本文介绍了一系列标准化的实验方案，用于观察新近发现的脊椎动物眼球中一种在进化上保守的结构——眼上沟。利用斑马鱼幼体，我们展示了识别参与眼上沟形成与闭合因素所必需的技术方法。
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本文内容
摘要
摘要
先天性眼裂畸形是一种遗传性疾病，通常表现为眼球下部因脉络膜裂闭合不全而形成的裂隙。近期，研究人员发现部分患者的虹膜、视网膜和晶状体上部出现裂孔，由此鉴定出一种新结构，称为上裂或眼上沟（superior ocular sulcus, SOS），该结构在脊椎动物眼球发育过程中短暂出现在视杯背侧。尽管这一结构在小鼠、鸡、鱼类和蝾螈中均保守存在，但目前对SOS的理解仍十分有限。为了阐明参与SOS形成与闭合的相关因素，必须能够观察该结构并识别其异常，例如SOS闭合延迟。本文旨在建立一套标准化实验流程，通过结合广泛可用的显微镜技术与常见的分子生物学方法（如免疫荧光染色和mRNA过表达），高效地可视化SOS。虽然本套方案主要聚焦于观察SOS闭合延迟的能力，但其可根据实验者的具体需求进行调整和修改。总体而言，我们希望提供一种易于实施的方法，推动对SOS的深入研究，从而拓展当前对脊椎动物眼球发育机制的认识。
引言
脊椎动物眼睛的形成是一个高度保守的过程，其中精确协调的细胞间信号通路建立起不同组织类型并确定区域身份1。早期眼球形态发生的扰动会导致眼睛结构的严重缺陷，且常常导致失明2。其中一种疾病是由于视杯腹侧的脉络膜裂未能闭合所致3。这种称为眼裂畸形（ocular coloboma）的疾病估计每4,000至5,000例活产婴儿中就有1例发生，导致约3%至11%的儿童失明，通常表现为从眼球中心瞳孔下方突出的一个类似钥匙孔的结构4,5,6。脉络膜裂的功能是为早期血管进入视杯提供通路，随后裂隙两侧融合，将血管包裹在内7。
尽管眼裂畸形自古以来就已为人所知，但最近我们发现了一类新的裂孔畸形患者，其眼部组织缺损主要影响眼睛的上方/背侧区域。我们实验室近期的研究在斑马鱼的眼部背侧发现了一种新的眼部结构，我们将其称为上方眼沟（superior ocular sulcus, SOS）或上方裂隙8。需要强调的是，该结构兼具沟（sulcus）和裂（fissure）的特征。与沟类似，它是一....
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方案
本研究所述所有方法均已获得阿尔伯塔大学动物护理与使用委员会的批准。
1. 方案1：利用体视显微镜和微分干涉差（DIC）成像观察SOS
- 胚胎收集
- 在去氯水中，于傍晚时将雄性斑马鱼与雌性斑马鱼配对，建立gdf6a+/-斑马鱼的交配组合。务必使用隔板将雄鱼与雌鱼分隔开，以确保胚胎在较短时间内集中产出。
- 次日早晨，移除隔板，让斑马鱼交配不超过30分钟。用含有E3培养基的培养皿收集胚胎（E3培养基配方见《斑马鱼手册》12），并将培养皿置于28.5 °C的培养箱中。
- 去除未受精卵或死亡的胚胎，这些胚胎呈现白色且不透明。
- 斑马鱼胚胎的制备与活体成像
- 在受精后20小时（20 hpf），将E3培养基更换为含有0.004% 1-苯基-2-硫脲（PTU）的E3培养基，以抑制色素生成。
注：由于成像时胚胎仍处于早期发育阶段，在稍晚时间点（如22–24 hpf）添加PTU通常不会影响实验结果。但建议尽早处理胚胎，以完全防止色素沉积，因为背侧眼部会出现一条色素带，可能干扰对视杯裂（SOS）的成像观察。 - 在观察前的各个时间点，确认所有胚胎均处于正确的发育阶段。建议依据Kimmel等13....
- 在受精后20小时（20 hpf），将E3培养基更换为含有0.004% 1-苯基-2-硫脲（PTU）的E3培养基，以抑制色素生成。
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结果
斑马鱼的视杯凹陷（SOS）在受精后20小时（hpf）出现在预定的背侧视网膜区域8。到23 hpf时，SOS从最初的狭窄结构转变为较宽的凹陷，而在26 hpf时则不再可见8。因此，为了在正常斑马鱼眼部发育过程中观察SOS，必须在受精后20至23小时之间观察胚胎。在此期间，可通过解剖显微镜和微分干涉差（DIC）成像在背侧眼部观察到一条细线，该细线将发育中的视网膜的鼻侧和颞侧两部分分开（图1）。此外，眼部背侧边界可能可见轻微的凹陷（图1）。经层粘连蛋白免疫荧光染色后，可确认该细线为基底膜（图1）。
为了研究导致视泡闭合延迟的分子通路，我们选择在受精后28小时（28 hpf）观察胚胎，因为.......
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讨论
本文介绍了一系列标准化的实验方案，用于观察斑马鱼胚胎发育过程中的视杯裂（SOS）。为了确定闭合延迟表型，我们的实验方案重点在于能够区分眼背侧鼻侧与背侧颞侧两个独立叶状结构的分离情况，类似于用于观察眼腹侧脉络膜裂闭合延迟表型的可视化技术。
这些可视化技术可与多种基因操作技术联合使用，以研究抑制或诱导特定基因表达对视泡闭合（SOS）过程的影响，进而分析这些基因在其中所起的作用。我们选择以gdf6a-/-胚胎为例来演示这些实验方案，因为我们先前已证实其缺失会影响SOS的正常闭合；但这些方案也可根据需要用于研究任何其他基因表达调控所产生的效应。建议首先通过体视显微镜观察，对眼部背侧的形态学变化进行初步研究。只有在明确建立初步关联后，再使用其他技术，因为这些技术耗时更长且通量较低。
尽管实验方案可根据研究者的需求进行适当调整，但有几个关键环节必须严格遵守。由于该结构具有短暂性，必须确保所观察的胚胎处于相同的发育阶段。在我们的研究中，我们发现仅允许较短的交配时间，并在早期发育过程中定期对胚胎进行分选.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由加拿大卫生研究院（CIHR）、自然科学与工程研究理事会（NSERC）、阿尔伯塔创新技术未来基金会（Alberta Innovates Technology Futures）以及妇女与儿童健康研究所（WCHRI）提供资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1-苯基-2-硫脲 | Sigma Aldrich | P7629-10G | |
| 100 mm 培养皿 | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 35 mm 培养皿 | Corning | CLS430588 | |
| 琼脂糖 | BioShop Canada Inc. | AGA001.1 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| DIC/荧光显微镜 | Zeiss | AxioImager Z1 | |
| 解剖显微镜 | Olympus | SZX12 | |
| 解剖显微镜相机 | Qimaging | MicroPublisher 5.0 RTV | |
| 道康宁高真空润滑脂 | Fisher Scientific | 14-635-5D | |
| 氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（Tricaine） | Sigma Aldrich | A5040-25G | |
| 山羊抗兔 Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150077 | |
| 山羊血清 | Sigma Aldrich | G9023 | |
| 图像采集软件 | Zeiss | ZEN | |
| 培养箱 | VWR | Model 1545 | |
| 显微镜盖玻片（22 mm × 22 mm） | Fisher Scientific | 12-542B | |
| 显微镜载玻片 | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| 显微操作针（Minutien pin） | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| mMessage mMachine Sp6 转录试剂盒 | Invitrogen | AM1340 | |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | |
| 多聚甲醛（PFA） | Sigma Aldrich | P6148-500G | |
| 苯酚:氯仿:异戊醇 pH 6.7 ± 0.2 | Fisher Scientific | BP1752-100 | |
| 蛋白酶K | Sigma Aldrich | P4850 | |
| 兔抗层粘连蛋白抗体 | Millipore Sigma | L9393 | |
| TURBO Dnase（2 U/µL） | Invitrogen | AM2238 | |
| 超纯低熔点琼脂糖 | Invitrogen | 16520-100 | |
| UltraPure 十二烷基硫酸钠（SDS） | Invitrogen | 15525017 |
参考文献
- Chow, R. L., Lang, R. A. Early eye development in vertebrates. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, (2001).
- Slavotinek, A. M. Eye development genes and known syndromes. Molecular Genetics and Metabolism. 104 (448-456), (2011).
- Gr....
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重印与许可
