本文介绍了一种用于神经元和胶质细胞中钙离子（Ca2+）成像的实验方案，可实现亚细胞水平上Ca2+信号的解析。该方法适用于所有能够表达基因编码Ca2+指示剂的细胞类型。
本文内容
摘要
摘要
钙离子（Ca2+) 是一种普遍存在的细胞内信使分子，可激活多条信号通路，从而产生多种生物学效应。两个 Ca2+ 信号源—“Ca2+ 细胞外的“内流”和“Ca2+ 从内质网（ER）这一细胞内Ca2+储存库中释放——被认为是介导Ca2+多种时空动态模式的基础2+ 导致细胞多种生物学功能的信号。本实验方案的目的是描述一种新的 Ca2+ 成像方法，可实现对“Ca瞬间的监测2+ 内流”和“Ca2+ 释放”。OER-GCaMP6f 是一种基因编码的 Ca2+ 指示剂（GECI），包含靶向内质网外膜的GCaMP6f。OER-GCaMP6f可用于监测Ca2+ 比传统的GCaMP6f具有更高的时间分辨率。结合靶向细胞膜的GECIs，可实现对钙信号的时空动态检测2+ 信号模式可在亚细胞分辨率下进行描述。亚细胞定位的 Ca2+ 此处描述的指示剂原则上适用于所有细胞类型，甚至适用于活体成像 秀丽隐杆线虫 神经元。在本方案中，我们介绍 Ca2+ 在细胞系、原代分离培养的神经元和胶质细胞中进行成像，并描述大鼠皮层神经元冻存储备的制备方法。
引言
Ca2+ 信号代表细胞内 Ca2+ 浓度的升高。Ca2+ 是真核细胞中普遍存在的第二信使。细胞通过多种细胞内信号通路利用 Ca2+ 实现功能，并引发多样的生物学效应。例如，在神经元中，突触前末梢的突触囊泡释放、细胞核内的基因表达以及突触后部位突触可塑性的诱导，均由不同的 Ca2+ 信号所调控；这些信号能够在正确的位置和精确的时间点，特异性地激活相应的下游酶1。
特定的时空钙信号模式2+ 信号激活特定的下游酶。Ca2+ 信号由两种不同的Ca协调产生2+ 来源：Ca2+ 来自细胞外空间的内流和Ca2+ 内质网（ER）的释放，内质网作为细胞内钙库2+ 储存。有意义的时空Ca2+ 由10–100 µM Ca²⁺纳米结构域支持的信号模式也可诱导特定的细胞功能2+ 在Ca附近产生2+ 质膜或内质网膜上的通道2重要的是，Ca²⁺的来源2+ 信号是决定下游生物学效应的最关键因素之一。在神经元中，Ca2+ 内流和Ca2+ 释放对γ-氨基丁酸（GABA）的聚集具有相反的作用A 受体（GABAAR）位于GABA能突触，负责抑制神经元兴奋性3钙2+ 伴随大规模神经元兴奋的内流导致突触GABA的弥散AR簇，而持续的Ca2+ 内质网释放促进突触GABA的聚集ARs。其他研究团队也报道过，生长锥的转向方向在很大程度上依赖于Ca²⁺的来源。2+ 信号：Ca2+ 内流诱导排斥，而Ca2+ 释放因子引导神经元生长锥的趋化性4因此，为了充分理解Ca2+ 信号通路介导特定细胞反应的机制，识别Ca²⁺的来源至关重要2+ 通过描述Ca信号2+ 亚细胞分辨率下的信号。
在本实验方案中，我们描述了一种钙离子（Ca2+）成像方法，可用于在亚细胞分辨率下记录Ca2+信号，从而推断Ca2+信号的来源（图1）。通过将Src激酶中的质膜定位信号Lck连接至基因编码的Ca2+指示剂（GECIs）的N端，可实现对质膜下方局部Ca2+微区的高效监测5。为了以更高的空间和时间分辨率检测内质网（ER）附近区域的Ca2+信号模式，我们近期开发了OER-GCaMP6f，该指示剂利用内质网跨膜蛋白将GCaMP6f6靶向定位于内质网外膜。在COS-7细胞7和HEK293细胞8中，OER-GCaMP6f能够比传统的非靶向型GCaMP6f更灵敏地报告内质网Ca2+释放，其优势在于避免了Ca2+和GECIs的扩散。我们还证实，OER-GCaMP6f在培养的海马星形胶质细胞中记录到的自发性Ca2+升高事件，其时空动态模式与质膜靶向型GCaMP6f（Lck-GCaMP6f）所监测到的模式存在差异7,9，表明结合使用OER-GCaMP6f与Lck-GCaMP6f进行Ca2+成像，有助于在亚细胞分辨率下解析Ca2+信号并识别其来源。
目前，我们详细描述了在玻璃盖玻片上培养的HeLa细胞以及神经元-星形胶质细胞共培养体系中进行Ca2+信号解析的实验方案。此处所介绍的基于基因编码钙离子指示剂（GECIs）的Ca2+成像技术，包括Lck-GCaMP6f、靶向细胞膜的RCaMP210（Lck-RCaMP2）和OER-GCaMP6f（图1），适用于所有能够表达这些GECIs的细胞类型。
方案
本研究所述的所有实验均根据日本文部科学省发布的指南，经理化学研究所安全委员会和动物实验委员会批准。
1. 细胞准备
- 聚乙烯亚胺包被盖玻片的制备
注意： 推荐使用聚乙烯亚胺（PEI）包被玻璃器皿，因其可使神经元和星形胶质细胞紧密贴附于盖玻片上，同时不影响其发育。然而，如有需要，也可选用其他包被方法（如多聚鸟氨酸、聚-L-赖氨酸、层粘连蛋白包被）用于玻璃底培养皿。- 在12孔板的每个孔中放入一个直径为18 mm的玻璃盖玻片。使用无菌水配制0.04% PEI溶液（每12孔板需12.5 mL）。
- 向每个孔中加入1 mL 0.04% PEI溶液。确保盖玻片下方无气泡。
- 将培养板置于 CO₂ 培养箱中孵育2 37 °C 培养箱中过夜培养。
- 第二天，用1 mL无菌水将包被的盖玻片清洗3次。用抽吸装置移除PEI溶液，每孔加入1 mL无菌水，轻轻振荡12孔板，使盖玻片与孔板之间的PEI溶液充分洗出。由于残留的PEI对细胞具有毒性，务必在最后一次清洗后将无菌水完全抽吸干净。
- 在生物安全柜中用紫外线（UV）照射盖玻片至少15分钟以进行干燥和灭菌。PEI包被的培养皿可在4 °C保存长达2个月。使用前需用紫外线照射培养皿15分钟。
- 在孔与孔之间的区域加入5 mL无菌蒸馏水，以防止培养基蒸发。
- 细胞系接种
注意： 本方案仅以哺乳动物细胞系（如HeLa细胞和COS-7细胞）的转染为例。用户可根据实验需求选择其他优化的转染方案。本节将描述HeLa细胞的培养方案，该方案同样适用于COS-7细胞。- 转染前一天，将细胞接种于10 cm培养皿中，培养至细胞融合度达到70%–90%。
- 预热培养基（参见 材料表) 升温至 37 °C。
- 用不含 Ca 的磷酸盐缓冲液洗涤细胞 2 次2+ 和 Mg2+ (PBS [-])
- 吸除 PBS(-)，加入 1 mL 0.5% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液，于 37 °C 培养 90 秒，直至细胞呈圆形。
- 加入9 mL预热的培养基以终止消化。用培养基按1:6的比例稀释细胞。
- 在12孔板的PEI包被盖玻片上接种1 mL稀释后的细胞。
- 大鼠或小鼠海马神经元-星形胶质细胞混合培养的制备
注意： 第1.3和1.4节必须首先经过机构动物护理与使用委员会审查和批准，并须遵循官方批准的实验动物护理与使用规程。神经元培养方案的流程图如下所示： 图2.- 在超净工作台中配制所有试剂。将杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）加入两个置于冰盒中的100 mm培养皿中（每皿约20 mL）。
- 配制 50 mL 解剖液，由 DMEM 和 20 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸 (HEPES) 组成（参见 材料清单）并将培养基分装至三个60 mm培养皿（约7 mL/皿）和八个35 mm培养皿（约2 mL/皿）中。将培养皿放入另一个冰盒中。
- 配制 50 mL 孵育用盐溶液，由添加 20 mM HEPES 的 Hanks 平衡盐溶液组成（参见 材料清单），并将8 mL生理盐水置于预冷的15 mL锥形管中，放在冰上。
- 使用添加了B-27、谷氨酰胺和青霉素-链霉素的最低必需培养基（MEM）配制铺板培养基（参见 材料表）。将该培养基置于室温（20–28 °C）保存。
- 使用70%乙醇对手术器械进行灭菌。
- 在带盖的玻璃罐中放入一张纸巾和1 mL异氟烷，静置使异氟烷挥发1分钟。
- 将一只怀孕的大鼠或小鼠放入按步骤1.3.6准备好的容器中，使动物在容器内持续暴露，直至深度麻醉（约30秒至1分钟）。
- 将麻醉后的动物从容器中取出，并用70%乙醇喷洒动物体表及解剖器械进行消毒。使用标准解剖剪和镊子沿腹中线剪开，取出妊娠大鼠或小鼠的子宫。
- 从麻醉的雌性大鼠或小鼠子宫中取出 E18–19 胚胎，使用精细解剖剪，并用环形镊子将取出的胚胎放入盛有冰冻 DMEM 的 10 cm 培养皿中，进行低温麻醉。
- 用精细的解剖剪将胚胎头部切断，并将头置于盛有冰冻DMEM的10 cm培养皿中。
- 使用13 cm弯曲的Semken镊子和尖端精细的镊子从每只胚胎中取出脑组织，并将脑组织置于盛有冰上预冷的解剖培养基的60 mm培养皿中。
- 使用精细尖头镊子在35 mm培养皿的冰上解剖液中取出海马体，并将分离的组织置于盛有孵育盐溶液的15 mL锥形管中，冰上保存。
- 用孵育盐溶液洗涤海马体，并在37 °C下用含胰蛋白酶（1.25 mg/mL）和DNase I（0.25 mg/mL）的孵育盐溶液孵育5分钟。推荐孵育体积为2.7 mL孵育盐溶液、150 µL 20x储存浓度胰蛋白酶和150 µL 20x储存浓度DNase（参见 材料表).
- 用预冷的孵育盐溶液将海马组织清洗3次。
- 吸弃孵育用生理盐水，加入含有DNase I的铺板培养基1 mL（10 µL贮存液；参见 材料表用移液器吹打不超过20次以重悬组织，使用细胞计数仪和台盼蓝染色法测定活细胞密度。
- 将海马细胞稀释至密度为 1.4 x 105 每毫升大鼠活细胞数为 2.5 × 105 每毫升含活细胞数用于小鼠。将1 mL稀释后的细胞悬液接种至12孔板中经PEI包被的盖玻片上。
- 将细胞置于37 °C的CO2培养箱中培养2–3天。
- 移除培养基，切勿让细胞干燥。轻柔且迅速地加入预热的维持培养基（参见 材料表).
- 大鼠皮层神经元-星形胶质细胞混合培养物的制备、冻存及冻存细胞的复苏
注意： 一种皮层细胞的冷冻保存方法此前已有描述11。本文提供了一种改良方案，可将皮层细胞在 -80 °C 条件下保存至少 3 个月。该方案的流程图如下所示 图2.- 配制步骤1.3.1–1.3.4中所述的DMEM、解剖液、孵育盐溶液和铺板培养基，以及 材料表.
- 准备洗涤培养基，其成分为DMEM、热灭活胎牛血清和青霉素-链霉素（参见 材料表如有必要。
- 从麻醉的雌性大鼠或小鼠子宫中取出 E18–19 胚胎，使用精细解剖剪，并用环形镊子将每只取出的胚胎放入冰冻的 DMEM 中进行低温麻醉。
- 将胚胎的脑组织取出，置于冰上预冷的解剖液中。剥离大脑皮层，并将其置于盛有孵育盐溶液的15 mL离心管中，冰上保存。
- 用孵育盐水洗涤皮层组织，然后将皮层组织置于含有胰蛋白酶（1.25 mg/mL）和DNase I（0.25 mg/mL）的孵育盐水中，于37 °C孵育5分钟。推荐每12个皮层组织使用5.4 mL孵育盐水、300 µL 20倍浓缩胰蛋白酶原液和300 µL 20倍浓缩DNase I原液。
- 用冰浴的孵育用生理盐水洗涤皮层组织3次。
- 吸除上清液，加入2 mL含有150 µL DNase I储备液的铺板培养基。用移液器吹打不超过20次以解离细胞，然后使用孔径为70 µm的细胞筛过滤细胞。
- 用20 mL铺板培养基冲洗细胞滤网，用于铺板。对于冻存细胞库的制备，用20 mL洗涤培养基洗涤细胞（参见 材料表)
- 使用细胞计数器和台盼蓝染色法测定活细胞密度。
- 将皮层细胞稀释至密度为 1.4 x 105 以铺板培养基将细胞稀释至适宜浓度，每毫升含活细胞数符合实验要求，并将1 mL稀释后的细胞悬液加入12孔板中经PEI包被的盖玻片上。
- 在37 °C、CO₂培养箱中培养细胞2 在培养箱中孵育2–3天，然后将培养基更换为维持培养基。
- 在步骤1.4.9之后，通过在187 x g条件下离心细胞来制备冷冻皮层细胞储备液 g 使用摆动转子离心3分钟。
- 吸弃上清液，加入冻存培养基（参见 材料表) 置于 4 °C 保存，以获得 1 x 10 的细胞密度7 细胞/mL。将1 mL细胞悬液分装至冻存管中。
- 将试管放入细胞冻存盒中，以-1 °C/min的速率降温至-80 °C，随后将冻存盒转移至-80 °C超低温冰箱中。细胞可在-80 °C条件下保存至少3个月。
- 复苏冻存细胞时，预先将洗涤培养基（每支冻存管约13 mL）和冻存皮层细胞维持培养基预热（参见 材料清单).
- 将冻存的细胞在37 °C水浴中快速解冻。
- 轻轻将解冻的细胞用预热的洗涤培养基稀释。在187 x g 使用摆动转子离心3分钟。
- 将沉淀重悬于1 mL洗涤液中，并测定活细胞密度。
- 用冻存皮层细胞的维持培养基稀释细胞，使细胞密度达到 3.0 x 105 活细胞数/mL，并将1 mL细胞悬液接种至PEI包被的12孔板中。
2. 膜靶向GECI的表达
- 细胞转染
- 每孔加入250 ng的GECI质粒（例如Lck-GCaMP6f、Lck-RCaMP2或OER-GCaMP6f，带有CMV启动子）7,8,9 至100 µL低血清培养基中（见材料表）。若共转染Lck-RCaMP2和OER-GCaMP6f，则每孔在100 µL低血清培养基中加入各250 ng的两种质粒。
- 每孔向质粒-低血清培养基混合物中加入0.5 µL转染试剂（见材料表）。共转染Lck-RCaMP2和OER-GCaMP6f时，每孔同样加入0.5 µL转染试剂。
- 将混合物在室温（20–28 °C）下孵育30分钟。
- 以逐滴方式将100 µL混合物加至每个盖玻片上。
- 将细胞在37 °C、CO2培养箱中孵育48–72小时，以实现GECI的表达。
- 海马体或皮层神经元的转染与腺相关病毒（AAV）感染
注意：体外培养3–5天（DIV）进行转染可获得较高的神经元转染率。星形胶质细胞中GECI的最佳表达则推荐在6–8 DIV时进行转染。对于体外培养超过9 DIV的分离神经元，使用腺相关病毒（AAV）载体感染可实现更优的GECI表达效果。在EF1a启动子驱动下表达Lck-GCaMP6f、Lck-RCaMP2和OER-GCaMP6f的AAV载体，已如先前所述使用HEK293细胞制备12（见材料表）。- 若在铺板后3–8天进行转染，请标记两个离心管，分别用于盛放质粒DNA和转染试剂。
- 每管中加入50 µL低血清培养基（见材料表）。
- 在质粒DNA管中，每盖玻片加入0.5 µg质粒DNA，每孔加入1 µL神经元专用转染试剂配套添加剂（见材料表）。若共转染Lck-RCaMP2和OER-GCaMP6f，则每孔在50 µL低血清培养基中混合各0.5 µg质粒及1 µL添加剂。
- 在转染试剂管中，每孔加入1 µL转染试剂（见材料表）。共转染时使用相同量的转染试剂。
- 将两个管涡旋振荡1–2秒。
- 将转染试剂混合物（来自步骤2.2.4）加入DNA混合物（来自步骤2.2.3）中，轻轻吹打混匀，并将混合物（每盖玻片100 µL）在室温下孵育5分钟。
- 以逐滴方式将此混合物加入细胞中。
- 将细胞置于CO2培养箱中孵育2–3天，直至标记蛋白表达。
- 进行AAV感染时，每孔向神经元-星形胶质细胞混合培养物中加入3 µL AAV。通过轻轻摇动培养皿使液体混合均匀。若同时感染Lck-RCaMP2和OER-GCaMP6f，则每孔分别加入3 µL两种AAV。若表达GECI的细胞数量不足，应确定最佳AAV感染用量。
- 继续培养1–2周，直至GECI充分表达。
3. Ca2+ 成像
- 同时成像表达 Lck-RCaMP2 和 OER-GCaMP6f 的细胞
注意：为了同时记录 Lck-RCaMP2 和 OER-GCaMP6f 信号，需要使用图像分光光学器件。该光学器件可将 RCaMP2 和 GCaMP6f 的发射光分离，并投射到相机的同一成像画面上（图 3A）。同时成像还需要满足以下条件：(1) 光源能够同时发射蓝光（450–490 nm）和绿光（500–560 nm）范围的激发光；(2) 显微镜配备双通滤光片和二向色镜组；(3) 配备用于 RCaMP2 和 GCaMP6f 的发射滤光片。具体细节请参见材料表。- 在开始记录前至少 30 分钟开启成像设备和计算机。将显微镜加热腔预热至 37 °C。安装图像分光装置、滤光片和光源。调整图像分光光学系统，使同一视野出现在相机画面上。选择合适的物镜（见材料表）。
- 将含有转染了 Lck-RCaMP2 和 OER-GCaMP6f 的细胞的盖玻片安装至记录腔室中，在腔室内加入适量成像介质或缓冲液（18 mm 盖玻片加 400 µL），然后将其放置于显微镜载物台上。盖上腔室盖以防止介质蒸发。
- 通过荧光成像定位同时表达 Lck-RCaMP2 和 OER-GCaMP6f 的细胞。尽量降低激发光强度，以避免光漂白和光毒性。
- 移去盖子，以 10 Hz 开始时间序列记录。在记录过程中向腔室中加入激动剂以诱发 Ca2+ 反应（例如，HeLa 细胞使用组胺，COS-7 细胞使用 ATP）。
- 将时间序列数据保存至硬盘驱动器（HDD）。
- 使用图像分析软件对数据进行分析。
- 记录表达 Lck-RCaMP2 和 OER-GCaMP6f 的星形胶质细胞的自发活动
注意：若无图像分光光学器件，仍可在同一细胞中分别监测细胞膜和内质网周围的 Ca2+ 信号。此处描述的是在同一星形胶质细胞中依次记录 Lck-RCaMP2 和 OER-GCaMP6f 信号的方法。建议使用数值孔径大于 1.3 的油浸物镜以检测自发性 Ca2+ 活动。- 在记录前至少 30 分钟开启显微镜、相机、光源及显微镜加热腔。
- 将含有转染了 Lck-RCaMP2 和 OER-GCaMP6f 的细胞的盖玻片安装至记录腔室，并加入 400 µL 成像介质。在腔室上方加盖盖子。
- 选择适用于 GCaMP6f 的滤光片组和光源（蓝光激发，例如 470–490 nm；见材料表），定位表达 OER-GCaMP6f 的星形胶质细胞。
- 选择适用于 RCaMP2 的滤光片组和光源（绿光激发，例如 510–560 nm；见材料表），确认同一星形胶质细胞是否表达 Lck-RCaMP2。避免长时间暴露于光源下，以防光漂白。
- 以 2 Hz 采集 Lck-RCaMP2 的时间序列图像，持续 2 分钟。将成像数据保存至硬盘驱动器（HDD）。
- 更换为适用于 GCaMP6f 的滤光片组，在相同视野下以 2 Hz 采集 OER-GCaMP6f 的时间序列图像，持续 2 分钟。将数据保存至硬盘驱动器（HDD）。
- 使用图像分析软件对数据进行分析。
- 记录神经元的自发活动及诱导性 Ca2+ 升高
注意：用于神经元成像的显微镜设置与第 3.2 节所述相同。此处描述的是由 Lck-GCaMP6f 检测的自发性 Ca2+ 升高，以及由 OER-GCaMP6f 检测的因 mGluR 激活而诱导的 Ca2+ 升高。- 为记录神经元的自发活动，将表达 Lck-GCaMP6f 的细胞所在的盖玻片安装至记录腔室，并加入 400 µL 成像介质。在腔室上方加盖盖子。
- 将滤光片和光源设置为适用于 GCaMP6f 的条件（蓝光激发，例如 470–490 nm；见材料表），寻找表达 Lck-GCaMP6f 并呈现自发活动的神经元。
- 以 2 Hz 或更快的速度采集图像。将数据保存至硬盘驱动器（HDD）。
- 使用图像分析软件对数据进行分析。
- 为记录诱导性 Ca2+ 升高，将表达 OER-GCaMP6f 的细胞所在的盖玻片安装至记录腔室，并加入 400 µL 成像介质。在腔室上方加盖盖子。
- 使用适用于 GCaMP6f 的滤光片组，定位表达 OER-GCaMP6f 的神经元。
- 移去盖子，以 2 Hz 或更快的速度开始时间序列记录。在记录过程中加入 Gq 蛋白偶联受体的激动剂（例如 mGluR5 激动剂 [RS]-3,5-二羟基苯甘氨酸 [DHPG]），以诱发内质网中的 Ca2+ 释放。
- 将时间序列图像保存至硬盘驱动器（HDD），并对数据进行分析。
结果
Lck-RCaMP2 和 OER-GCaMP6f 在转染后 24 小时于 HeLa 细胞中表达，并使用图像分光光学系统同时记录两种信号图 3A 和 视频 1）。图像以10 Hz的频率采集。组胺（His, 1 µM)，这会诱导 Ca2+ 从内质网释放的物质在记录期间加入。加入His后，Lck-RCaMP2和OER-GCaMP6f的信号强度增加，伪彩色图显示了ΔF/F0的变化，即相对于初始荧光强度的变化值图3B）。Ca²⁺ 的时间过程2+ 由 Lck-RCaMP2 和 OER-GCaMP6f 报告的同一兴趣区域（ROI）内的荧光强度变化（ΔF/F0）进行了比较图3C）。为了比较两种表达水平和分布不同的GECI，将ΔF/F0值归一化为其峰值。两种传感器均报告了类似振荡的Ca2+ 升高。Lck-RCaMP2 与 OER-GCaMP6f 的钙信号时间过程一致2+ 在所检测的五种细胞类型中，有两种细胞出现升高图3C，ROI 1 和 3）。然而，Ca2+ Lck-RCaMP2 显示的钙离子水平较 OER-GCaMP6f 保持在更高水平图3C，ROI 2、4 和 5）。结果表明，Ca2+ 细胞膜附近的钙离子浓度升高持续时间较长，而在内质网（ER）周围则较早终止，因为内质网是该钙离子的来源2+ 由His刺激诱导的信号
通过 Lck-RCaMP2 和 OER-GCaMP6f 可观察到大鼠海马（图 4A）和皮层（图 4B）神经元-星形胶质细胞共培养体系中星形胶质细胞的自发性 Ca2+ 信号（图 4、视频 2、视频 3、视频 4 和 视频 5）。皮层培养物由本实验方案所述方法制备的冻存细胞复苏而来。对同一细胞依次以 2 Hz 频率记录 Lck-RCaMP2 和 OER-GCaMP6f 信号。在每种 GECI 显示 Ca2+ 升高的区域选择三个 ROI，分析 ΔF/Fbase（即荧光强度）随时间的变化，其中 Fbase 为整个记录期间的平均荧光强度。当基础荧光稳定且 Ca2+ 升高事件较少时，Fbase 可作为检测 Ca2+ 升高事件的有效基线。自发性 Ca2+ 升高仅出现在星形胶质细胞的突起中，而不在胞体中出现。该结果与先前使用其他 GECI 在体外13 和体内14 观察到的星形胶质细胞自发性 Ca2+ 信号报道一致。在海马和皮层星形胶质细胞中，Lck-RCaMP2（上图）显示的 Ca2+ 升高事件频率均高于 OER-GCaMP6f。该结果与我们先前的研究一致，即使用 Lck-GCaMP6f 检测到的星形胶质细胞 Ca2+ 升高事件比 OER-GCaMP6f 更频繁7，并提示这一现象在单细胞水平同样适用。
在未成熟的大鼠海马神经元（10 DIV）中，通过 Lck-GCaMP6f 观察到自发的 Ca2+ 升高，频率为 2 Hz（图 5A 和 视频 6）。五个不同 ROI 的 ΔF/F0 时间过程表明，这些 Ca2+ 升高局限于亚细胞区域。 图 5B（视频 7）显示了感染表达 OER-GCaMP6f 的 AAV 载体的成熟小鼠海马神经元（30 DIV）中的 Ca2+ 反应。使用 100 µM DHPG 刺激神经元，DHPG 是代谢型谷氨酸受体的激动剂，可诱导 Ca2+ 释放。检测到了由 OER-GCaMP6f 报告的 DHPG 诱导的 Ca2+ 释放。
图 1：显示膜靶向 GECI 的示意图。 质膜靶向 GECI（Lck-GCaMP6f 和 Lck-RCaMP2）以及外层内质网膜靶向 GCaMP6f（OER-GCaMP6f）的示意图。
图 2：海马和皮层细胞制备、质粒转染及 AAV 感染的流程图。 显微图像分别代表刚接种的 DIV-6 皮层细胞（左）和从冻存细胞库中复苏的细胞（右）。比例尺 = 100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：在HeLa细胞中同时成像Lck-RCaMP2和OER-GCaMP6f的示例。（A）利用图像分光光学元件实现信号分离的示意图。Lck-RCaMP2和OER-GCaMP6f的同一视野被同时投射到相机上。由CMOS相机以10 Hz采集的代表性记录见视频1，该记录中的一个帧显示在图版A（右）。（B）Lck-GCaMP2（上）和OER-GCaMP6f（下）的ΔF/F0伪彩图像。在0 s时加入组胺（His，1 µM）。（C）Lck-GCaMP2（品红色）和OER-GCaMP6f（绿色）归一化的ΔF/F0时间过程的代表性曲线。数据被归一化至每条曲线的最大ΔF/F0值。灰色条表示组胺施加的时间点。数据分析使用自定义软件TI Workbench15完成。比例尺 = 50 µm（显微图像）。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：自发性Ca2+ 通过 Lck-RCaMP2 和 OER-GCaMP6f 表达监测星形胶质细胞中的升高。 (A代表性海马体和（B) 转染了 Lck-RCaMP2（上）和 OER-GCaMP6f（下）的皮层星形胶质细胞。皮层细胞由冻存培养物复苏获得。Lck-RCaMP2 和 OER-GCaMP6f 图像在同一细胞中以 2 Hz 频率用 EM-CCD 相机依次采集。左侧曲线图显示显微图像中标注的感兴趣区域（ROI）内测得的 ΔF/Fbase 随时间变化过程。数据使用 TI Workbench 进行分析。实际动态影像见 视频 2, 视频 3， 视频 4，以及 视频 5比例尺 = 20 µm （显微图像）。基线漂移表明全局 Ca 的变化2+ 细胞内的水平 请点击此处以查看此图的放大版本。
图5：表达Lck-GCaMP6f和OER-GCaMP6f的神经元中钙离子（Ca2+）成像示例。（A）第10天体外培养（DIV 10）的大鼠海马神经元表达Lck-GCaMP6f的代表性图像（左图），以及在图像中标示的感兴趣区域（黄色圆圈）内测得的ΔF/F₀随时间变化的曲线（右图）。时间曲线上标注的数字对应于图像中各感兴趣区域的编号。注意，不同感兴趣区域的Ca2+升高时间模式存在差异。基线漂移提示该神经元内整体Ca2+水平上升。（B）成熟小鼠海马神经元（DIV 30）感染OER-GCaMP6f表达型AAV载体后的示例（左图）。右图为测得的ΔF/F₀随时间变化曲线，显示在灰色条所示时间点施加100 µM (RS)-3,5-二羟基苯甘氨酸（DHPG）后引发的Ca2+反应。黄色圆圈标示获取时间曲线的感兴趣区域位置。图像使用制冷CCD相机（图A）或EM-CCD相机（图B）以2 Hz频率采集，并通过TI Workbench软件进行分析。比例尺 = 20 µm（显微图像）。请点击此处查看本图的放大版本。
视频 1：HeLa 细胞中 Lck-RCaMP2 与 OER-GCaMP6f 同时成像的示例。 代表性记录以 10 Hz 采集，见图 3。比例尺 = 50 µm。 请点击此处下载该视频。
视频 2：在海马体星形胶质细胞的 Lck-RCaMP2 中观察到的自发性 Ca2+ 瞬变。 以 2 Hz 采集的代表性记录（图 4A），与视频 3在相同的视野中记录。比例尺 = 20 µm。请点击此处下载该视频。
视频 3：在海马体星形胶质细胞的 OER-GCaMP6f 中观察到的自发性 Ca2+ 瞬变。 以 2 Hz 采集的代表性记录（图 4A），与视频 2处于同一视野。比例尺 = 20 µm。请点击此处下载该视频。
视频 4：在皮层星形胶质细胞的 Lck-RCaMP2 中观察到的自发性 Ca2+ 瞬变 以 2 Hz 采集的代表性记录（图 4B），与 视频 5 在同一视野中记录。比例尺 = 20 µm。 请点击此处下载该视频。
视频 5：在皮层星形胶质细胞的 OER-GCaMP6f 中观察到的自发性 Ca2+ 瞬变。 该代表性记录以 2 Hz 采集（图 4B），与 视频 4 为同一视野。比例尺 = 20 µm。请点击此处下载该视频。
视频 6：通过 Lck-GCaMP6f 对大鼠海马神经元（DIV 10）进行 Ca2+ 成像的示例。以 2 Hz 记录的神经元 Ca2+ 信号示例（图 5A）。比例尺 = 20 µm。请点击此处下载该视频。
视频 7：表达 OER-GCaMP6f 的小鼠海马神经元中的 Ca2+ 释放（DIV 30）。 记录感染 OER-GCaMP6f 表达型 AAV 载体的小鼠海马神经元中神经元 Ca2+ 信号的示例（图 5B）。通过在 30 秒时施加 100 µM 二羟基苯基甘氨酸（DHPG）刺激神经元，以诱导内质网中 Ca2+ 的释放。比例尺 = 20 µm。请点击此处下载该视频。
讨论
Ca2+信号会引发多种生物学效应。Ca2+是一种多功能的细胞内信号信使。如何解码Ca2+信号以触发特定的生物学响应，一直是基本的生物学问题，因此需要采用Ca2+成像技术来描述Ca2+信号的多样性。本文详细描述的实验方案能够检测细胞质膜和内质网（图3和图4）上的不同Ca2+信号，以及细胞内局部的Ca2+微区（图4和图5），有助于系统描述细胞内Ca2+信号的多样性。通过将基因编码的钙指示剂（GECIs）靶向定位于质膜和内质网，还可提高Ca2+信号的时间分辨率，因为该策略可避免Ca2+及GECIs本身在三维空间中的扩散效应，从而有可能精确检测发生在膜上的Ca2+内流或Ca2+释放的瞬时过程。
该方案存在一些局限性。用户应牢记，所检测到的信号是“Ca2+内流或释放瞬间”与“从原始Ca2+源扩散出的Ca2+”两者的总和，尤其对于较大的Ca2+信号而言更是如此。例如，尽管组胺（His）刺激HeLa细胞会引发内质网（ER）中Ca2+的释放，但所产生的Ca2+信号不仅可被靶向内质网的OER-GCaMP6f检测到，也可被靶向质膜的Lck-RCaMP2检测到（图3）。另一个局限性在于，Ca2+信号的空间-时间模式可能并非决定Ca2+信号输出的唯一因素。下游效应蛋白（如Ca2+依赖性激酶和磷酸酶）的分布也可能是一个决定性因素2。要完全解析细胞内Ca2+信号，必须对下游酶的行为进行分析，而本方案未涵盖这部分内容。
成功的钙离子（Ca2+）成像最关键的方面之一是成像系统的设置和图像采集条件，这一点与其他活细胞成像研究同样重要。我们先前已证明，细胞内的Ca2+反应高度依赖于激发光的持续时间与强度，以及图像采集条件，包括曝光时间和采集频率16。其中，激发光的功率是最关键的因素，因为它可能导致光毒性以及基因编码钙离子指示剂（GECIs）的光漂白。曝光时间、记录频率、激发光强度和记录时长等记录参数应根据实验目的进行优化。我们建议尽可能降低曝光时间和激发光强度，以避免光漂白和对细胞的光毒性。记录频率和记录时长应足以覆盖感兴趣的Ca2+升高事件，但同时也应尽可能降低，以减少光漂白和光毒性。我们建议首先确定记录频率和记录时长，再优化光照强度和曝光时间，以最大程度地减少GECIs的光漂白。另一个重要因素是GECIs的表达水平。由于GECIs是钙离子结合蛋白，因此具有Ca2+缓冲效应。因此，GECIs的过表达会导致对细胞生理上必需的Ca2+的缓冲作用。应尽量降低GECIs的表达量，以避免对高表达GECIs的细胞进行成像。
总之，在亚细胞分辨率下解析Ca2+信号是解码决定细胞内生物学效应的Ca2+信号的最重要步骤之一。本实验方案提供了一种新的方法，用于解析Ca2+信号并描述这些信号之间的多样性。目前，该技术主要限于体外实验。然而，Lck-GCaMP6f已开始用于小鼠体内的Ca2+成像17，而OER-GCaMP6f已在秀丽隐杆线虫（C. elegans）的VD运动神经元中被证实可用于体内Ca2+信号监测7。因此，将GECIs靶向定位于亚细胞区室的技术未来有望拓展至体内成像，从而实现活体条件下的Ca2+信号解析。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由以下基金资助：日本科学技术振兴机构（JST）/先驱性胚胎科学与技术研究项目（PRESTO）（JPMJPR15F8，日本）；日本学术振兴会（JSPS）/科学研究费助成事业（KAKENHI）（JP18H05414、JP17H05710、JP16K07316）；武田基金会。作者感谢东京大学的Haruhiko Bito提供RCaMP2，感谢RIKEN脑科学研究中心（CBS）的Arthur J.Y. Huang和Thomas McHugh提供AAV载体以及关于AAV制备的指导。作者谨此致谢 也感谢 感谢《视觉化实验杂志》编辑在视频拍摄与编辑过程中提供的帮助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| (RS)-3,5-二羟基苯基甘氨酸（DHPG） | Tocris | #0342 | |
| 0.5% DNase I 储存液 | Sigma-Aldrich | #11284932001 | 在 Hank's 平衡盐溶液中配制 0.5% DNase I（w/v） 添加 120 mM MgSO₄4. 准备 160 µL 分装并储存在 -30 °C. |
| 0.5% 胰蛋白酶-EDTA 溶液 | 赛默飞世尔科技 | #25300054 | |
| 100 mM L-谷氨酰胺（×100 倍浓缩液 | 赛默飞世尔科技 | #25030081 | 准备250-750的小份 aliquot µL 并于 -30 保存 °C. |
| 100 mM 丙酮酸钠×100 倍浓缩液 | 赛默飞世尔科技 | #11360070 | 分装（10 mL）可在 -20 °C. 解冻后，溶液可在4℃保存 °2个月 |
| 12孔低蒸发盖多孔培养板 | Falcon | #353043 | 低蒸发盖对于神经元-胶质细胞共培养至关重要。对于细胞系细胞，可使用其他培养皿。 |
| 直径18 mm的圆形盖玻片 | Karl Hecht "辅助" | #41001118 | 厚度1，直径18 mm的圆形盖玻片；也可使用其他规格的盖玻片。 |
| 1 M HEPES | Thermo Fisher Scientific | #15630080 | pH 7.2–7.6 |
| 2.5% 胰蛋白酶储存液（×20 倍浓缩液 | Sigma-Aldrich | #T4674 | 准备 150 µL 分装并储存在 -30 °C. |
| 50% 聚乙烯亚胺（PEI）溶液 | Sigma-Aldrich | #P3143 | 配制 2% (V/V) PEI 储存液×50）用经滤膜除菌的蒸馏水稀释。将储备液保存于 -30 °C，在制备250-750的小份样品后 µL. 在盖玻片包被当天，用蒸馏水配制 0.04% PEI 溶液。 |
| 70% 乙醇 | 保存于喷雾瓶中，用于表面消毒。 | ||
| 腺相关病毒（AAV），用于在EF1a启动子调控下表达Lck-GCaMP6f、Lck-RCaMP2和OER-RCaMP2 | AAV 可使用 AAV Helper Free System（Agilent Technologies）和 HEK293 细胞制备，也可采用其他方法。pAAV.EF1a.Lck-GCaMP6f、pAAV.EF1a.Lck-RCaMP2 以及 pAAV.EF1a.OER-GCaMP6f 可根据要求提供。 | ||
| B-27 添加剂（×50 倍浓缩液 | 赛默飞世尔科技 | #17504044 | 这可以替换为 B-27 Plus 添加剂（Thermo Fisher Scientific；#A3582801）或 MACS NeuroBrew-21（Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国；#130-093-566）。 |
| B57BL/6 | 日本 SLC 公司 | ||
| 用于显微图像记录的相机 | 以下相机可供使用：制冷CCD相机（例如，Hamamatsu Photonics，OECA-ER）、EM-CCD相机（例如，Hamamatsu Photonics， ImagEM；Andor，iXon）或 CMOS相机（例如，Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0） | ||
| 细胞冻存容器 | Sarstedt K.K. | #95.64.253 | 可使用其他细胞冻存容器。 |
| 细胞筛 | Falcon | #352350 | |
| CO2 培养箱 | 维持在 37 °℃，5% CO₂2. | ||
| 冻存管 | 康宁 | #430661 | 可使用其他类型的冷冻管。 |
| 冷冻保存培养基 | Zenoaq | "CELLBANKER1" | |
| 培养基（用于HeLa细胞） | 添加10%热灭活胎牛血清和青霉素-链霉素溶液（终浓度：青霉素100 U/mL和链霉素100）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM） µg/mL | ||
| 解剖液 | 1 毫升 1 M HEPES（终浓度 20 mM）加入 49 毫升 DMEM 中 | ||
| DMEM | Nacalai | #08456-65 | 可使用其他种类的DMEM。 |
| DMEM | Nacalai | #08456-65 | 低葡萄糖 |
| DNA转染试剂 | Sigma-Aldrich | #6366244001 | "X-tremegene HP DNA 转染试剂" 可使用其他转染试剂。 |
| 带盖玻璃罐 | 用于麻醉动物的 500 mL（小鼠）或 1,500 mL（大鼠）广口瓶 | ||
| HBSS | 赛默飞世尔科技 | #14170161 | 无钙镁 HBSS |
| 热灭活牛血清 | 赛默飞世尔科技 | #10100147 | |
| HeLa 细胞 | 理化学研究所生物资源中心 | #RCB0007 | |
| 组胺 | Sigma-Aldrich | #H7125 | |
| 图像分析软件 | 例如 Metamorph（Molecular Devices）、ImageJ（NIH）和 TI Workbench14（定制） | ||
| 图像分光光学器件 | 滨松光子学 | #A12801-01 | W-view GEMINI |
| 图像分光光学二向色镜 | Semrock | #FF560-FDi01-25×36 | 用于绿色荧光蛋白/红色荧光蛋白的分离 （GFP/RFP）信号 |
| 图像分光光学发射滤光片 | Semrock | #FF01-512/25-25，#FF01-630/92-25 | 分别用于GFP/RFP信号的发射 |
| 成像培养基与缓冲液 | 使用适合实验的培养基或缓冲液。若使用培养基，建议选用不含酚红的培养基，以减少背景荧光。添加 20 mM HEPES 以在非 CO₂ 培养环境中维持 pH 值。2 培养箱 | ||
| 孵育液 | 加入1 mL 1 M HEPES（终浓度20 mM）至49 mL HBSS中 | ||
| 倒置荧光显微镜 | 例如 IX73（Olympus）或 Eclipse TI (Nikon Instech) | ||
| 异氟烷 | Pfizer | 用于麻醉 | |
| 维持培养基（用于4 × 12 孔板 | 48.5 mL Neurobasal-A 培养基，添加 1 mL B-27、500 µL-谷氨酰胺储备液和25 µL-青霉素-链霉素溶液。 | ||
| 冻存皮质细胞的维持培养基（配制1 L） × 12 孔板 | 12.2 mL 添加了250的Neurobasal完全培养基 µL B-27，125 µL 谷氨酰胺储备液和 6.2 µL 青霉素-链霉素溶液。 | ||
| 最小必需培养基（Minimum Essential Medium, MEM） | 赛默飞世尔科技 | #11090-081 | |
| 用于GCaMP6f成像的显微镜滤光片组 | 适用于GFP的滤光片（激发光，480 ± 10 nm；发射，530 ± 20 nm | ||
| 用于RCaMP2成像的显微镜滤光片组 | 适用于RFP的滤光片（激发光，535 ± 50 nm；发射，590 nm 长通 | ||
| 用于RCaMP2与GCaMP6f双通道成像的显微镜滤光片组 | Semrock | #FF01-468/553-25, #FF493/574-FDi01-25×36, #FF01-512/630-25 | GFP/RFP成像用双激发滤光片、双二向色镜和发射滤光片 |
| 显微镜加热系统 | 用于维持细胞在 37 ℃ 的加热系统 °成像过程中保持恒温。为避免热膨胀引起的漂移，建议使用覆盖整个显微镜本体的加热系统（例如 Tokai Hit，Thermobox）。 | ||
| 用于激发的显微镜光源 | 汞灯（100 W）、氙灯（75 W）、发光二极管（LED）照明系统（例如 CoolLED Ltd.，precisExcite；Thorlabs Inc.，4-Wavelength LED Source；Lumencor，SPECTRA X light engine）。若使用汞灯或氙灯，需使用中性密度滤光片（ND滤光片）以降低激发光强度。 | ||
| 显微镜物镜 | 建议使用数值孔径高于1.3的Plan-Apochromat油浸物镜，以记录自发性Ca2+ 神经元和星形胶质细胞中的活动。 | ||
| Neurobasal Plus 培养基 | 赛默飞世尔科技 | #A3582901 | |
| Neurobasal-A 培养基 | 赛默飞世尔科技 | #10888022 | Neurobasal plus 培养基（Thermo Fisher，A3582901）可替代 Neurobasal-A 培养基使用。 |
| PBS(-)：无钙磷酸盐缓冲液2+ 和 Mg2+ | 富士胶片和光纯药株式会社 | #164-23551 | 钙离子信号缺失2+ 和 Mg2+ 关键在于不能抑制胰蛋白酶的活性。可使用不含钙镁离子的磷酸盐缓冲液（PBS(-)）的替代溶液。 |
| PC 与图像采集软件 | 例如 Metamorph（Molecular Devices）；Micromanager；TI Workbench14. | ||
| 青霉素-链霉素溶液 | Thermo Fisher Scientific | #15140122 | 青霉素 10,000 U/mL 和链霉素 10,000 µg/mL |
| 在巨细胞病毒启动子下表达 Lck-GCaMP6f、Lck-RCaMP2 和 OER-RCaMP2 的质粒 7-9 | 应要求提供 | ||
| 铺板培养基（用于4 × 12 孔板 | 48 mL MEM 添加 1 mL B-27 补充剂、500 µL-谷氨酰胺储备液（终浓度：2 mM），500 µL 毫摩尔浓度为 1 mM 的丙酮酸钠储备液和 25 µL 青霉素-链霉素溶液（青霉素 5 U/mL，链霉素 5 µg/mL）。该浓度的青霉素-链霉素为1/20 厂家推荐的浓度对神经元存活至关重要。 | ||
| 记录室 | Elveflow | Ludin室 | 该记录室适用于直径为18 mm的圆形盖玻片。 |
| 低血清培养基 | Thermo Fisher | #11058021 | Opti-MEM |
| 体视显微镜 | 用于解剖海马体。可使用 Olympus SZ60 或同等型号的体视显微镜。 | ||
| 手术器械 | 标准解剖剪用于剪开小鼠或大鼠的腹部，镊子用于夹取子宫，精细解剖剪用于剪切子宫和胚胎头部，环形镊用于夹取胚胎，13 cm 弯曲Semken镊（Fine Science Tools #11009-13）用于取出脑组织， 3 把尖头镊子 （Dumont Inox #5） | ||
| 神经元转染试剂 | 赛默飞世尔科技 | #L3000008 | "Lipofectamine 3000" 试剂 它由 "补充剂（P3000）" 在步骤 2.2.3 中应与质粒 DNA 混合的 "转染试剂（Lipofectamine 3000）" 用于步骤 2.2.4 中 |
| 台盼蓝（0.4%） | Thermo Fisher Scientific | #15250061 | |
| 冻存皮层细胞洗涤液 | 25 mL DMEM，添加250 µ升 热灭活胎牛血清 + 12.5 µ青霉素链霉素溶液 | ||
| Wistar 大鼠 | Japan SLC, Inc | 怀孕大鼠（E18） |
参考文献
- Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
- Bagur, R., Hajnoczky, G. Intracellular Ca(2+) Sensing: Its Role in Calcium Homeostasis and Signaling. Molecular Cell. 66 (6), 780-788 (2017).
- Bannai, H., et al. Bidirectional Control of Synaptic GABAAR Clustering by Glutamate and Calcium. Cell Reports. 13 (12), 2768-2780 (2015).
- Tojima, T., Hines, J. H., Henley, J. R., Kamiguchi, H. Second messengers and membrane trafficking direct and organize growth cone steering. Nature Reviews Neuroscience. 12 (4), 191-203 (2011).
- Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nature Neuroscience. 13 (6), 759-766 (2010).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Niwa, F., et al. Dissection of local Ca(2+) signals inside cytosol by ER-targeted Ca(2+) indicator. Biochemical and Biophysical Research Communications. 479 (1), 67-73 (2016).
- Vervliet, T., et al. Basal ryanodine receptor activity suppresses autophagic flux. Biochemical Pharmacology. 132, 133-142 (2017).
- Sakuragi, S., Niwa, F., Oda, Y., Mikoshiba, K., Bannai, H. Astroglial Ca2+ signaling is generated by the coordination of IP3R and store-operated Ca2+ channels. Biochemical and Biophysical Research Communications. 486 (4), 879-885 (2017).
- Inoue, M., et al. Rational design of a high-affinity, fast, red calcium indicator R-CaMP2. Nature Methods. 12 (1), 64-70 (2015).
- Quasthoff, K., et al. Freshly frozen E18 rat cortical cells can generate functional neural networks after standard cryopreservation and thawing procedures. Cytotechnology. 67 (3), 419-426 (2015).
- Boehringer, R., et al. Chronic Loss of CA2 Transmission Leads to Hippocampal Hyperexcitability. Neuron. 94 (3), 642-655 (2017).
- Arizono, M., et al. Receptor-selective diffusion barrier enhances sensitivity of astrocytic processes to metabotropic glutamate receptor stimulation. Science Signaling. 5 (218), ra27(2012).
- Kanemaru, K., et al. In vivo visualization of subtle, transient, and local activity of astrocytes using an ultrasensitive Ca(2+) indicator. Cell Reports. 8 (1), 311-318 (2014).
- Inoue, T. TI Workbench, an integrated software package for electrophysiology and imaging. Microscopy (Oxford, UK). 67 (3), 129-143 (2018).
- Miyamoto, A., Bannai, H., Michikawa, T., Mikoshiba, K. Optimal microscopic systems for long-term imaging of intracellular calcium using a ratiometric genetically-encoded calcium indicator. Biochemical and Biophysical Research Communications. 434 (2), 252-257 (2013).
- Srinivasan, R., et al. New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
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