方法文章

一种用于研究病原体或药物穿越血脑屏障及其与大脑相互作用的人源性血脑界面模型

DOI：

10.3791/59220

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2019年4月9日

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1Institut Pasteur, CNRS UMR 3569, Unité de Neuroimmunologie Virale, 2Institut Pasteur, Unité d’Epidémiologie et de Pathophysiologie des Virus Oncogènes, Université Sorbonne Paris Cité/Paris Diderot, 3Institut Pasteur, PFIA, DTPS

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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本文介绍了一种在细胞内构建血脑屏障-微型脑聚酯多孔膜培养插入系统的方法，用于评估生物分子或感染性物质穿过人血脑屏障的转运过程及其对邻近脑细胞的生理影响。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

针对神经系统药物在相关且可靠的细胞内血脑屏障（BBB）模型中进行早期筛选，以评估其穿透能力以及与屏障和脑实质的相互作用，目前仍是一项未被满足的需求。为填补这一空白，我们设计了一种二维细胞内模型——BBB-Minibrain，该模型将聚酯多孔膜培养小室构建的人源血脑屏障模型与由三种人源脑细胞（神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞）共培养形成的Minibrain相结合。利用BBB-Minibrain模型，我们能够检测一种神经保护候选药物（例如Neurovita）穿越血脑屏障的转运过程，确定该分子对神经元的特异性靶向性，并证明药物在穿越血脑屏障后仍保留其神经保护特性。我们还证实，BBB-Minibrain是一种有价值的模型，可用于检测病毒颗粒穿过内皮细胞屏障的过程，并监测神经侵袭性病毒颗粒对Minibrain的感染情况。BBB-Minibrain是一种可靠且易于操作的系统，适用于掌握细胞培养技术的研究人员，且能够预测药物处理或损伤后脑细胞的表型变化。此类细胞内检测模型的应用具有双重意义：一方面可在药物研发早期引入降低风险的步骤，另一方面有助于减少动物实验的使用。

引言

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大脑被一种非通透性结构与体循环隔离开来，该结构限制了脑实质与血液之间的物质交换，这种结构称为血脑屏障（BBB）。血脑屏障主要由脑内皮细胞构成，并与邻近脑实质中的星形胶质细胞、血管周围小胶质细胞以及神经元动态相互作用。血脑屏障的三大主要功能是为神经元活动建立并维持离子稳态、向大脑供应营养物质，以及防止有毒损伤或病原体入侵1,2，这些功能共同维持了大脑的稳态及其正常功能3。该屏障极为有效，仅有极少数药物能够穿越血脑屏障4,5。目前，预测某种分子是否能够通过血脑屏障并扩散至大脑的方法包括：利用尸体组织进行离体研究、通过磁共振成像（MRI）或正电子发射断层扫描（PET）对人脑志愿者进行体内示踪成像，或在动物中开展药效学与药代动力学的临床前研究6,7,8。这些技术与模型均存在一定局限性，例如PET分辨率有限、MRI灵敏度较低6,8，难以定量检测脑内穿透能力较差的....

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方案

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1. 培养 Ntera/CL2.D1 细胞以制备有丝分裂后人神经元与人星形胶质细胞的共培养体系（NT2-N/A）

注意：这是小脑（图1）的组成部分。

  1. NTera/Cl2.D1 细胞的培养
    1. 从液氮罐中取出一管冻存细胞，置于冰上保存。
    2. 在 37 °C 水浴中快速融化细胞。
    3. 将细胞转移至含有 10 mL 完全 DMEM F12 培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基：营养混合物 F-12 培养基）的 15 mL 离心管中，该培养基添加有 10% 胎牛血清（FBS）、2 mM 谷氨酰胺、100 IU 青霉素和 100 µg 链霉素（即完全 DMEM F12 培养基）。
    4. 在室温（RT）下以 200 ×g 离心 5 分钟。用 2 mL 完全 DMEM F12 培养基重悬细胞沉淀。
    5. 将细胞转移至含 13 mL 完全 DMEM F12 培养基的聚苯乙烯 T75 组织培养瓶中，该培养瓶经过特殊处理以适用于敏感贴壁细胞（T75Cell+）。
    6. 将细胞置于 37 °C、5% CO2 和 95% 湿度的培养箱中培养至约 90% 汇合度（约 5 天）。每 2–3 天更换一次培养基。

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结果

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BBB-Minibrain 是一种细胞内的血脑屏障界面实验模型。

BBB-Minibrain 建立在聚酯膜培养插件系统上，以模拟血脑屏障界面的上层为血液区、下层为脑组织区（图 2A、B）。该系统由管腔区和非管腔区组成：管腔区为滤膜上培养的 hCMEC/D3 内皮细胞，构成血脑屏障；非管腔区则包含 Minibrain 人源三联培养的脑细胞（神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞）。Minibrain 细胞表现出典型的三联混合细胞群表型（图 1，右下图），并表达每种细胞类型的特异性标志物，如 da Costa A. 等人，2018 年研究所示34。

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讨论

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本文中，我们展示了如何通过将血脑屏障（BBB）模型与混合脑皮层细胞（Minibrain）培养物整合到一个独立装置中，构建一种细胞内血脑界面——BBB-Minibrain。该系统具有生物学相关性，对于熟练掌握细胞培养技术的研究人员而言，操作简便且易于使用。

对于任何其他体外血脑屏障模型而言，只有严格控制屏障的紧密性，才能获得可靠的结果。应仔细检测小室的通透性，任何通透性不符合要求（即LY的表观通透系数PeLY高于1.2）的小室均应弃用。

应仔细检测FBS样品，以确定不会破坏血脑屏障（BBB）特性的批次。对于稀释病毒颗粒或生物分子的载体培养基，也应遵循同样的建议。此外，为避免改变管腔侧培养基的组成，建议尽可能减少生物分子或病毒悬液的体积。由Ntera/CL2.D1细胞系建立的人源共培养神经元/星形胶质细胞体系是一种经过验证的技术。与处于有丝分裂后状态的人类神经元不同，星形胶质细胞仍具有分裂能力，有时可观察到星形胶质细胞的高增殖活性。若出现此情况，则必须弃用该迷你脑（Minibrain）培养物。本实验室所使用的.......

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披露

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该系统的知识产权为参考文献32、35和38中引用的专利。

致谢

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本研究获得了巴斯德研究所内部资助，包括一项激励性资助（PTR 435），以及赛诺菲巴斯德公司向巴斯德研究所提供的“研究支持合同”资助。A. da Costa 获得了赛诺菲-巴斯德资助，Florian Bakoa 获得了法国国家研究与技术协会（ANRT）提供的博士研究生资助。我们感谢Pierre-Olivier Couraud教授和Florence Miller博士提供的有益讨论。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
12孔板Corning3336
5-氟-2’脱氧尿苷默克-西格玛奥德里奇F0503
85毫米培养皿Sarstedt83-3902-500
抗-Nf200默克-西格玛奥德里奇N4142
β-巯基乙醇默克-西格玛奥德里奇M3148
CHME/Cl5单位é 病毒神经免疫学应拉丰博士的要求
羧甲基纤维素钠Calbiochem217274
胞嘧啶 β-D-阿拉伯呋喃糖苷默克-西格玛奥德里奇C1768
黑色96孔板Corning3915
DMEM/F12赛默飞世尔科技31330-038
DMSO默克-西格玛奥德里奇D2650
Endogro IVMilliporeSCME004内皮细胞培养基
乙醇Carlo Erba529121
FBSHycloneSV30015-04
甲醛默克-西格玛奥德里奇252549
吉姆萨RAL 诊断320310
山羊抗小鼠杰克逊免疫研究公司115-545-003
Goat-抗兔赛默飞世尔科技R37117
含 Ca2+-Mg2+ 的 HBSS赛默飞世尔科技14025-100
hCMEC/D3CedarlaneCLU512
Hepes 1M赛默飞世尔科技15630-070
Hoescht 33342默克-西格玛奥德里奇33263
Laminine默克-西格玛奥德里奇L6274
L-谷氨酰胺赛默飞世尔科技25030-024
Lucifer Yellow默克-西格玛奥德里奇L0259
MEM 10X赛默飞世尔科技21430
MEM 1X赛默飞世尔科技42360
Ntera/Cl2D.1ATCCCRL-1973
多聚甲醛电子显微镜科学公司15714
不含 Ca²⁺-Mg²⁺ 的 PBS赛默飞世尔科技14190
PBS-Ca²⁺-Mg²⁺赛默飞世尔科技14040-091
青霉素/链霉素EurobioCXXPES00-07
聚-D-赖氨酸默克-西格玛奥德里奇P1149
Prolong Gold赛默飞世尔科技P36930
QiashredderQIAGEN79656
大鼠 I 型胶原蛋白Cultrex3443-100-01
全反式维甲酸默克-西格玛奥德里奇R2625
RNA纯化试剂盒QIAGEN74104
SDS默克-西格玛奥德里奇L4509
碳酸氢钠 5.6%EurobioCXXBIC00-07
丙酮酸钠赛默飞世尔科技11360
T75 细胞培养瓶Sarstedt83-1813-302用于敏感贴壁细胞的经特殊表面处理组织培养聚苯乙烯培养瓶（Cell+）
Transwell康宁3460聚酯多孔膜培养小室
胰蛋白酶-EDTA默克-西格玛奥德里奇T3924
超纯水赛默飞世尔科技10977-035
尿苷默克-西格玛奥德里奇U3750
Versene赛默飞世尔科技15040-033EDTA
YFV-FNVIP 达喀尔疫苗瓶

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  2. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.

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重印与许可

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标签

Neurovita

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