子在神经实质中的行为。该系统具有生物学相关性，且对于细胞培养技术熟练的专业人员而言，易于建立和操作26,29,30,38。此类细胞内检测的意义是双重的：一方面可降低临床前试验的成本，另一方面可减少动物实验的使用。

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方案

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1. 培养 Ntera/CL2.D1 细胞以制备有丝分裂后人神经元与人星形胶质细胞的共培养体系（NT2-N/A）

注意：这是小脑（图1）的组成部分。

  1. NTera/Cl2.D1 细胞的培养
    1. 从液氮罐中取出一管冻存细胞，置于冰上保存。
    2. 在 37 °C 水浴中快速融化细胞。
    3. 将细胞转移至含有 10 mL 完全 DMEM F12 培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基：营养混合物 F-12 培养基）的 15 mL 离心管中，该培养基添加有 10% 胎牛血清（FBS）、2 mM 谷氨酰胺、100 IU 青霉素和 100 µg 链霉素（即完全 DMEM F12 培养基）。
    4. 在室温（RT）下以 200 ×g 离心 5 分钟。用 2 mL 完全 DMEM F12 培养基重悬细胞沉淀。
    5. 将细胞转移至含 13 mL 完全 DMEM F12 培养基的聚苯乙烯 T75 组织培养瓶中，该培养瓶经过特殊处理以适用于敏感贴壁细胞（T75Cell+）。
    6. 将细胞置于 37 °C、5% CO2 和 95% 湿度的培养箱中培养至约 90% 汇合度（约 5 天）。每 2–3 天更换一次培养基。
  2. NTera/Cl2.D1 细胞的传代与扩增
    1. 从培养瓶中移除培养基。
    2. 用 10 mL 添加了 Ca2+ 和 Mg2+ 的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞单层。
    3. 用 10 mL EDTA 溶液（室温保存）再次冲洗细胞单层。
    4. 加入 3 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液（0.05% 胰蛋白酶，0.02% EDTA），在室温下孵育 2 分钟。
    5. 轻轻摇动培养瓶，确保细胞从塑料表面完全脱落。
    6. 加入 10 mL 完全 DMEM F12 培养基以终止胰蛋白酶活性，将细胞转移至 15 mL 离心管中，在室温下以 200 ×g 离心 5 分钟。
    7. 用 10 mL 完全培养基重悬细胞沉淀，并取 1 mL 接种至每个含有 14 mL 完全 DMEM F12 培养基的新培养瓶中。
      注：每次诱导分化需要 30 个 T75 Cell+ 培养瓶。
    8. 将培养瓶置于 37 °C、5% CO2 和 95% 湿度条件下培养至 90% 汇合度。
  3. NTera/Cl2.D1 细胞向人神经元-星形胶质细胞共培养体系的分化
    注：此为“迷你脑”（Minibrain）的主要组成部分。
    1. 第 0 天，使用胰蛋白酶-EDTA 按步骤 1.2 所述方法消化细胞，并用 2 mL 完全 DMEM F12 培养基重悬每个培养瓶中的细胞沉淀。
    2. 将 1 mL 细胞悬液（相当于 5 × 106 个细胞）加入 60 个直径为 85 mm 的塑料培养皿中，每个培养皿中已含有 11 mL 完全 DMEM F12 培养基。
      注：细胞不会贴附于塑料表面，而是聚集形成拟神经球（参见 图 1 下方图示）。将 60 个培养皿置于 37 °C、5% CO2 和 95% 湿度条件下培养 1 天。
    3. 第 1 天，向每个培养皿中加入 1 mL 添加了 130 µM 全反式维甲酸（ATRA）的完全 DMEM F12 培养基（最终 ATRA 浓度为 10 µM），继续在 37 °C、5% CO2 和 95% 湿度条件下孵育 24 小时。
    4. 第 2 天，小心地将每个培养皿中含有细胞球的培养基转移至 50 mL 离心管中，在室温下以 50 ×g 离心 10 分钟。用 13 mL 添加了 10 µM ATRA 的完全 DMEM F12 培养基轻柔重悬松散的细胞沉淀，并将全部 13 mL 悬液转移至一个新的 85 mm 直径培养皿中。
      注：在后续各代培养过程中，必须尽可能维持细胞球密度与第 2 天达到的密度一致（即约 70% 密度）。因此，若细胞球密度下降，应根据细胞数量相应减少培养皿总数。
    5. 在第 4、6 和 8 天重复上述操作（步骤 1.3.4）。
    6. 第 10 天，重复上述操作，但将细胞球转移至 T75 Cell+ 培养瓶而非培养皿中。每个培养皿的细胞转移至一个 T75 Cell+ 培养瓶。
    7. 在第 11、13、15 和 17 天，更换旧培养基，每瓶加入 14 mL 添加了 10 µM ATRA 的完全 DMEM F12 培养基。
    8. 第 19 天，每瓶更换为 14 mL 不含 ATRA 的完全 DMEM F12 培养基。
    9. 第 20 天，按以下步骤轻柔地使用胰蛋白酶/EDTA 消化细胞。
      1. 对每个 T75 Cell+ 培养瓶，先用 10 mL 添加了 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS 冲洗细胞；再加入 4 mL EDTA，在室温下孵育 5 分钟。
      2. 小心吸除 EDTA，加入 2 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液，在室温下孵育 7 分钟。极轻柔地摇动培养瓶，然后小心加入 8 mL 完全 DMEM F12 培养基。
      3. 在室温下以 160 ×g 离心 10 分钟。用 13 mL 完全 DMEM F12 培养基重悬细胞沉淀，并转移至一个 T75 Cell+ 培养瓶中。
        注：这种极轻柔的胰蛋白酶-EDTA 消化方法可使经 ATRA 诱导分化的细胞从原始畸胎瘤细胞中分离出来，后者会牢固贴附于塑料器皿表面。
    10. 第 21 天，移除培养基及死亡细胞。每瓶加入 14 mL 完全 DMEM F12 培养基，添加 5% FBS、2 mM 谷氨酰胺、100 IU 青霉素、100 µg 链霉素和 0.5 µM AraC（阿糖胞苷，Cytosine β-D-arabinofuranoside）（即含 5% FBS 的完全 DMEM F12-AraC 培养基）。
    11. 在第 23、25 和 28 天，更换旧培养基，每瓶加入 14 mL 5% FBS DMEM F12-AraC 培养基。
    12. 从第 29 天至第 49 天（每两天一次），更换旧培养基，每瓶加入 14 mL 完全 DMEM F12 培养基，添加 5% 胎牛血清、2 mM 谷氨酰胺、100 IU 青霉素、100 µg 链霉素、5 µM FudR（5-氟-2'-脱氧尿苷）和 10 µM Urd（尿苷）（即含 5% FBS 的完全 DMEM F12-FudR-Urd 培养基）。
    13. 第 50 天，更换旧培养基，每瓶加入 14 mL 完全 DMEM F12 培养基，添加 5% FBS、2 mM 谷氨酰胺、100 IU 青霉素、100 µg 链霉素和 10 µM Urd（即含 5% FBS 的完全 DMEM F12-Urd 培养基）。
    14. 从第 51 天至第 95 天（每周两次），更换旧培养基，每瓶加入 14 mL 完全 5% FBS DMEM F12-Urd 培养基。
      注：细胞自第 51 天起可用于实验，但不得晚于第 95 天。连续使用有丝分裂抑制剂处理可获得纯度较高的终末分化人神经元与人星形胶质细胞共培养体系（NT2-N/A）。
    15. 接种细胞时，参照第 20 天所述方法进行轻柔的胰蛋白酶消化处理。

2. 人小胶质细胞CHME/Cl5的细胞培养操作

注意：这是迷你脑的微胶质细胞组分（图1）。

  1. 培养人小胶质细胞 CHME/Cl5
    1. 从液氮罐中取出一管冻存细胞，置于冰上保存。
    2. 在 37 °C 水浴中快速解冻。
    3. 将细胞转移至含有 10 mL 完全 DMEM F12 培养基的 15 mL 离心管中，该培养基添加有 5% 胎牛血清、2 mM 谷氨酰胺、100 IU 青霉素和 100 µg 链霉素（即含 5% FBS 的完全 DMEM F12 培养基）。
    4. 在室温下以 200 ×g 离心 5 分钟。用 2 mL 含 5% FBS 的完全 DMEM F12 培养基重悬细胞沉淀。
    5. 将细胞转移至一个含有 13 mL 含 5% FBS 的完全 DMEM F12 培养基的 T75 Cell+ 培养瓶中。
    6. 在 37 °C、5% CO2 和 95% 湿度条件下培养，直至细胞融合度达到 90%。每 2–3 天更换一次培养基。
  2. 人小胶质细胞 CHME/Cl5 的传代培养
    1. 从培养瓶中移除培养基。
    2. 用 10 mL 含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS 洗涤细胞单层。
    3. 用 10 mL EDTA 溶液（室温保存）再次洗涤细胞单层。
    4. 加入 3 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液，在室温下孵育 2 分钟。
    5. 轻轻摇动培养瓶，确保细胞从塑料表面完全脱落。
    6. 加入 10 mL 含 5% FBS 的完全 DMEM F12 培养基以终止胰蛋白酶消化作用，将细胞转移至 15 mL 离心管中，并在室温下以 200 ×g 离心 5 分钟。
    7. 用 10 mL 完全培养基重悬细胞沉淀，取 1 mL 接种至每个含有 14 mL 含 5% FBS 的完全 DMEM F12 培养基的新培养瓶中。
    8. 将培养瓶置于 37 °C、5% CO2 和 95% 湿度条件下孵育，直至细胞融合度达到 90%。

3. 使用 hCMEC/D3 进行培养操作以包被多孔插件并制备血脑屏障

  1. 培养人脑微血管内皮细胞 hCMEC/D3（图 2）
    1. 用无菌纯水（细胞培养级）将 I 型大鼠胶原蛋白稀释至 1:30。
    2. 取 10 mL 加入 T75 Cell+ 培养瓶中，在 37 °C、5% CO2 和 95% 湿度的培养箱中孵育 2 小时。
    3. 移除胶原溶液，加入 15 mL 补充了 10 mM HEPES 的内皮细胞培养基（称为完全内皮细胞培养基）。
    4. 从液氮罐中取出一支冻存细胞管，置于冰上保存。
      注意：细胞的扩增及种子库的建立均按照生产商所述方法进行。该细胞系受生物材料转让协议约束。细胞获取时的传代数为 25，不应使用超过第 35 代的细胞。
    5. 在 37 °C 水浴中快速解冻。
    6. 将细胞转移至 T75 Cell+ 培养瓶中，放回 37 °C、5% CO2 和 95% 湿度的培养箱中孵育 2 至 4 小时。
    7. 小心吸除培养基，避免丢失或去除细胞。用 10 mL 完全内皮细胞培养基冲洗细胞一次。
    8. 加入 15 mL 完全内皮细胞培养基。
    9. 在 37 °C、5% CO2 和 95% 湿度条件下培养细胞，直至达到 100% 汇合（不少于 4 天），期间不更换培养基。
  2. 传代培养 hCMEC/D3 以制备血脑屏障（BBB）用插入式培养小室
    1. 按照上述步骤 3.1 所述方法，用 I 型大鼠胶原蛋白包被新的 T75 Cell+ 培养瓶或插入式培养小室。
    2. 吸除培养瓶中的培养基。用 10 mL 含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS 冲洗细胞单层一次。
    3. 加入 2 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液，在 37 °C 下孵育 5 分钟。
    4. 轻轻振荡培养瓶，确保细胞完全从塑料表面脱落。
    5. 加入 4 mL 完全内皮细胞培养基以中和胰蛋白酶活性。
    6. 使用 5 mL 塑料移液管，通过反复吹打细胞悬液（将移液管管口保持在瓶底至少 5 次）进行机械性细胞解离。
    7. 计数细胞，并按每插入式小室 5 × 104 个细胞接种于 12 孔聚酯膜细胞培养插入式小室，或按每 T75 Cell+ 培养瓶 2 × 106 个细胞接种。同时准备三个不接种细胞的空白滤膜，用于后续 PELy 实验（即内皮细胞对荧光黄的通透性测定，见下文第 4.2 段）。
    8. 将培养瓶或插入式小室置于 37 °C、5% CO2 和 95% 湿度的培养箱中孵育，直至细胞达到 100% 汇合。
    9. 对于 T75 Cell+ 培养瓶，在下一次传代前无需更换培养基；而对于聚酯膜细胞培养插入式小室构建的血脑屏障模型，则应在第 2 天和第 4 天更换培养基，并于第 6 天用于实验。

4. BBB-Minibrain 的构建与质量控制（图 2）

  1. 建立血脑屏障-微型脑聚酯膜培养插入装置图2B)
    1. 将hCMEC/D3细胞接种于12孔聚酯膜培养插件滤膜上，在内皮细胞培养基中培养6天，之后用于实验。
    2. 用多聚-D-赖氨酸（1 mL/孔，10 µg/mL，室温孵育4 h）包被12孔板，然后用层粘连蛋白（1 mL/孔，1 µg/mL，室温过夜）包被。
    3. 去除层粘连蛋白，加入1 mL含5% FBS的内皮细胞培养基（5%内皮细胞培养基）。
    4. 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 1 小时2 和95%湿度。
    5. 轻柔地用胰蛋白酶消化NT2-N/A（如步骤1.3.9所述）和CHME/Cl5（如步骤2.2所述），并用完全内皮细胞培养基重悬细胞沉淀。
    6. 计数细胞，混合 3.6 x 105 NT2-N/A 和 0.4 × 105 CHME/Cl5 细胞/孔，接种至 12 孔板。
    7. 在 T=24 h（接种后 24 小时）：更换为新鲜的完全内皮细胞培养基（MiniBrain 细胞和内皮细胞），并将 hCMEC/D3 聚酯膜培养插件滤膜转移至 MiniBrain 细胞上方。将 BBB-MiniBrain 置于 37 °C、5% CO₂ 条件下培养2 和95%湿度。
      注意：BBB-Minibrain 随后将由滤膜上的一层人脑微血管内皮细胞 hCMEC/D3 组成，该滤膜分隔了管腔室（或称“血液”室）和孔底部的 abluminal 室（或称“脑”室），后者包含由人源细胞 hNT2-N/A 和 hCHME/Cl5（Minibrain）组成的混合培养体系。图2B).
  2. BBB-Minibrain内皮通透性的验证（质量控制）图2C)
    1. 制备转运缓冲液（TB），即含有 Ca 的 HBSS（Hanks 平衡盐溶液）缓冲液2+ 和 Mg2+ 添加10 mM HEPES和1 mM丙酮酸钠。
    2. 在12孔板中每孔加入1.5 mL运输缓冲液。
    3. 在 T=0 时，配制新鲜的运输缓冲液，并添加 50 µM 萤光黄（LY-TB）。
    4. 将每个滤膜倒置，小心移除培养基，避免影响内皮细胞屏障。
    5. 将滤膜置于已加满液体的12孔板上，加入0.5 mL LY-TB。
    6. 将培养板置于37°C、5% CO₂的培养箱中孵育2 和95%湿度。
    7. 在 T=10 分钟时，将滤膜转移至新的含 TB 的 12 孔板中，并保留第一块板的基底外室用于 OD 读数。
    8. 在 T = 25 分钟时，重复步骤 4.2.7。
    9. 在 T = 45 分钟时，通过将滤膜从培养板中取出以终止转运。分别保留基底外侧和管腔侧组分用于 OD 测定。
    10. 将样品转移至避光的96孔板中：对于LY-TB和管腔区室，取10 µL样品加入190 µL TB；对于非管腔区室，加入200 µL样品。
    11. 在不同样品中测定LY-TB的荧光，激发波长为λ428 nm，发射波长为λ535 nm。
    12. 计算内皮细胞对 LY-TB 的通透性（Pe）LY）根据 Siflinger-Birnboim, A 等人（1987）的方法39 和 Da Costa, A 等人（2018）34 通过使用以下公式：
      1/PSe = (1/PSt) – (1/PSf) 和 PeLYPSe/S.
      注意：PSf 为无细胞时滤膜的通透性，PSt 为有细胞时滤膜的通透性，PSe 为内皮单层的通透性乘以单层表面积，S 为单层表面积（对于 12 孔滤膜 = 1.12 cm²）2），PeLY 以 cm/min 表示。对于 hCMEC/D3，PeLY 应在 0.7 到 1.2 x 10 之间-3 cm/min，主要取决于实验中使用的FBS。重要提示：一个PeLY 高于1.2表明血脑屏障不够紧密，可观察到一定程度的渗漏，应弃用这些屏障。

5. 使用BBB-微型脑模型揭示黄热病疫苗样本中存在神经侵袭性病毒颗粒，即法国神经嗜性病毒YFV-FNV34（图3）

  1. 黄热病毒穿过血脑屏障并在迷你脑中增殖
    1. 使用按步骤 4.1.7 所述制备的血脑屏障-迷你脑模型，在添加病毒前 24 小时更换培养基为含 2% 胎牛血清（FBS）的内皮细胞培养基。
      注意：在添加病毒前避免更换培养基至关重要。更换培养基可能激活人源内皮细胞，并短暂打开屏障，从而允许病毒通过。本实验中，培养基于实验开始前 24 小时更换。
    2. 在 T = 0 时，将 3500 个噬斑形成单位（PFU）的 YFV-FNV 用 50 µL 含 2% FBS 的内皮细胞培养基稀释后，小心加入管腔侧 compartment 的顶部。对照组血脑屏障-迷你脑模型则加入 50 µL 不含病毒的含 2% FBS 的内皮细胞培养基。同时测定配对孔中的 PeLY 值。
    3. 将血脑屏障-迷你脑模型置于 37 °C、5% CO2 和 95% 湿度的培养箱中孵育。
    4. 24 小时后，移除聚酯膜培养插件滤器，测定 PeLY 值，从基底外侧 compartment 取出 1 mL 培养基样本，并按照 A. da Costa 等（2018）34 所述方法进行病毒滴度测定。随后更换为新鲜的含 2% FBS 的内皮细胞培养基。
    5. 继续将血脑屏障-迷你脑模型在 37 °C、5% CO2 和 95% 湿度条件下孵育。
    6. 72 小时后，采集基底外侧 compartment 的培养基样本并测定病毒滴度，和/或按照 A. da Costa 等（2018）34 所述方法提取迷你脑细胞中的 RNA 用于基因表达分析。
  2. 通过连续传代在迷你脑细胞中扩增嗜神经型 YFV-FNV 变异株
    1. 使用已包被的迷你脑细胞 12 孔板（即完成步骤 4.1.6 和 4.1.7 的孔板）。
    2. 在 0 小时时间点，将 3,500 噬斑形成单位（PFU）的 YFV-FNV 用 50 µL 含 2% FBS 的内皮细胞培养基稀释后，小心加入细胞表面（管腔侧 compartment）。
    3. 1 小时后，移除含有病毒接种物的培养基，并更换为新鲜的含 2% FBS 的内皮细胞培养基。
    4. 48 小时后，取 500 µL 培养基用于感染新的迷你脑细胞。
    5. 120 小时后，取 500 µL 培养基用于感染新的迷你脑细胞。
    6. 192 小时后，保存培养基（即富集后的病毒储备液），并按照 A. da Costa 等（2018）34 所述方法提取迷你脑细胞中的 RNA 用于基因表达分析。

6. 利用 BBB-Minibrain 研究生物分子跨越血脑屏障及靶向脑细胞

  1. 神经元靶向生物分子穿越血脑屏障的运输
    1. 使用按步骤 4.1.7 所述制备的 Minibrain-BBB。
    2. 在 0 小时时间点，加入该生物分子（在结果部分提供的示例中，每个 BBB-Minibrain 插件中加入 58.75 ng/BBB 的细胞渗透性 NeuroTag-NV 分子）。
    3. 将 BBB-Minibrain 置于 37 °C、5% CO2 和 95% 湿度条件下孵育。
    4. 24 小时后，移除聚酯膜培养插件的滤膜装置，测定 PeLY，然后对 Minibrain 细胞进行人神经元神经丝蛋白 Nf200 染色，并检测生物分子在 Minibrain 中的存在情况（在结果部分提供的示例中，使用针对其所含 Strep-Tag 的抗体检测 NeuroTag-NV35,40）。
  2. 神经再生生物分子穿越血脑屏障的运输及其穿越后在 Minibrain 中的后续神经保护检测
    1. 使用按步骤 4.1.7 所述制备的 Minibrain-BBB。
      注：对于仅靶向神经元的分子，Minibrain 细胞可替换为仅含神经元细胞（NT2-N）38。
    2. 在 0 小时时间点，向每个 BBB-Minibrain 孔中加入 58.75 ng 的细胞渗透性 NV 分子（活性形式 CPM-NeuroTag-NV，非活性形式 CPM-NeuroTag-NVΔ），如 C. Prehaud 等人（2014）所述35。
    3. 将 BBB-Minibrain 置于 37 °C、5% CO2 和 95% 湿度的培养箱中孵育。
    4. 4 小时后，使用注射针头（26GX1/2”，12-4.5，Terumo，比利时）在 Minibrain 细胞上制造单个伤口。在每个单独孔中至少制造 10 道划痕。在配对孔中测定 PeLY。
    5. 将 BBB-Minibrain 置于 37 °C、5% CO2 和 95% 湿度的培养箱中孵育。
    6. 8 小时后，将血管外腔室中的培养基更换为新鲜的完全内皮细胞培养基。
      注：此步骤中更换培养基非常重要，因为 Minibrain 细胞的损伤可能导致细胞死亡，从而释放细胞毒性物质。
    7. 将 BBB-Minibrain 置于 37 °C、5% CO2 和 95% 湿度的培养箱中孵育。
    8. 48 小时后，按照 C. Prehaud 等人（2013）所述方法对细胞进行人神经元轴突再生染色40。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BBB-Minibrain 是一种细胞内的血脑屏障界面实验模型。

BBB-Minibrain 建立在聚酯膜培养插件系统上，以模拟血脑屏障界面的上层为血液区、下层为脑组织区（图 2A、B）。该系统由管腔区和非管腔区组成：管腔区为滤膜上培养的 hCMEC/D3 内皮细胞，构成血脑屏障；非管腔区则包含 Minibrain 人源三联培养的脑细胞（神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞）。Minibrain 细胞表现出典型的三联混合细胞群表型（图 1，右下图），并表达每种细胞类型的特异性标志物，如 da Costa A. 等人，2018 年研究所示34。

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文中，我们展示了如何通过将血脑屏障（BBB）模型与混合脑皮层细胞（Minibrain）培养物整合到一个独立装置中，构建一种细胞内血脑界面——BBB-Minibrain。该系统具有生物学相关性，对于熟练掌握细胞培养技术的研究人员而言，操作简便且易于使用。

对于任何其他体外血脑屏障模型而言，只有严格控制屏障的紧密性，才能获得可靠的结果。应仔细检测小室的通透性，任何通透性不符合要求（即LY的表观通透系数PeLY高于1.2）的小室均应弃用。

应仔细检测FBS样品，以确定不会破坏血脑屏障（BBB）特性的批次。对于稀释病毒颗粒或生物分子的载体培养基，也应遵循同样的建议。此外，为避免改变管腔侧培养基的组成，建议尽可能减少生物分子或病毒悬液的体积。由Ntera/CL2.D1细胞系建立的人源共培养神经元/星形胶质细胞体系是一种经过验证的技术。与处于有丝分裂后状态的人类神经元不同，星形胶质细胞仍具有分裂能力，有时可观察到星形胶质细胞的高增殖活性。若出现此情况，则必须弃用该迷你脑（Minibrain）培养物。本实验室所使用的...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该系统的知识产权为参考文献32、35和38中引用的专利。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究获得了巴斯德研究所内部资助，包括一项激励性资助（PTR 435），以及赛诺菲巴斯德公司向巴斯德研究所提供的“研究支持合同”资助。A. da Costa 获得了赛诺菲-巴斯德资助，Florian Bakoa 获得了法国国家研究与技术协会（ANRT）提供的博士研究生资助。我们感谢Pierre-Olivier Couraud教授和Florence Miller博士提供的有益讨论。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
12孔板Corning3336
5-氟-2’脱氧尿苷默克-西格玛奥德里奇F0503
85毫米培养皿Sarstedt83-3902-500
抗-Nf200默克-西格玛奥德里奇N4142
β-巯基乙醇默克-西格玛奥德里奇M3148
CHME/Cl5单位é 病毒神经免疫学应拉丰博士的要求
羧甲基纤维素钠Calbiochem217274
胞嘧啶 β-D-阿拉伯呋喃糖苷默克-西格玛奥德里奇C1768
黑色96孔板Corning3915
DMEM/F12赛默飞世尔科技31330-038
DMSO默克-西格玛奥德里奇D2650
Endogro IVMilliporeSCME004内皮细胞培养基
乙醇Carlo Erba529121
FBSHycloneSV30015-04
甲醛默克-西格玛奥德里奇252549
吉姆萨RAL 诊断320310
山羊抗小鼠杰克逊免疫研究公司115-545-003
Goat-抗兔赛默飞世尔科技R37117
含 Ca2+-Mg2+ 的 HBSS赛默飞世尔科技14025-100
hCMEC/D3CedarlaneCLU512
Hepes 1M赛默飞世尔科技15630-070
Hoescht 33342默克-西格玛奥德里奇33263
Laminine默克-西格玛奥德里奇L6274
L-谷氨酰胺赛默飞世尔科技25030-024
Lucifer Yellow默克-西格玛奥德里奇L0259
MEM 10X赛默飞世尔科技21430
MEM 1X赛默飞世尔科技42360
Ntera/Cl2D.1ATCCCRL-1973
多聚甲醛电子显微镜科学公司15714
不含 Ca²⁺-Mg²⁺ 的 PBS赛默飞世尔科技14190
PBS-Ca²⁺-Mg²⁺赛默飞世尔科技14040-091
青霉素/链霉素EurobioCXXPES00-07
聚-D-赖氨酸默克-西格玛奥德里奇P1149
Prolong Gold赛默飞世尔科技P36930
QiashredderQIAGEN79656
大鼠 I 型胶原蛋白Cultrex3443-100-01
全反式维甲酸默克-西格玛奥德里奇R2625
RNA纯化试剂盒QIAGEN74104
SDS默克-西格玛奥德里奇L4509
碳酸氢钠 5.6%EurobioCXXBIC00-07
丙酮酸钠赛默飞世尔科技11360
T75 细胞培养瓶Sarstedt83-1813-302用于敏感贴壁细胞的经特殊表面处理组织培养聚苯乙烯培养瓶（Cell+）
Transwell康宁3460聚酯多孔膜培养小室
胰蛋白酶-EDTA默克-西格玛奥德里奇T3924
超纯水赛默飞世尔科技10977-035
尿苷默克-西格玛奥德里奇U3750
Versene赛默飞世尔科技15040-033EDTA
YFV-FNVIP 达喀尔疫苗瓶

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  2. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  3. Iadecola, C. The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
  4. Bicker, J., Alves, G., Fortuna, A., Falcao, A. Blood-brain barrier models and their relevance for a successful development of CNS drug delivery systems: a review. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 87 (3), 409-432 (2014).
  5. Banks, W. A. From blood-brain barrier to blood-brain interface: new opportunities for CNS drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (4), 275-292 (2016).
  6. Montagne, A., et al. Brain imaging of neurovascular dysfunction in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 131 (5), 687-707 (2016).
  7. Stanimirovic, D., Kemmerich, K., Haqqani, A. S., Farrington, G. K. Engineering and pharmacology of blood-brain barrier-permeable bispecific antibodies. Advances in Pharmacology. 71, 301-335 (2014).
  8. Albrecht, D. S., Granziera, C., Hooker, J. M., Loggia, M. L. In Vivo Imaging of Human Neuroinflammation. ACS Chemical Neuroscience. 7 (4), 470-483 (2016).
  9. Caloni, F., et al. Alternative methods: 3Rs, research and regulatory aspects. ALTEX. 30 (3), 378-380 (2013).
  10. Whittall, H. Information on the 3Rs in animal research publications is crucial. The American Journal of Bioethics. 9 (12), 60-61 (2009).
  11. Sneddon, L. U. Pain in laboratory animals: A possible confounding factor. Alternatives to Laboratory Animals. 45 (3), 161-164 (2017).
  12. Sneddon, L. U., Halsey, L. G., Bury, N. R. Considering aspects of the 3Rs principles within experimental animal biology. The Journal of Experimental Biology. 220, 3007-3016 (2017).
  13. Wells, D. J. Animal welfare and the 3Rs in European biomedical research. Annals of the New York Academy of Sciences. 1245, 14-16 (2011).
  14. Daneshian, M., et al. A framework program for the teaching of alternative methods (replacement, reduction, refinement) to animal experimentation. ALTEX. 28 (4), 341-352 (2011).
  15. Niemi, S. M., Davies, G. F. Animal Research, the 3Rs, and the "Internet of Things": Opportunities and Oversight in International Pharmaceutical Development. ILAR Journal. 57 (2), 246-253 (2016).
  16. Modarres, H. P., et al. In vitro models and systems for evaluating the dynamics of drug delivery to the healthy and diseased brain. Journal of Controlled Release. 273, 108-130 (2018).
  17. Jamieson, J. J., Searson, P. C., Gerecht, S. Engineering the human blood-brain barrier in vitro. Journal of Biological Engineering. 11, 37(2017).
  18. Kaisar, M. A., et al. New experimental models of the blood-brain barrier for CNS drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (1), 89-103 (2017).
  19. Aday, S., Cecchelli, R., Hallier-Vanuxeem, D., Dehouck, M. P., Ferreira, L. Stem Cell-Based Human Blood-Brain Barrier Models for Drug Discovery and Delivery. Trends in Biotechnology. 34 (5), 382-393 (2016).
  20. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
  21. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783-791 (2012).
  22. Nakagawa, S., et al. A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells, pericytes and astrocytes. Neurochemistry International. 54 (3-4), 253-263 (2009).
  23. Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. Journal of Neuroscience Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
  24. Nakagawa, S., et al. Pericytes from brain microvessels strengthen the barrier integrity in primary cultures of rat brain endothelial cells. Cellular and Molecular Neurobiology. 27 (6), 687-694 (2007).
  25. Ohtsuki, S., et al. Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model. Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 289-296 (2013).
  26. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16(2013).
  27. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  28. Andrews, P. W. Retinoic acid induces neuronal differentiation of a cloned human embryonal carcinoma cell line in vitro. Developmental Biology. 103 (2), 285-293 (1984).
  29. Lafon, M., et al. Modulation of HLA-G expression in human neural cells after neurotropic viral infections. Journal of Virology. 79 (24), 15226-15237 (2005).
  30. Janabi, N., Peudenier, S., Heron, B., Ng, K. H., Tardieu, M. Establishment of human microglial cell lines after transfection of primary cultures of embryonic microglial cells with the SV40 large T antigen. Neuroscience Letters. 195 (2), 105-108 (1995).
  31. von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
  32. Prehaud, C., Lafon, M., Ceccaldi, P. E., Afonso, P., Lafaye, P. New in vitro Blood-Brain Barrier model. PCT. EP2015, 0706671(2014).
  33. Holbrook, M. R., Li, L., Suderman, M. T., Wang, H., Barrett, A. D. The French neurotropic vaccine strain of yellow fever virus accumulates mutations slowly during passage in cell culture. Virus Research. 69 (1), 31-39 (2000).
  34. da Costa, A., et al. Innovative in cellulo method as an alternative to in vivo neurovirulence test for the characterization and quality control of human live Yellow Fever virus vaccines: A pilot study. Biologicals. 53, 19-29 (2018).
  35. Nanobodies suitable for neuron regeneration therapy. Patent. , EP3191510A1 (2014).
  36. Li, T., et al. Selection of similar single domain antibodies from two immune VHH libraries obtained from two alpacas by using different selection methods. Immunology Letters. 188, 89-95 (2017).
  37. Schumacher, D., Helma, J., Schneider, A. F. L., Leonhardt, H., Hackenberger, C. P. R. Nanobodies: Chemical Functionalization Strategies and Intracellular Applications. Angewandte Chemie International Edition. 57 (9), 2314-2333 (2018).
  38. Prehaud, C., Megret, F., Lafage, M., Lafon, M. Virus infection switches TLR-3-positive human neurons to become strong producers of beta interferon. J Journal of Virology. 79 (20), 12893-12904 (2005).
  39. Siflinger-Birnboim, A., et al. Molecular sieving characteristics of the cultured endothelial monolayer. Journal of Cellular Physiology. 132 (1), 111-117 (1987).
  40. High Mast2-affinity polypeptides and uses thereof. Patent. , EP20110306454 (2011).
  41. Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 28 (2), 312-328 (2008).
  42. Beck, A. S., Wood, T. G., Widen, S. G., Thompson, J. K., Barrett, A. D. T. Analysis By Deep Sequencing of Discontinued Neurotropic Yellow Fever Vaccine Strains. Scientific Reports. 8 (1), 13408(2018).
  43. Staples, J. E., Monath, T. P. Yellow fever: 100 years of discovery. The Journal of the American Medical Association. 300 (8), 960-962 (2008).
  44. Wang, E., et al. Comparison of the genomes of the wild-type French viscerotropic strain of yellow fever virus with its vaccine derivative French neurotropic vaccine. Journal of General Virology. 76 (Pt 11), 2749-2755 (1995).
  45. Li, T., et al. Cell-penetrating anti-GFAP VHH and corresponding fluorescent fusion protein VHH-GFP spontaneously cross the blood-brain barrier and specifically recognize astrocytes: application to brain imaging. FASEB J. 26 (10), 3969-3979 (2012).
  46. Garcia-Mesa, Y., et al. Immortalization of primary microglia: a new platform to study HIV regulation in the central nervous system. Journal of NeuroVirology. 23 (1), 47-66 (2017).

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