使用缺氧/SU5416模型对小鼠的肺高血压进行诱导和特征

摘要

该协议描述了小鼠肺高血压（PH）的诱导，基于暴露于缺氧和VEGF受体拮抗剂的注射。动物在协议启动3周后出现PH和右心室（RV）肥大。介绍了模型的功能和形态特征。

摘要

肺高血压 （PH） 是一种病理生理状况，由超过 25 mm Hg 的呼吸道动脉压力定义，由右心导管评估。广泛的疾病可导致PH，其病因、基础病理学、临床表现、预后和治疗反应各不相同。尽管近年来取得了重大进展，但PH仍然是一种未治愈的疾病。了解基本机制可以为开发新疗法铺平道路。动物模型是实现这一目标的重要研究工具。目前，有几个模型可用于重述PH。该协议描述了两击鼠标 PH 模型。PH发育的刺激是缺氧和SU5416的注射，一种血管内皮生长因子（VEGF）受体拮抗剂。低氧/SU5416开始三周后，动物发展肺血管重塑模仿在人类PH中观察到的组织病理学变化（主要是第1组）。肺循环中的血管重塑导致右心室 （RV） 的重塑。详细描述了测量RV压力（使用开放胸法）、RV的形态分析（通过解剖和称重两个心室）和重塑术（通过评估血管重塑和心脏评估肺功能评估）的过程。该协议的优点是，在野生型和转基因小鼠中应用的可能性，相对容易和低成本的实施，以及感兴趣的疾病的快速发展（3周）。这种方法的局限性是小鼠不发展严重的表型和PH是可逆的返回诺莫夏。预防以及治疗研究可以很容易地在这个模型中实施，而没有必要的高级技能（而不是手术啮齿动物模型）。

引言

肺高血压 （PH） 是一种病理生理状况，由平均肺动脉 （PA） 压力在休息时超过 25 mm Hg 定义，由右心导管¹，^2评估。有各种各样的疾病，可导致PH。为了组织与PH相关的条件，开发了几种分类系统。目前的临床分类分类的多个PH相关疾病在5个不同的组^1。这种区别很重要，因为不同组的患者的临床表现、病理学、预后和治疗反应都^不同。表1总结了目前的分类，并辅之以每种疾病的基本组织病理学特征。

表1:PH临床分类概述，以及各组内的主要组织病理学特征。低氧/SU5416 协议的适用性，用于建模 PH。此表已从^{19 起修改}。PH: 肺高血压， PAH: 肺动脉高血压

尽管在治疗PH相关疾病方面取得了重大进展，但PH仍然无法治愈，3年死亡率在20%至80%^之间。这表明迫切需要了解PH的基本机制，然后，开发新的疗法，以防止，减缓进展，并治愈疾病。动物模型对于这个范围至关重要。目前，研究PH的各种模型都存在。有兴趣的读者会参考有关这个题目^{2，3，4,的优秀,评论}。考虑到导致PH的各种疾病，很明显，人类PH的各种条件不能完全概括为一种动物模型。可用的动物模型可以分为 i） 单击， ii） 两击， iii） 淘汰， 和 iv） 过度表达模型³。在单击模型中，PH 是由单个病理刺激诱导的，而双命中模型将两种病理刺激与诱导更严重 PH 的目标相结合，从而更密切地模仿复杂的人类疾病。除了病因差异外，几种刺激导致PH建模差异，也取决于动物的种类和遗传^背景4。

最常用的经典PH啮齿动物模型之一是慢性缺氧模型^2。众所周知，低氧在人类和几种动物物种中诱发PH。缺氧的好处是PH的生理刺激（表1）。然而，虽然用于诱导啮齿动物PH的缺氧程度比人类严重得多，单一的侮辱（缺氧）只导致轻微的血管重塑。这不能模仿人类疾病的严重程度。增加第二次命中，一个额外的刺激诱导PH，显示了有希望的结果:注射化合物SU5416啮齿动物结合低氧刺激诱导更严重的PH表^{型2，5，6。,5,6}SU5416是血管内皮生长因子（VEGF）受体-2的抑制剂。它阻断VEGF受体并导致内皮细胞凋亡。在缺氧条件下，这刺激了抗凋亡内皮细胞子集的增殖。此外，SU5416导致平滑的肌肉细胞增殖。这些效果的组合导致肺循环的病理血管重塑，并导致PA压力升高和右心室重塑^{2，5，7。,5,7}该模型首先在大鼠^6中描述，后来应用于小鼠^{,4、5、7。547}与大鼠相比，小鼠模型表现出的血管重塑不太严重。此外，当回到诺莫夏时，PH在大鼠中继续进步，而在大鼠中则部分可逆。

以下协议描述了使用缺氧/SU5416 方法（规划、时间线、执行）在小鼠中建模 PH 的所有步骤。此外，本方案还描述了该模型的特征:功能性（通过侵入性测量右心室（RV）压力使用开放胸部技术）、形态测量（通过解剖和称重右心室和左心室），以及组织学（通过评估肺血管重塑、右心室心肌细胞肥大和纤维化）。

本协议中描述的所有步骤和方法都可以在任何经验级别上由调查人员轻松实施。虽然使用开放胸腔技术（此处描述）的 RV 的功能测量不是该领域的黄金标准方法，但它的优点是，即使经验较少的实验者也可以快速了解和准确再现。

方案

在任何动物实验之前，获得当地机构动物护理委员会的授权。目前的实验是在西奈山伊坎医学院的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准后进行的。

1. PH 感应

1. 制备
   1. 在开始研究之前，请仔细规划实验设计。确保小鼠在第一次SU5416注射的同一时间点受到缺氧。图1 A 中显示了使用缺氧/SU5416 方法诱导 PH 的实验 设计示例。对照鼠标只收到车辆。对于此模型，SU5416 将连续 3 周每周向小鼠注射一次。
   2. 使用8至12周大的C57BL/6小鼠进行本研究。在12-h的浅暗循环下，在18-20°C下将动物饲养。确保食物和水是可 获得的。
   3. 称量动物。将它们随机分配给每组:诺莫夏和缺氧/SU5416。
   4. 准备缺氧室，如图 1B. 将氮气 （N_{2） 罐}固定到腔室附近。将氧气 （O_2）控制器设置为 10% O₂点。让系统达到稳定状态。
   5. 准备SU5416注射（使用20毫克/千克体重的剂量）。SU5416不溶于水溶液;因此，将计算金额溶解在 100 μL DMSO^{8 中}。例如，对于 25 g 小鼠，要注射的 SU5416 量为 0.5 mg 溶解在 100 μL 溶剂 （DMSO） 中。因此，此小鼠的 SU5416 最终浓度为 5 mg/mL。
      注意:SU5416 是一种危险材料。请仔细阅读产品附带的安全数据表，并确保在处理这种物质时采取建议的预防措施。戴上防护手套（如任何注射）使用眼部保护。SU5416的化学结构如图 1C所示。
      注:计算溶液的适当过量，以补偿注射过程中将损失的体积（例如注射器、小瓶等）。根据使用的注射器，死体积约为200μL。对于一组 10 只小鼠，计算超过 2 个小鼠剂量。
   6. 准备注射器进行注射。使用 1 mL 注射器与 25 G x 5/8" 针头。
2. SU5416 皮下注射
   1. 约束动物。将鼠标放在笼子盖上，以协助约束。抓住皮肤，形成与脊柱平行的帐篷。一定要紧紧抓住后背，避免被老鼠咬伤。
      注:两名调查员的存在使手术更快、更准确，因为一个调查员可以容纳动物，而另一个可以进行注射。
   2. 将针头皮下插入皮肤松散褶皱的侧翼上。确保插入与皮肤平行的针。避免穿透腹壁。
   3. 注射注射器的含量（100μL 溶解的SU5416或车辆）。
      注:为了避免在完全分娩后泄漏，请将注射器按住约 10 s，并在皮肤下稍微旋转针头。
   4. 把针头取出来，把动物还到笼子里。在SU5416注射后，将笼子放在通风缺氧室中。
3. 低氧暴露
   1. 一段时间监控通风。确保保持 10% 的氧气供应。在21%O 2的半密封室中保持无节_动物。
   2. 确保腔室配备氧气传感器以测量氧气水平。避免大面积打开房间。用于清洁和添加食物和水，每3天打开不超过20分钟。
   3. 每天检查动物。考虑压力信号，如皮桩或体重显著减轻。
      注:低氧/SU5416以下的动物预计将减肥^5。这是疾病发展的迹象。
   4. 连续 3 周每周重复 SU5416 注射（ 有关实验设计的概述 ，请参见图 1 A）。
      注:改变注射部位有助于减少皮肤刺激。

2. 侵入性房车压力测量功能特性

1. 制备
   注:选择麻醉方案。可注射或可吸入麻醉剂。由于轻微过量注射麻醉剂（特别是氯胺酮/西拉辛或五巴比妥）可显著影响心脏功能，建议使用挥发性麻醉剂。在研究中，对所有小鼠使用相同的麻醉剂非常重要。
   1. 使用蒸发器确保每个动物的麻醉剂量准确。异氟的剂量如下:诱导3-4%，维持1%与100%氧气混合。
      注:穿戴个人防护装备，避免呼吸蒸汽。
   2. 准备加热垫和/或加热灯，以保持体温。准备直肠温度探头以监测体温。
   3. 确保通风正常。事先准备呼吸机。准备 Y 管接头并使用手动模式检查呼吸机的功能。确保吸入压力为 <1 厘米 H₂O，以避免巴罗创伤。将呼吸速率设置为 110 呼吸/分钟。
   4. 通过切割 20 G 血管内导管准备气管。
   5. 准备所需的仪器:小钳子、剪刀、弹性钩缩回器、容器烧灼器和棉签。在棉签上调整一个小的 25 G x 5/8" 针，用于在右心室进行小穿刺。
   6. 准备压力导管、压力体积控制单元并启动数据采集软件。将PV导管放在充满PBS的15 mL管中，温度为37°C15分钟，并按照制造商的协议进行校准。
   7. 对于器官的灌注和固定，准备PBS和溶液50%PBS / 50%OCT.准备2×10毫升注射器（用25G针）:一个将用于用 PBS原 位呼吸心脏和肺，第二个用于注射C OCT/PBS（50/50）溶液的肺标本，将用于组织学检查。
2. 插管
   1. 称量鼠标并记录麻醉前的健康状况。
   2. 用3-4%等氟化诱导麻醉。通过测试手趾捏反射检查麻醉深度:用力捏紧四肢之一的手指趾。如果动物退出肢体，这是麻醉不足的迹象。
   3. 麻醉诱导后，剃光颈部和胸部区域。
   4. 将鼠标放在加热垫上。放置直肠温度探头以监测体温。
      注:体温的维持对于功能测量非常重要。体温应约为36.5-37 °C。
   5. 使用弯曲钳将缝合线连接到鼠标的上切口，用手术胶带拉伸并固定到加热垫上。使用手术胶带固定小鼠的四肢。
   6. 对于插管动物，用小剪刀在宫颈皮肤中切大约1厘米的小切口。
      注:口服插管是一种需要更多经验的替代方法。
   7. 用棉尖施用器钝直分离中层唾液腺。这将暴露肌肉覆盖气管。
   8. 小心地切割这些肌肉暴露气管。
   9. 用小剪刀在气管的推车之间做一个小切口，并插入准备好的气管管。拿出血管内导管的金属导管。
   10. 将导管连接到呼吸机。通过手动轻轻充气肺来验证气管位置。用胶带固定位置。
   11. 在整个过程中保持1%的异氟麻醉。
   12. 通过测试手趾捏反射，定期监测麻醉深度。相应地调整麻醉。
       注:实验期间推荐的心率在1%异氟麻醉下，约为400次/分钟。维持体温和麻醉对控制心率至关重要。过量的异氟可降低心率。但是，可以通过降低异氟率实现恢复。
3. RV 压力测量（开箱法）
   1. 用小剪刀在西腓工艺和上腹部部进行约1厘米的皮肤切口。分离覆盖胸部和上腹部象限的腹壁的皮肤:从中线开始，到西腓，小心地在两侧横向移动。使用热气库控制出血。
      注:目标是通过腹壁进入胸腔。
   2. 打开腹腔，小心切开隔膜，注意不要伤害跳动的心脏或肺部。
      注:目标是暴露心脏的顶点和右心室。良好的心脏暴露和视图对于正确放置导管至关重要。在整个过程中避免出血非常重要。即使是血管内体积的很小的变化也会改变右心的负荷，并影响记录的参数。
   3. 使用棉尖施用器轻轻取出百分。
   4. 在将压力导管放入心脏之前，将导管放在鼠标旁边。
   5. 使用准备好的棉尖施用器与针头使刺伤在右心室的尖孔半部。小心地取出针头，并将压力导管插入此孔中。
      注意:这应该在不施加力的情况下有效。如果不可能，请尝试在第一个孔附近打一个新洞，以避免心脏受到长时间的伤害。针的插入深度不应超过约 3 mm。
   6. 插入与右心室方向平行的压力导管，尖端朝向肺动脉。
   7. 观察压力波跟踪，确保导管的正确定位。代表性跟踪如图 2 所示。
   8. 让压力信号稳定下来。暂停呼吸并获取至少 3 个测量值。在单个测量之间，允许动物通风。
   9. 记录所有测量值后，取出导管并将其放回水浴中 PBS 填充管中。
      注:实验完成后，按照制造商的说明清洁导管。
4. 安乐死和肺灌注
   1. 实验完成后，通过排泄使鼠标安乐死。
   2. 广泛打开胸部。用剪刀切开整个胸骨，注意不要伤害心脏或肺部。
   3. 使用虹膜剪刀在左心室做一个小切口，让血液离开腔室。
   4. 将含有 10 mL PBS 的注射器的 25 G 针头放在右心室中，并注射 PBS 溶液，直到肺部清除血液。
   5. 一旦完成这一步，确认安乐死的重要组织收获（心脏和肺）:切断卡瓦和大音附件，并删除心脏和 肺块。

3. 变形表征

1. 立即切除心脏和肺（步骤2.4.5），分离心脏并切除两个阿不利亚。用弯曲的十耳分析器仔细解剖左心室 （LV） 的右心室 （RV），留下隔膜 （S） 与左心室。称重RV和LV+S并计算富尔顿指数=RV/LV+S（图3）5，9。^5,9
2. 采取右心室的一部分，并将其放在一个 OCT 预填充嵌入模具。使用右心室的另一部分进行RNA和/或蛋白质分析。在干冰中捕捉冻结，储存在-80°C。
3. 使用虹膜剪刀将肺与心脏和任何其他剩余组织分离。
   注:对于肺的准备，如上所述的灌注（步骤2.4.3-2.4.5）非常重要。
4. 捕捉冷冻部分肺部，并将其储存在RNA、蛋白质提取或其他测定中。
5. 使用肺的另一部分进行组织学分析。为此，将含有50%PBS和50%OCT的注射器插入已用叶^{10、11的支气管中}。实验者可以很容易地看到，当注射器的含量被注入组织时，肺会膨胀。
6. 将这些肺片放在预加的用于 OCT 的模具中，并把它们卡在干冰中。样品冷冻后，将样品储存在-80°C。
7. 使用低温机准备 8 μm 的 RV 和肺部分。空气干燥部分在室温下30分钟。
8. 使用 10% 的甲醛 （PFA） 在室温下固定幻灯片 10 分钟。
   注:PFA是已知的人类致癌物质。通过使用化学烟机罩、适当的程序和个人防护设备降低暴露风险。有关更多信息，请参阅材料安全数据表 （MSDS）。
9. 血氧林/Eosin染色的血管重塑评估
   注:进行血氧蛋白/Eosin染色，以评估心脏和肺血管重塑的结构变化（图3）。
   1. 用赤氧林溶液染色8分钟。
   2. 用自来水冲洗5分钟，然后用蒸馏水快速冲洗。
   3. 在 95% EtOH 中冲洗 1 分钟，在 Eosin 溶液中冲洗 1 分钟。
   4. 脱水（80%乙醇10-30秒，100乙醇1分钟和100%托洛尔3分钟）。
   5. 用盖玻片安装和盖上。在室温下将滑梯干燥过夜。
      注:用于染色的溶液可能很危险。通过使用化学烟机罩、适当的程序和个人防护设备降低暴露风险。有关更多信息，请参阅 MSDS。
10. 右心室纤维化评估由皮罗西里乌斯红染色
    注:在皮罗西里乌斯红染色，皮罗西里乌斯红，这是酸，结合胶原蛋白^12。因此，这种染色可用于组织学检查胶原蛋白含量。
    1. 在 58 °C 的预热 Bouin 溶液中孵育幻灯片 1 小时。
    2. 在自来水中清洗滑梯，从部分去除黄色 10-15 分钟。
    3. 在室温下，在 0.1% 快速绿色中染色 20 分钟。
    4. 用1%醋酸冲洗1分钟。
    5. 用自来水冲洗5分钟。
    6. 在室温下在 0.1% 天狼星中染色 30 分钟， 随后在托卢奥尔脱水。
       注意:用于染色的溶液可能很危险。通过使用化学烟机罩、适当的程序和个人防护设备降低暴露风险。有关更多信息，请参阅 MSDS。
11. RV心肌细胞肥大评估由WGA染色
    注:通过执行小麦胚芽 Agglutinin （WGA） 染色（图4），可以评估细胞水平上右心室 （RV） 的肥大。
    1. 在冷丙酮溶液中固定幻灯片 15 分钟，然后用 PBS 进行 3 步清洗（每步 5 分钟）。
    2. 在室温下用10%的山羊血清在Dako溶液中阻断30分钟。
    3. 用 WGA 孵育幻灯片:添加 WGA 1:200，在黑暗中 37 °C 下孵育 1 1/2 小时。
    4. 用 PBS 清洗幻灯片三次。
    5. 用核酸染料孵育幻灯片。
    6. 用 PBS 清洗幻灯片三次。
    7. 对于安装，去除多余的液体，并应用安装介质和盖玻片。在黑暗中室温下干燥滑梯1小时，并在4°C下储存。
       注:用于染色的溶液可能很危险。通过使用化学烟机罩、适当的程序和个人防护设备降低暴露风险。有关更多信息，请参阅 MSDS。
12. 对肺进行免疫化学，以进一步和具体评估血管重塑。例如，平滑的肌肉细胞染色可用于评估血管的肌肉化，而冯·威利布兰德因子染色可用于可视化内皮变化。这些方法在其它部分^描述。

结果

在该协议中，我们详细描述了低氧/SU5416模型的创建，该模型用于在小鼠中诱导PH。此外，我们详细介绍了在观察期结束时进行肺血管和心脏评估的所有必要步骤。

此模型的实验设计概述如图 1AA^{13，14,所示}。 Figure 1小鼠患有正常缺氧（10%O_2），并连续三周每周注射一次SU5416。图1B和1C中显示了本协议中用于诱导PH的刺激。

VEGF受体拮抗剂SU5416通过引起内皮细胞凋亡而作用，因此，允许凋亡耐内皮细胞的增殖。这导致血管重塑在肺血管和增加血管阻力^5。肺循环中压力升高会增加RV后负荷，并逐渐导致RV功能障碍和

讨论

该协议描述了如何通过结合两种病理刺激在小鼠的PH模型:慢性缺氧和SU5416注射（缺氧/SU5416）18¹⁸。为了试图将此鼠标模型与人类PH条件关联，不可避免地必须查看表1所示的当前PH分类。几乎所有形式的PH的特点是肺血管收缩和内皮细胞和平滑肌肉细胞的异常增殖。这导致肺动脉压力升高，从而增加右心室的后负荷。

每一次尝试描述PH动物模型应该包括肺血管和右心室的组织病理学重塑的证据。单击缺氧小鼠模型导致一种温和的血管重塑形式^22，3。3这些病理发现包括以前非肌肉化血管的肌肉化，伴有内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞增殖。这些发现由于增加了第二次打击（SU5416注射）而更加严重。效果在单击（缺氧）模型中是可逆的，在缺氧/SU5416模型中只有部分可逆。

PH患者的主要死因是右心室衰竭（RVF）4，20。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
醋酸冰川	Roth	3738.1
丙酮，组织学级	实验室仓库	VT110D
ADVantage 压力-体积系统	Transonic	ADV500
Bouin 溶液	Sigma	Ht10132
烧灼系统	精细科学工具	18000-00
连接管和阀门
棉头涂抹器	Covidien	8884541300
盖玻片，24 x50 毫米	Roth	1871
数据采集和分析	Emka	iox2
直接红 80	西格玛	365548-5G
DMSO（二甲基亚砜）	Sigma Aldrich	276855
干冰
Dumont # 5 镊子	精细科学工具	11251-10
Dumont # 7 精细镊子	精细科学工具	11274-20
包埋模具	Sigma Aldrich	E-6032
伊红溶液	Sigma	HT110216
乙醇水溶液，实验室级	Carolina Biological Supply Company	861285
Fast Green	FCF Sigma	F7252-5G
精细剪刀	精细科学工具	14090-09
山羊血清	invitrogen	16210-064
加热垫	盖玛	T / 泵
苏木精 2	Thermo Scientific	7231
低氧室	Biospherix	A30274P
诱导室	DRE 兽医	12570
插管导管（静脉导管 SurFlash （20 G x 1"） ）	Terumo	SR*FF2025
鸢尾剪刀	精细科学工具	14084-08
异氟醚	Baxter	NDC-10019-360-40
异氟醚蒸发器	DRE 兽医	12432
小鼠 （C57BL/6）	Charles River
针 25 G x 5/8"	BD	305122
OCT	Tissue Tek	4583
PBS（磷酸盐缓冲盐水）	康宁	21-031-CV
吡啶酸 - 饱和溶液 1.3 %	Sigma	P6744-1GA
压力体积导管	Transonic	FTH-1212B-4018
牵开器	Kent Scientific	SURGI-5001
静态氧控制器 ProOx 360	Biospherix	P360
SU 5416	Sigma Aldrich	S8442
外科缝合线，黑色编织丝，5.0	Surgical Specialties Corp.	SP116
手术胶带	3M	1527-1
注射器 10 ml	BD	303134
带针头注射器 1 ml	BD	309626
Sytox Green 核酸染料	Thermo Scientific	S7020
肌腱切开剪刀	Pricon	60-521
甲苯	Roth	9558.3
通风机	CWE	SAR-830/P
WGA Alexa Fluor	Thermo Scientific	W11261
二甲苯	Roth