一种用于研究病原体或药物穿越血脑屏障及其与大脑相互作用的人源性血脑界面模型

摘要

本文介绍了一种在细胞内构建血脑屏障-微型脑聚酯多孔膜培养插入系统的方法，用于评估生物分子或感染性物质穿过人血脑屏障的转运过程及其对邻近脑细胞的生理影响。

摘要

针对神经系统药物在相关且可靠的细胞内血脑屏障（BBB）模型中进行早期筛选，以评估其穿透能力以及与屏障和脑实质的相互作用，目前仍是一项未被满足的需求。为填补这一空白，我们设计了一种二维细胞内模型——BBB-Minibrain，该模型将聚酯多孔膜培养小室构建的人源血脑屏障模型与由三种人源脑细胞（神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞）共培养形成的Minibrain相结合。利用BBB-Minibrain模型，我们能够检测一种神经保护候选药物（例如Neurovita）穿越血脑屏障的转运过程，确定该分子对神经元的特异性靶向性，并证明药物在穿越血脑屏障后仍保留其神经保护特性。我们还证实，BBB-Minibrain是一种有价值的模型，可用于检测病毒颗粒穿过内皮细胞屏障的过程，并监测神经侵袭性病毒颗粒对Minibrain的感染情况。BBB-Minibrain是一种可靠且易于操作的系统，适用于掌握细胞培养技术的研究人员，且能够预测药物处理或损伤后脑细胞的表型变化。此类细胞内检测模型的应用具有双重意义：一方面可在药物研发早期引入降低风险的步骤，另一方面有助于减少动物实验的使用。

引言

大脑被一种非通透性结构与体循环隔离开来，该结构限制了脑实质与血液之间的物质交换，这种结构称为血脑屏障（BBB）。血脑屏障主要由脑内皮细胞构成，并与邻近脑实质中的星形胶质细胞、血管周围小胶质细胞以及神经元动态相互作用。血脑屏障的三大主要功能是为神经元活动建立并维持离子稳态、向大脑供应营养物质，以及防止有毒损伤或病原体入侵^1,2，这些功能共同维持了大脑的稳态及其正常功能³。该屏障极为有效，仅有极少数药物能够穿越血脑屏障^4,5。目前，预测某种分子是否能够通过血脑屏障并扩散至大脑的方法包括：利用尸体组织进行离体研究、通过磁共振成像（MRI）或正电子发射断层扫描（PET）对人脑志愿者进行体内示踪成像，或在动物中开展药效学与药代动力学的临床前研究^6,7,8。这些技术与模型均存在一定局限性，例如PET分辨率有限、MRI灵敏度较低^6,8，难以定量检测脑内穿透能力较差的....

方案

1. 培养 Ntera/CL2.D1 细胞以制备有丝分裂后人神经元与人星形胶质细胞的共培养体系（NT2-N/A）

注意：这是小脑（图1）的组成部分。

1. NTera/Cl2.D1 细胞的培养
   1. 从液氮罐中取出一管冻存细胞，置于冰上保存。
   2. 在 37 °C 水浴中快速融化细胞。
   3. 将细胞转移至含有 10 mL 完全 DMEM F12 培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基：营养混合物 F-12 培养基）的 15 mL 离心管中，该培养基添加有 10% 胎牛血清（FBS）、2 mM 谷氨酰胺、100 IU 青霉素和 100 µg 链霉素（即完全 DMEM F12 培养基）。
   4. 在室温（RT）下以 200 ×g 离心 5 分钟。用 2 mL 完全 DMEM F12 培养基重悬细胞沉淀。
   5. 将细胞转移至含 13 mL 完全 DMEM F12 培养基的聚苯乙烯 T75 组织培养瓶中，该培养瓶经过特殊处理以适用于敏感贴壁细胞（T75Cell⁺）。
   6. 将细胞置于 37 °C、5% CO₂ 和 95% 湿度的培养箱中培养至约 90% 汇合度（约 5 天）。每 2–3 天更换一次培养基。

结果

BBB-Minibrain 是一种细胞内的血脑屏障界面实验模型。

BBB-Minibrain 建立在聚酯膜培养插件系统上，以模拟血脑屏障界面的上层为血液区、下层为脑组织区（图 2A、B）。该系统由管腔区和非管腔区组成：管腔区为滤膜上培养的 hCMEC/D3 内皮细胞，构成血脑屏障；非管腔区则包含 Minibrain 人源三联培养的脑细胞（神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞）。Minibrain 细胞表现出典型的三联混合细胞群表型（图 1，右下图），并表达每种细胞类型的特异性标志物，如 da Costa A. 等人，2018 年研究所示³⁴。

讨论

本文中，我们展示了如何通过将血脑屏障（BBB）模型与混合脑皮层细胞（Minibrain）培养物整合到一个独立装置中，构建一种细胞内血脑界面——BBB-Minibrain。该系统具有生物学相关性，对于熟练掌握细胞培养技术的研究人员而言，操作简便且易于使用。

对于任何其他体外血脑屏障模型而言，只有严格控制屏障的紧密性，才能获得可靠的结果。应仔细检测小室的通透性，任何通透性不符合要求（即LY的表观通透系数Pe_LY高于1.2）的小室均应弃用。

应仔细检测FBS样品，以确定不会破坏血脑屏障（BBB）特性的批次。对于稀释病毒颗粒或生物分子的载体培养基，也应遵循同样的建议。此外，为避免改变管腔侧培养基的组成，建议尽可能减少生物分子或病毒悬液的体积。由Ntera/CL2.D1细胞系建立的人源共培养神经元/星形胶质细胞体系是一种经过验证的技术。与处于有丝分裂后状态的人类神经元不同，星形胶质细胞仍具有分裂能力，有时可观察到星形胶质细胞的高增殖活性。若出现此情况，则必须弃用该迷你脑（Minibrain）培养物。本实验室所使用的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
12孔板	Corning	3336
5-氟-2’脱氧尿苷	默克-西格玛奥德里奇	F0503
85毫米培养皿	Sarstedt	83-3902-500
抗-Nf200	默克-西格玛奥德里奇	N4142
β-巯基乙醇	默克-西格玛奥德里奇	M3148
CHME/Cl5	单位é 病毒神经免疫学	应拉丰博士的要求
羧甲基纤维素钠	Calbiochem	217274
胞嘧啶 β-D-阿拉伯呋喃糖苷	默克-西格玛奥德里奇	C1768
黑色96孔板	Corning	3915
DMEM/F12	赛默飞世尔科技	31330-038
DMSO	默克-西格玛奥德里奇	D2650
Endogro IV	Millipore	SCME004	内皮细胞培养基
乙醇	Carlo Erba	529121
FBS	Hyclone	SV30015-04
甲醛	默克-西格玛奥德里奇	252549
吉姆萨	RAL 诊断	320310
山羊抗小鼠	杰克逊免疫研究公司	115-545-003
Goat-抗兔	赛默飞世尔科技	R37117
含 Ca2+-Mg2+ 的 HBSS	赛默飞世尔科技	14025-100
hCMEC/D3	Cedarlane	CLU512
Hepes 1M	赛默飞世尔科技	15630-070
Hoescht 33342	默克-西格玛奥德里奇	33263
Laminine	默克-西格玛奥德里奇	L6274
L-谷氨酰胺	赛默飞世尔科技	25030-024
Lucifer Yellow	默克-西格玛奥德里奇	L0259
MEM 10X	赛默飞世尔科技	21430
MEM 1X	赛默飞世尔科技	42360
Ntera/Cl2D.1	ATCC	CRL-1973
多聚甲醛	电子显微镜科学公司	15714
不含 Ca²⁺-Mg²⁺ 的 PBS	赛默飞世尔科技	14190
PBS-Ca²⁺-Mg²⁺	赛默飞世尔科技	14040-091
青霉素/链霉素	Eurobio	CXXPES00-07
聚-D-赖氨酸	默克-西格玛奥德里奇	P1149
Prolong Gold	赛默飞世尔科技	P36930
Qiashredder	QIAGEN	79656
大鼠 I 型胶原蛋白	Cultrex	3443-100-01
全反式维甲酸	默克-西格玛奥德里奇	R2625
RNA纯化试剂盒	QIAGEN	74104
SDS	默克-西格玛奥德里奇	L4509
碳酸氢钠 5.6%	Eurobio	CXXBIC00-07
丙酮酸钠	赛默飞世尔科技	11360
T75 细胞培养瓶	Sarstedt	83-1813-302	用于敏感贴壁细胞的经特殊表面处理组织培养聚苯乙烯培养瓶（Cell+）
Transwell	康宁	3460	聚酯多孔膜培养小室
胰蛋白酶-EDTA	默克-西格玛奥德里奇	T3924
超纯水	赛默飞世尔科技	10977-035
尿苷	默克-西格玛奥德里奇	U3750
Versene	赛默飞世尔科技	15040-033	EDTA
YFV-FNV	IP 达喀尔	疫苗瓶