上眼眶沟的可视化 斑马鱼 胚胎发生

摘要

本文介绍了一系列标准化的实验方案，用于观察新近发现的脊椎动物眼球中一种在进化上保守的结构——眼上沟。利用斑马鱼幼体，我们展示了识别参与眼上沟形成与闭合因素所必需的技术方法。

摘要

先天性眼裂畸形是一种遗传性疾病，通常表现为眼球下部因脉络膜裂闭合不全而形成的裂隙。近期，研究人员发现部分患者的虹膜、视网膜和晶状体上部出现裂孔，由此鉴定出一种新结构，称为上裂或眼上沟（superior ocular sulcus, SOS），该结构在脊椎动物眼球发育过程中短暂出现在视杯背侧。尽管这一结构在小鼠、鸡、鱼类和蝾螈中均保守存在，但目前对SOS的理解仍十分有限。为了阐明参与SOS形成与闭合的相关因素，必须能够观察该结构并识别其异常，例如SOS闭合延迟。本文旨在建立一套标准化实验流程，通过结合广泛可用的显微镜技术与常见的分子生物学方法（如免疫荧光染色和mRNA过表达），高效地可视化SOS。虽然本套方案主要聚焦于观察SOS闭合延迟的能力，但其可根据实验者的具体需求进行调整和修改。总体而言，我们希望提供一种易于实施的方法，推动对SOS的深入研究，从而拓展当前对脊椎动物眼球发育机制的认识。

引言

脊椎动物眼睛的形成是一个高度保守的过程，其中精确协调的细胞间信号通路建立起不同组织类型并确定区域身份¹。早期眼球形态发生的扰动会导致眼睛结构的严重缺陷，且常常导致失明²。其中一种疾病是由于视杯腹侧的脉络膜裂未能闭合所致³。这种称为眼裂畸形（ocular coloboma）的疾病估计每4,000至5,000例活产婴儿中就有1例发生，导致约3%至11%的儿童失明，通常表现为从眼球中心瞳孔下方突出的一个类似钥匙孔的结构^4,5,6。脉络膜裂的功能是为早期血管进入视杯提供通路，随后裂隙两侧融合，将血管包裹在内⁷。

尽管眼裂畸形自古以来就已为人所知，但最近我们发现了一类新的裂孔畸形患者，其眼部组织缺损主要影响眼睛的上方/背侧区域。我们实验室近期的研究在斑马鱼的眼部背侧发现了一种新的眼部结构，我们将其称为上方眼沟（superior ocular sulcus, SOS）或上方裂隙⁸。需要强调的是，该结构兼具沟（sulcus）和裂（fissure）的特征。与沟类似，它是一个连续的组织层，从鼻侧视网膜延伸至颞侧视网膜。此外，该结构的闭合并非由相对的两个基底膜融合介导，而是似乎需要通过细胞迁移填充该结构的形态发生过程。然而，与裂隙相似的是，它在基底膜处形成一个分隔背侧眼鼻侧与颞侧的结构。为保持一致性，本文中将统一使用SOS来指代该结构。

视杯开口（SOS）在脊椎动物中具有进化上的保守性，在鱼类、鸡、蝾螈和小鼠的眼部形态发生过程中均可观察到⁸。与在斑马鱼中从受精后20至60小时（hpf）持续存在的脉络膜裂不同，SOS具有高度瞬时性，在20至23 hpf期间易于观察，到26 hpf时即消失⁸。我们实验室最近的研究发现，与脉络膜裂类似，SOS在眼部形态发生过程中的血管导向中也发挥作用⁸。尽管目前对控制SOS形成和闭合的因子尚未完全阐明，但我们的数据确实揭示了背腹侧眼部模式形成相关基因在其中的重要作用⁸。

斑马鱼是研究视神经脊髓炎谱系疾病（SOS）的优良模式生物。作为一种模式系统，它在研究眼部发育方面具有多项优势：它是脊椎动物模型；每代具有较高的繁殖力（约200个胚胎）；其基因组已完全测序，便于进行遗传操作；并且大约70%的人类基因至少有一个斑马鱼直系同源基因，使其成为基于遗传学的人类疾病理想模型^9,10。最重要的是，其胚胎在母体外发育，且幼体透明，使得观察发育中的眼睛相对容易¹¹。

在本系列实验方案中，我们描述了可视化斑马鱼幼鱼中视杯裂（SOS）的多种技术。本报告所采用的多种可视化方法可实现对正常眼球发育过程中视杯裂的清晰观察，并能够检测视杯裂闭合缺陷。我们的示例方案将重点研究 Gdf6，这是一种定位于眼球背侧的 BMP 家族成员，已知可调控视杯裂的闭合过程。此外，这些技术还可与实验干预手段相结合，用于鉴定影响视杯裂正常形成与闭合的遗传因素或药理学因子。同时，我们还提供了一种可对所有细胞膜进行荧光成像的实验方案，使研究者能够观察视杯裂周围细胞的形态学变化。我们的目标是建立一套标准化的实验流程，供科学界广泛使用，从而为发育中眼球这一新颖结构的研究提供新的见解。

方案

本研究所述所有方法均已获得阿尔伯塔大学动物护理与使用委员会的批准。

1. 方案1：利用体视显微镜和微分干涉差（DIC）成像观察SOS

1. 胚胎收集
   1. 在去氯水中，于傍晚时将雄性斑马鱼与雌性斑马鱼配对，建立gdf6a^+/-斑马鱼的交配组合。务必使用隔板将雄鱼与雌鱼分隔开，以确保胚胎在较短时间内集中产出。
   2. 次日早晨，移除隔板，让斑马鱼交配不超过30分钟。用含有E3培养基的培养皿收集胚胎（E3培养基配方见《斑马鱼手册》¹²），并将培养皿置于28.5 °C的培养箱中。
   3. 去除未受精卵或死亡的胚胎，这些胚胎呈现白色且不透明。
2. 斑马鱼胚胎的制备与活体成像
   1. 在受精后20小时（20 hpf），将E3培养基更换为含有0.004% 1-苯基-2-硫脲（PTU）的E3培养基，以抑制色素生成。
      注：由于成像时胚胎仍处于早期发育阶段，在稍晚时间点（如22–24 hpf）添加PTU通常不会影响实验结果。但建议尽早处理胚胎，以完全防止色素沉积，因为背侧眼部会出现一条色素带，可能干扰对视杯裂（SOS）的成像观察。
   2. 在观察前的各个时间点，确认所有胚胎均处于正确的发育阶段。建议依据Kimmel等¹³所述的体节数目清晰可见的阶段进行判断，并剔除发育不成熟的胚胎。
   3. 将胚胎置于解剖显微镜下，用精细镊子轻轻撕开卵膜以去除绒毛膜。观察眼部背侧的视杯裂（SOS）。SOS可能表现为眼部背缘的一个凹陷，且在背侧眼区可见一条线状结构。对于正常的SOS闭合情况，应在约20–23 hpf时观察胚胎；若需检测SOS闭合延迟的表型，则应在28 hpf或更晚时间点进行观察。
   4. 将表现出SOS闭合延迟的胚胎与未表现出延迟的胚胎分离开。
   5. 若使用解剖显微镜拍摄这些胚胎，需准备一个含有1%琼脂糖（溶于E3培养基）的培养皿。用针尖轻轻刺破琼脂糖中心，形成一个浅坑，以便放置胚胎时其卵黄能嵌入其中，从而确保胚胎在拍摄时不会倾斜。
   6. 用含0.003%三卡因（tricaine）的E3培养基麻醉胚胎，并将其侧向放置于琼脂糖上。
   7. 若使用复合显微镜或共聚焦显微镜进行成像，将胚胎转移至含有少量未凝固的1%低熔点琼脂糖（溶于E3培养基，w/v）的35 mm培养皿中。使用细鱼线或睫毛迅速将胚胎调整至侧位，并等待琼脂糖冷却凝固。待琼脂糖完全凝固后，向培养皿中加入足量E3培养基以覆盖琼脂糖。更多细节请参见Distel和Köster¹⁴。
      注：若使用倒置显微镜，可将胚胎紧贴玻璃底培养皿的盖玻片表面放置，并使用标准20X物镜进行成像。
   8. 使用水浸式20倍物镜通过复合显微镜观察SOS。完成观察后，轻轻将琼脂糖从胚胎上剥离，随后用4%多聚甲醛（PFA）固定胚胎，或继续培养使其发育。

2. 方案2：层粘连蛋白的整体免疫荧光染色

1. 层粘连蛋白整体免疫荧光染色：第1天
   1. 如尚未完成，请按照步骤1.2.3所述方法去除胚胎的绒毛膜。将胚胎置于微量离心管中，用新鲜配制的4%多聚甲醛（PFA）在室温（22–25 °C）摇床上固定2小时。用1×PBST洗涤5分钟，共洗四次。
      注意：原肠胚形成之后，去绒毛膜后的胚胎可能固定效果更佳。
   2. 在室温下用10 µg/mL蛋白酶K处理胚胎5分钟以进行通透化。孵育时间取决于胚胎固定的发育阶段（参见Thisse和Thisse¹⁵）。
   3. 用1×PBST洗涤5分钟，共洗四次。
   4. 在含5%山羊血清和2 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）的1×PBST溶液中，于室温摇床上封闭胚胎1–2小时。
   5. 将兔抗层粘连蛋白一抗用封闭液按1:200比例稀释，配制一抗溶液。
   6. 将胚胎在4 °C摇床上与抗层粘连蛋白一抗孵育过夜。
2. 层粘连蛋白整体免疫荧光染色：第2天
   1. 用1×PBST洗涤15分钟，共洗五次。
   2. 将 goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 二抗用1×PBST按1:1000比例稀释，配制二抗溶液。
      注意：可根据实验人员可用资源选择其他二抗替代本步骤中的二抗。
   3. 将胚胎在4 °C摇床上与二抗孵育过夜。从此步骤开始，应尽可能避光操作。
   4. 用1×PBST洗涤15分钟，共洗四次。如有需要，胚胎可在4 °C保存最多一周。
3. 胚胎眼球的解剖与封片
   1. 如需要，将胚胎放入一个小培养皿中，在1×PBST中去除卵黄。使用精细镊子轻轻破坏卵黄，并通过轻柔刮擦卵黄囊去除卵黄细胞。
   2. 在微量离心管中配制以下浓度的PBS-甘油梯度溶液：30%、50%和70%甘油（溶于PBS中）。将胚胎转移至30%甘油/PBS溶液中，注意将胚胎置于液滴顶部，并尽可能减少前一溶液的带入。等待胚胎沉降至管底。
   3. 当胚胎完全沉降至底部后，将其转移至50%甘油/PBS溶液中。重复操作，再转移至70%甘油/PBS溶液中。
   4. 当胚胎在70%甘油/PBS中沉降后，将其转移至小型塑料培养皿中进行解剖。
   5. 在后脑之后切断胚胎，如有需要，取后部组织用于基因分型。
   6. 将头部转移至载玻片上，尽可能减少甘油的带入。使用镊子或其他精细解剖工具夹住头部后端以固定头部。使用精细的显微针或其他解剖工具从前部轻轻插入前脑室，并向下推动，以分离头部左右两半。沿中线向后移动，依次通过中脑并进入后脑室，实现沿中线剖开头部的操作。此方法可最大限度减少对眼球及周围组织的手动操作，从而保持视杯外侧结构（SOS）完整无损。
   7. 将头部两侧切面朝下、眼球朝上进行封片。在盖玻片四角位置放置四小滴真空脂（各点间距应与所用盖玻片大小相适应），盖上盖玻片，并依次轻压每个脂滴，使盖玻片与样品接触。从盖玻片边缘加入70%甘油，使甘油被毛细作用吸入，填充盖玻片与载玻片之间的空隙。
   8. 建议在一天内完成成像；或用指甲油密封盖玻片边缘，在指甲油完全干燥后再进行成像。样品应避光保存于4 °C。

3. 方案3：利用eGFP-CAAX mRNA可视化SOS

1. eGFP-CAAX mRNA的合成
   1. 线性化1 µg pCS2-eGFP-CAAX质粒¹⁶ 用NotI在37 °C下进行4小时的酶切反应，反应体系为40 µL。
   2. 为终止限制性酶切反应，加入10 µL无RNase水、2.5 µL 10% SDS和2.0 µL 10 mg/mL蛋白酶K。
   3. 50 °C 下孵育 1 小时。
   4. 向反应体系（总体积 200 µL）中加入以下成分，然后进行下一步操作：50 µL 无 RNase 水、20 µL 3 M 醋酸钠（pH 5.2）和 75.5 µL 无 RNase 水
      注意：分两次加入无RN酶水，以防止乙酸钠过度稀释。
2. 通过苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀纯化DNA
   1. 加入200 µL苯酚:氯仿:异戊醇，涡旋振荡20秒。在18,000 x g离心5分钟，分离水相与有机相。
   2. 将上层水相转移至新的微量离心管中，注意避免转移下层有机相。向新管中加入等体积的氯仿。
      注意：氯仿的添加为可选步骤，但建议添加以确保从样品中彻底去除苯酚。
   3. 涡旋20秒。在18,000 × g离心5分钟，分离水相和有机相。
   4. 与之前相同，将上层水相转移至新的微量离心管中，注意避免转移下层有机相。
   5. 加入1/10体积的3 M乙酸钠（pH 5.2）。
   6. 加入3倍体积的无RN酶的100%乙醇沉淀DNA，于-20 °C冷藏15分钟。在4 °C下以18,000 × g离心20分钟，应可见沉淀。弃去上清液。
   7. 用100 µL预冷的70%乙醇/RNase-free水洗涤沉淀。轻轻混匀以松动沉淀，然后在4 °C下以18,000 × g离心15分钟。应可见沉淀。弃去上清液。
   8. 将沉淀在空气中干燥5分钟，然后用7 µL水重悬DNA。
      注意：沉淀物的干燥时间可能需要超过5分钟，具体取决于可用的气流情况。
3. eGFP-CAAX mRNA的转录与纯化
   1. 以无 RNase 的方式，准备一个 体外 使用商业化的Sp6 RNA聚合酶试剂盒，以步骤3.2中获得的大约1 µg纯化线性化质粒DNA进行转录反应。在37 °C下孵育2小时。
      注意：必须使用 Sp6 RNA 聚合酶来制备带帽的 mRNA。
   2. 加入1 µL DNase（2 U/µL；无RNase），37 °C孵育30分钟。
   3. 使用任何市售的RNA纯化试剂盒纯化mRNA。将mRNA分装以避免反复冻融，并于-80 °C保存。
4. 注射与观察
   1. 按照方案1.1所述获取胚胎。
   2. 使用显微注射装置，在1细胞期注射300 pg的eGFP-CAAX mRNA。
   3. 使用荧光体视显微镜筛选眼睛部位 eGFP 表达明亮的胚胎。
   4. 按照方案1.2中所述对胚胎进行成像。
   5. 或者，在所需时间点用4% PFA在室温下固定4小时，或在4°C过夜。用1×PBST清洗胚胎，每次5分钟，共洗四次；若尚未去壳，则在此时去壳。按照方案2.3所述方法解剖眼睛并将其置于载玻片上。

结果

斑马鱼的视杯凹陷（SOS）在受精后20小时（hpf）出现在预定的背侧视网膜区域⁸。到23 hpf时，SOS从最初的狭窄结构转变为一个较宽的凹陷，到26 hpf时则不再可见⁸。因此，为了在正常斑马鱼眼部发育过程中观察SOS，必须在20–23 hpf之间观察胚胎。在此期间，可通过解剖显微镜和微分干涉差（DIC）成像观察到SOS，表现为眼部背侧一条细线，将发育中的视网膜鼻侧和颞侧两半部分隔开（图1）。此外，眼部背侧边界可能可见轻微的凹陷（图1）。经层粘连蛋白免疫荧光染色后，可确认该细线为基底膜（图1）。

为了研究导致视泡闭合延迟的分子通路，我们选择在受精后28小时（28 hpf）观察胚胎...

讨论

本文介绍了一系列标准化的实验方案，用于观察斑马鱼胚胎发育过程中的视杯裂（SOS）。为了确定闭合延迟表型，我们的实验方案重点在于能够区分眼背侧鼻侧与背侧颞侧两个独立叶状结构的分离情况，类似于用于观察眼腹侧脉络膜裂闭合延迟表型的可视化技术。

这些可视化技术可与多种基因操作技术联合使用，以研究抑制或诱导特定基因表达对视泡闭合（SOS）过程的影响，进而分析这些基因在其中所起的作用。我们选择以gdf6a^-/-胚胎为例来演示这些实验方案，因为我们先前已证实其缺失会影响SOS的正常闭合；但这些方案也可根据需要用于研究任何其他基因表达调控所产生的效应。建议首先通过体视显微镜观察，对眼部背侧的形态学变化进行初步研究。只有在明确建立初步关联后，再使用其他技术，因为这些技术耗时更长且通量较低。

尽管实验方案可根据研究者的需求进行适当调整，但有几个关键环节必须严格遵守。由于该结构具有短暂性，必须确保所观察的胚胎处于相同的发育阶段。在我们的研究中，我们发现仅允许较短的交配时间，并在早期发育过程中定期对胚胎进行分选...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-苯基-2-硫脲	Sigma Aldrich	P7629-10G
100 mm 培养皿	Fisher Scientific	FB0875713
35 mm 培养皿	Corning	CLS430588
琼脂糖	BioShop Canada Inc.	AGA001.1
牛血清白蛋白	Sigma Aldrich	A7906-100G
DIC/荧光显微镜	Zeiss	AxioImager Z1
解剖显微镜	Olympus	SZX12
解剖显微镜相机	Qimaging	MicroPublisher 5.0 RTV
道康宁高真空润滑脂	Fisher Scientific	14-635-5D
氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（Tricaine）	Sigma Aldrich	A5040-25G
山羊抗兔 Alexa Fluor 488	Abcam	ab150077
山羊血清	Sigma Aldrich	G9023
图像采集软件	Zeiss	ZEN
培养箱	VWR	Model 1545
显微镜盖玻片（22 mm × 22 mm）	Fisher Scientific	12-542B
显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-544-2
显微操作针（Minutien pin）	Fine Science Tools	26002-10
mMessage mMachine Sp6 转录试剂盒	Invitrogen	AM1340
NotI	New England Biolabs	R0189S
多聚甲醛（PFA）	Sigma Aldrich	P6148-500G
苯酚:氯仿:异戊醇 pH 6.7 ± 0.2	Fisher Scientific	BP1752-100
蛋白酶K	Sigma Aldrich	P4850
兔抗层粘连蛋白抗体	Millipore Sigma	L9393
TURBO Dnase（2 U/µL）	Invitrogen	AM2238
超纯低熔点琼脂糖	Invitrogen	16520-100
UltraPure 十二烷基硫酸钠（SDS）	Invitrogen	15525017