利用低氧/SU5416模型在小鼠中诱导和表征肺动脉高压

摘要

本方案描述了一种基于低氧暴露并联合注射血管内皮生长因子（VEGF）受体拮抗剂来诱导小鼠肺动脉高压（PH）的方法。动物在启动方案后3周内发展出肺动脉高压及右心室（RV）肥厚。本文还介绍了该模型的功能学和形态计量学特征表征。

摘要

肺动脉高压（PH）是一种病理生理状态，其定义为在静息状态下经右心 导管术测得的平均肺动脉压超过25 mm Hg。多种疾病均可导致PH，这些疾病在病因、组织病理学、临床表现、预后及对 治疗的反应方面各不相同。尽管近年来已取得显著进展，PH仍是一种尚未被治愈的疾病。深入理解其潜在机制有助于开发新的治疗方法。动物模型是实现这一目标的重要研究工具。目前已有多种可用于模拟PH的模型。本实验方案描述了一种双打击小鼠PH模型，通过低氧暴露联合注射SU5416（一种血管内皮生长因子（VEGF）受体拮抗剂）作为诱导PH的刺激因素。在启动低氧/SU5416处理3周后，动物会出现肺血管重构，模拟人类PH（主要为第1组）中观察到的组织病理学改变。肺循环中的血管重构进一步导致右 心室（RV）的重构。本文详细描述了右心室压力测量（采用开胸法）、右心室形态计量学分析（通过分离并称量两个心室）以及重构的组织学评估方法（肺部方面评估血管重构，心脏方面评估右心室心肌细胞肥大和纤维化）。该方案的优势在于既可用于野生型小鼠，也可用于基因修饰小鼠，实施相对简便且成本较低，并可在较短时间内（3周）快速建立目标疾病模型。该方法的局限性在于小鼠通常不发展为严重表型，且在恢复常氧后PH可逆。此外，该模型易于开展预防性和治疗性研究，无需掌握高难度的外科操作技能（与手术类啮齿动物模型相比）。

引言

肺动脉高压（PH）是一种病理生理状态，其定义为在静息状态下通过右心导管检查测得的平均肺动脉（PA）压超过25 mm Hg^1,2。多种疾病均可导致PH的发生。为了对与PH相关的疾病进行系统归类，已提出了多种分类体系。目前的临床分类将与PH相关的多种疾病分为5个不同组别¹。这种区分具有重要意义，因为不同组别的患者在临床表现、病理特征、预后以及对治疗的反应方面均存在差异²。表1总结了当前的分类体系，并补充了每种疾病的基本组织病理学特征。

表 1：肺动脉高压（PH）临床分类的概述，以及各组内的主要组织病理学特征。缺氧/SU5416 方案用于建立肺动脉高压模型的适用性。本表格改编自¹⁹....

方案

在进行任何动物实验之前，须获得当地机构动物护理委员会的授权。本实验是在西奈山伊坎医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准后进行的。

1. 肺动脉高压（PH）诱导

1. 准备
   1. 在开始研究之前，仔细规划实验设计。确保小鼠在第一次注射 SU5416 的同时开始暴露于低氧环境。使用低氧/SU5416 方法诱导肺动脉高压（PH）的实验设计示例如 图1A 所示。对照组小鼠仅接受溶剂处理。在此模型中，SU5416 将每周注射一次，连续注射3周。
   2. 本研究使用8至12周龄的C57BL/6小鼠。将动物饲养在18–20 °C、12小时光照-黑暗循环的环境中。确保食物和水自由获取（ad libitum）。
   3. 称量动物体重，并随机分配至各组：常氧组和低氧/SU5416组。
   4. 按照 图1B 所示准备低氧舱。将氮气（N₂）钢瓶置于舱体附近。将氧气（O₂） 控制器设定为10% O₂，并让系统达到稳态。
   5. 准备用于注射的 SU5416（使用剂量为20 mg/kg 体重）。SU5416 不溶于水溶液，因此....

结果

在本方案中，我们详细描述了建立缺氧/SU5416小鼠模型以诱导肺动脉高压（PH）的方法。此外，我们还详尽阐述了在观察期结束时进行肺血管和心脏评估所需的全部步骤。

该模型实验设计的概述见图1A^13,14。小鼠暴露于常压低氧环境（10% O₂），并连续三周每周一次皮下注射SU5416。本方案中用于诱导肺动脉高压（PH）的刺激因素见图1B和1C。

VEGF 受体拮抗剂 SU5416 通过诱导内皮细胞凋亡发挥作用，从而允许抗凋亡内皮细胞增殖。这会导致肺血管系统的血管重塑和血管阻力增加⁵。肺循环压力升高会增加右心室（RV）的后负荷，并逐渐导致右心室功能障碍和衰竭

讨论

本方案描述了通过结合两种病理刺激——慢性缺氧和SU5416注射（缺氧/SU5416）——在小鼠中建立肺动脉高压（PH）模型的方法¹⁸。为了将该小鼠模型与人类PH疾病状态相关联，必须参考当前的PH分类，如表1所示。几乎所有类型的PH均以肺血管收缩以及内皮细胞和平滑肌细胞的异常增殖为特征。这会导致肺动脉压力升高，进而增加右心室的后负荷。

在对肺动脉高压（PH）动物模型进行表征时，每一项研究都应包含肺血管和右心室组织病理学重塑的证据。单一打击（缺氧）小鼠模型仅导致轻度的血管重塑^2,3。此类病理改变包括原本无肌层的血管出现肌层化，并伴有内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞的增殖。当增加第二次打击（SU5416注射）后，这些病变会进一步加重。在单一打击（缺氧）模型中，这些改变是可逆的；而在缺氧/SU5416模型中，仅部分可逆。 

肺动.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
冰醋酸	Roth	3738.1
丙酮，组织学级	The Lab Depot	VT110D
ADVantage 压力-容积系统	Transonic	ADV500
Bouin 氏液	Sigma	Ht10132
电凝系统	Fine Science Tools	18000-00
连接管路和阀门
棉签	Covidien	8884541300
盖玻片，24×50 mm	Roth	1871
数据采集与分析系统	Emka	iox2
直接红 80	Sigma	365548-5G
DMSO（二甲基亚砜）	Sigma Aldrich	276855
干冰
Dumont #5 镊子	Fine Science Tools	11251-10
Dumont #7 精细镊子	Fine Science Tools	11274-20
包埋模具	Sigma Aldrich	E-6032
水溶性伊红溶液	Sigma	HT110216
乙醇，实验室级	Carolina Biological Supply Company	861285
快绿 FCF	Sigma	F7252-5G
精细剪刀	Fine Science Tools	14090-09
羊血清	invitrogen	16210-064
加热垫	Gaymar	T/Pump
苏木精 2	Thermo Scientific	7231
低氧培养箱	Biospherix	A30274P
诱导麻醉舱	DRE Veterinary	12570
插管导管（静脉导管 SurFlash (20 G × 1")）	Terumo	SR*FF2025
眼科剪	Fine Science Tools	14084-08
异氟烷	Baxter	NDC-10019-360-40
异氟烷蒸发器	DRE Veterinary	12432
小鼠 (C57BL/6)	Charles River
针头 25 G × 5/8"	BD	305122
OCT 包埋剂	Tissue Tek	4583
PBS（磷酸盐缓冲液）	Corning	21-031-CV
苦味酸饱和溶液 1.3%	Sigma	P6744-1GA
压力-容积导管	Transonic	FTH-1212B-4018
牵开器	Kent Scientific	SURGI-5001
静态氧控制器 ProOx 360	Biospherix	P360
SU 5416	Sigma Aldrich	S8442
外科缝线，黑色编织丝线，5.0	Surgical Specialties Corp.	SP116
手术胶带	3M	1527-1
10 ml 注射器	BD	303134
带针头的 1 ml 注射器	BD	309626
Sytox Green 核酸染料	Thermo Scientific	S7020
肌腱剪	Pricon	60-521
甲苯	Roth	9558.3
呼吸机	CWE	SAR-830/P
WGA Alexa Fluor	Thermo Scientific	W11261
二甲苯	Roth