基于显微注射的禽类胚胎体内植入胚胎心肌细胞系统

摘要

该方法中，胚胎心脏组织经过显微手术分离、解离、荧光标记后，植入宿主胚胎组织。这为研究异位血流动力学条件下和/或改变的旁分泌/邻近分泌环境下的细胞或组织水平发育调控提供了平台。

摘要

解析细胞自主性模式形成与外部微环境影响在细胞谱系决定中的相对作用，是发育生物学研究中普遍面临的挑战。在胚胎心脏中，这一问题尤为复杂，因为转录调控因子的区域差异性表达、旁分泌/邻近分泌信号提示以及血流动力学力等因素均已被证实会影响心肌细胞的成熟过程。因此，若能建立一种简化的方法来改变发育中心肌细胞的分子与生物力学微环境，将为研究局部条件如何影响细胞命运与功能提供强有力的技术手段。为解决这一问题，我们优化了一种将幼年心肌细胞物理移植至心脏内异位位置或周围胚胎组织中的方法。该方法使我们能够在完整胚胎内以单细胞分辨率研究微环境条件对心肌细胞命运转变的影响。本文中，我们描述了一种实验方案：可从心脏不同亚区域分离胚胎心肌细胞，经解离、荧光标记后，高精度地显微注射至宿主胚胎中。随后可利用多种成像与组织学技术对移植细胞进行原位直接分析。该方案是对传统组织移植实验的有力替代，而传统方法在心脏这类动态组织中往往难以实施。本方法的基本框架还可适用于多种供体组织与宿主环境，其操作简便、成本低且速度快，有望成为多种发育研究中的实用工具。

引言

心脏发育研究极大地受益于种系转基因模型系统的出现，这些系统已鉴定出许多调控心脏中不同细胞谱系和功能区域的基因调控网络。然而，要明确这些基因网络如何与微环境条件相互作用并对其作出响应（包括旁分泌/邻近细胞信号以及生物物理输入，如牵张、应变和血流动力学流动）仍具有挑战性。因此，通常难以判断细胞表型的出现是基因扰动的直接结果，还是对心脏生物力学或更高层次组织结构变化适应的继发性结果^1,2。

移植实验传统上被用于研究命运决定、定型、诱导和感受态等概念^3,4，是解决心脏中细胞自主性与环境影响之间区分难题的理想方法。然而，心脏的节律性收缩使得标准的移植技术难以实施。组织的快速运动常常导致移植细胞无法黏附于心脏，而常规移植所需的较大组织穿刺又常引发心脏衰竭和胚胎致死^5,6,7。因此，我们开发了一种基于压力的显微注射系统，可实现向发育中鸡胚心脏的精确细胞植入，从而克服了前述组织移植中的技术障碍^8,9。利用该技术，可将来自供体胚胎的单个或少量心脏细胞显微注射至受体胚胎心脏的多种区域，无需复杂的受体预处理，也避免了标准移植技术所造成的大面积组织损伤。本研究中使用的显微注射针外径约为 ~30−40 µm，可直接插入靶组织（即穿透胚胎心肌壁），实现细胞的局灶性递送，同时对周围组织造成最小损伤。该方案可用于开展多种同位、异位、等容和异时性操作，为直接研究四腔心脏发育过程中的经典实验胚胎学范式提供了一种快速、灵活且低成本的方法。

在以下方案中，我们使用一种可穿透细胞的荧光染料对供体细胞进行标记，从而能够在显微注射实验过程中实时监测实验是否成功，并在无需额外染色的情况下记录移植细胞的位置。但需要注意的是，该方法最适合短期实验（约48小时），因为荧光染料可能在细胞分裂过程中逐渐丢失。对于长期实验，可采用其他替代方法。

尽管我们是在心脏发育的背景下介绍这一技术，但我们已将其成功应用于中胚层、头部、四肢和体节的细胞移植实验。因此，下文所述的基本方法具有很高的可行性，可适用于多种器官系统。

方案

所有所述方法均遵守北卡罗来纳大学教堂山分校的动物护理指南。

1. 显微注射移液管的制备

1. 使用微移液管拉制仪拉制玻璃毛细管。对于某些注射操作，建议对针尖进行斜面打磨，因其可提供一个无结构杂质的极锐利表面。为此，将拉制好的针尖在斜面打磨轮上以45°角打磨15−20分钟。
   注意：拉制的具体参数设置将根据所使用的拉制仪型号而有所不同。斜面的最终内径应在20−40 µm之间。
2. 用硅酮对玻璃毛细管的内表面和外表面进行涂层处理。首先将针头浸入硅烷化试剂中，以涂覆针头的外表面，然后将硅烷化试剂溶液反向装入各微移液管中，以涂覆其内表面。
   注意：玻璃毛细管的涂层处理应在植入实验前24小时完成。用硅酮对玻璃毛细管进行涂层可使其表面具有化学惰性。若毛细管未经处理，后续步骤中制备的细胞悬液会黏附于玻璃表面，导致针头堵塞。因此，涂层处理对该方法的成功至关重要。
   警告：硅烷化试剂是一种市售的预混制剂，成分为庚烷和1,7-二氯-1,1,3,3,5,5,7,7-八甲基四硅氧烷（材料表）。该试剂极易燃且具有急性毒性。操作时务必在通风橱内佩戴适当的个人防护装备（PPE）。
   1. 为反向装填针头，将约5−10 µL硅烷化试剂吸入微量注射用移液管尖端（材料表）。将该移液管尖端插入拉制好的玻璃毛细管的宽口端，并尽可能深入放置（靠近玻璃针尖端）。在缓慢抽出装填移液管的同时推出硅烷化试剂，以尽量减少针管内气泡的产生。
   2. 让硅烷化试剂在玻璃针头中停留10分钟，然后用新的装填移液管将其吸出，并将针头置于通风橱中过夜干燥。
3. 实验当天早晨，按照步骤1.2的操作流程，用去离子水冲洗玻璃毛细管，并使其干燥3−4小时。

2. 溶液的配制

1. 通过将4.2 mL的杜氏改良伊格尔培养基与汉姆F12营养混合物（DMEM/F12）与750 µL胎牛血清（FBS）和50 µL青霉素/链霉素混合，配制5 mL胰蛋白酶中和液。使用前于37 °C保存。
2. 用移液器将5 µL 1 mM标记染料储备液（溶于二甲基亚砜[DMSO]，材料表）加入995 µL汉克斯平衡盐溶液（HBSS）中，配制5 µM标记染料溶液。涡旋混匀1分钟，使用前于37 °C保存。
3. 通过将10 mL 32%的多聚甲醛（PFA）储备液与62 mL分子生物学级水和8 mL 10倍浓度杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）混合，新鲜配制多聚甲醛溶液。最终浓度为含1倍浓度DPBS的4% PFA。

3. 宿主胚胎的制备

1. 将受精的鸡卵置于加湿孵育箱中，38 °C 条件下水平孵化，直至达到汉伯格-汉密尔顿（Hamburger and Hamilton，HH）19 期¹⁰.
   注意：操作所选的时期具有灵活性，完全取决于各个实验的具体目标。
2. 划线 "扁平" 使用斜角镊子沿卵的赤道线在卵壳末端打一个小孔 >直径1 mm。将连接10 mL注射器的18 G针头插入穿刺点，抽出约5 mL白蛋白。
   注意：此解剖位置位于体外 "气室" 在卵内形成保护层，防止穿刺后卵白泄漏。建议执行此步骤，因为它 "滴" 将胚胎与卵壳分离，以防止后续步骤中可能造成的损伤。
3. 用透明胶带贴在蛋壳顶部，用有角度的镊子划痕，再用弯头肌腱剪切出一个约2.5 cm的窗口。
4. 根据汉伯格和汉密尔顿建立的标准对胚胎进行观察和分期¹⁰ 用透明胶带密封步骤3.2中的穿刺孔。
   注意：此处使用的是具有37−40个体节并延伸至尾芽的HH 19期胚胎。在沿蛋壳顶部打开窗口之前（步骤3.3），不应封闭穿刺孔。
5. 使用带有1 mL注射器的32 G针头，将约200 µL印度墨水与HBSS的混合液（1:5）注射至胚胎下方。
   注意：印度墨水可提供胚胎与下方卵黄之间的视觉对比。也可使用其他染料，如中性红，或市售的青色荧光蛋白（CFP）或蓝色荧光蛋白（BFP）荧光滤光片组，以增强对比度。
6. 将1 mL HBSS逐滴加入胚胎盘，用石蜡膜密封开窗的蛋壳。将鸡蛋放回湿润的培养箱中，直至准备注射。

4. 供体组织的分离

1. 将供体的受精鸡卵置于38 °C的湿润培养箱中孵育，直至达到HH 19期（或所需发育阶段）。
2. 从卵中取出胚胎，并置于含有无菌HBSS的100 mm × 15 mm培养皿中，室温（RT）下放置。
3. 在体视解剖显微镜下，使用镊子、肌腱剪和微型刮匙，通过显微手术分离每个胚胎的心房供体组织：首先将整个胚胎心脏从胚胎中分离出来，再将心房从心脏中分离。将组织收集至一个无菌的1.5 mL微量离心管中，管内含1 mL HBSS，并置于冰上。
4. 待所有供体组织收集完毕后，在4 °C条件下，使用固定角转子微量离心机以1000 × g 离心5分钟，使组织沉淀。

5. 供体组织的胰蛋白酶消化

1. 将细胞沉淀重悬于1 mL预热的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液中，在37 °C、300 rpm的振荡加热模块中孵育15分钟。或者，可使用水浴并定期振荡样品。
2. 用移液器反复吹打消化液以分散任何残留组织，然后按步骤4.4进行离心收集沉淀。
3. 将沉淀重悬于1 mL胰蛋白酶中和液中，并按步骤4.4进行离心。
4. 将细胞重悬于400 µL红色荧光标记染料溶液中，在加热模块中37 °C孵育20分钟。或者，可使用水浴。
5. 标记反应完成后，按步骤4.4离心收集细胞，并用1 mL HBSS洗涤（洗涤次数可在1至3次之间调整）。
6. 将标记后并离心收集的细胞重悬至浓度约为50,000个细胞/µL，通常根据总细胞产量得到5−10 µL的工作体积。
   注意：细胞浓度低于约50,000个细胞/µL可能导致注射效率降低。

6. 体内注射

1. 按照步骤1.2中的操作，将细胞悬液回装至经硅化处理的玻璃毛细移液管中。将移液管安装到压力显微注射装置上。
2. 从加湿培养箱中取出宿主胚胎，并将其置于荧光体视显微镜下的蛋固定装置中。
   1. 使用无菌精细镊子打开卵黄膜，并在心包膜上制造一个小切口（长度约0.5−1.0 mm）。根据注射靶区域的不同，可能需要进行额外的操作或解剖。
3. 调整显微注射装置的位置，使显微注射针的尖端穿透目标组织。
   1. 施加压力注射细胞，并利用荧光标记确认植入的细胞已位于目标组织中。对于常规注射，采用持续时间小于0.5秒的单次脉冲，压力范围为100–400百帕。
      注意：脉冲时长和绝对压力需根据待注射细胞数量进行调整，可依据个体需求优化。
   2. 完成压力注射后，撤回显微注射装置，并将蛋从固定装置中取出。
4. 向胚胎上逐滴加入1 mL预热的HBSS，用透明封箱胶带密封蛋体，并在38 °C加湿培养箱中继续孵育24小时。

7. 分离与分析

1. 使用镊子、肌腱剪和微型刮匙，在室温下用HBSS分离宿主胚胎，操作步骤类似于4.3步，并在4°C下用4%多聚甲醛（PFA）轻轻振荡固定过夜。
2. 在室温下用HBSS轻轻振荡洗涤胚胎3次，每次5分钟，随后将胚胎保存在4°C的HBSS中，用于后续下游分析（显微成像、免疫组织化学、原位杂交等）。

结果

经过24小时孵育后，分离宿主胚胎的心脏及周围组织，拍照（图1A），并进行免疫荧光分析。在此示例中，将供体心房心肌细胞显微注射至发育阶段相似的宿主胚胎的生心外膜。随后用肌细胞标记物（MF20，绿色）和4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI；蓝色）对宿主胚胎进行染色。注射的细胞（红色）清晰可见（图1B）。如果细胞不可见，可能需要考虑的调整因素包括：供体组织消化过度（导致细胞无法附着）、标记染料溶液过于稀释、细胞洗涤过度，或因多次细胞分裂导致荧光标记丢失。

为了确认本示例中注射的细胞为心肌细胞，我们使用共聚焦显微镜对该胚胎进行了光学切片（图1C-E）。在心外膜前体区（PE）内，唯一呈MF20阳性的细胞是局灶性植入的荧光红色阳性细胞。

图1：注射后24小时分离胚胎的代表性图像。（A）E3.5（HH 19期）鸡胚躯干区域的低倍明场图像。（B）合并图像，显示注射的细胞（红色）、心肌细胞（绿色）和DAPI染色结果。细胞来源于心房，并被微量注射至心外膜前体区域。（C）高倍共聚焦成像，显示标记细胞位于心外膜前体区域的核心。（D）高倍共聚焦成像，证实CT Red标记的细胞为心肌细胞。（E）由图D和E图像生成的注射细胞的三维（3D）重建图。At，心房；OFT，流出道；PE，心外膜前体；Vt，心室；MF20，Myosin 4。请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

明确微环境条件如何影响心脏细胞命运决定及谱系稳定，对于全面理解先天性心脏病以及开发高效的干细胞或体细胞重编程来源心肌细胞的成熟方案至关重要。上述方案使研究者能够直接检测在改变的体内条件下心脏细胞的发育过程，从而将细胞自主的成熟过程与旁分泌/邻近分泌信号和（或）血流动力学刺激分离开来。当该技术与高分辨率成像、遗传分析和生理学检测相结合时，可作为现有转基因模型的有力补充。

从技术角度来看，本方案依赖于高效地分离、标记供体心肌细胞，并将其精确植入宿主胚胎组织。使用显微注射系统可显著提高供体细胞的靶向准确性，能够在无需在宿主组织中创建较大移植位点的情况下实现成功植入。然而，该技术需要一定的操作技巧，若注射针未能准确置入目标组织，可能导致心脏或局部血管破裂，从而降低细胞存活率。在细胞分离与标记步骤中也需格外谨慎并加以周密考虑。供体组织消化过度会降低移植效率，而瞬时标记技术则可能限制对供体细胞追踪的时间窗口（因为细胞分裂会稀释标记信号）。

该技术具有高度可变性，可针对多种用途进行调整。例如，可从多种组织和发育阶段中分离供体细胞（尽管需要优化酶消化条件），并同样可将其注射到不同发育阶段的多种宿主组织中。类似地，细胞标记方法也可进行修改，以在不同的时间窗口内追踪细胞，包括使用荧光无机半导体纳米晶体进行较长时间的瞬时标记，或移植鹌鹑细胞或绿色荧光蛋白转基因（GFP+）供体胚胎的细胞进行永久性标记¹¹。

尽管目前我们将该技术用于鸟类植入研究，但我们认为未来它也可广泛应用于多种嵌合体研究。例如，可分离转基因生物中经基因改造的心脏细胞，并采用非常相似的方案将其显微注射到鸟类心脏中。此外，还可将干细胞分化或体细胞重编程方法获得的心肌细胞显微注射至胚胎心脏，以评估这些细胞在组织中的整合能力，以及在体内生物力学条件下成熟的能力。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 胰岛素注射器	BD	329654
1.7 mL 微量离心管，透明	Genesee Scientific	24-282
10 ml 注射器	BD	305482
1000ul 带滤芯吸头，盒装，无菌	Genesee Scientific	24-430
15 mL 离心管，带架	Genesee Scientific	28-101
1588 Genesis Hova-Bator 培养箱	GQF	813927021221
18G × 1 1/2 针头	BD	305196
200ul 低吸附带滤芯吸头，盒装，无菌	Genesee Scientific	24-412
32G × 1/2" 针头	TSK Steriject Air-Tite	TSK3213
70% 酒精棉片	Thermo Fisher Scientific	19015744
弯头镊子	Fine Scientific Tools	11260-20
反向加样吸头	Eppendorf	930001007
黑色印度墨水	KOH-I-NOOR	3084-F
CellTracker Green CMF	Thermo Fisher Scientific	C7025	1 mM 溶于 DMSO
CellTracker Red CMTPX	Thermo Fisher Scientific	C34552	1 mM 溶于 DMSO
离心机	Eppendorf	5424R
商用级封箱胶带	Staples	2619001
弯头肌腱剪	Fine Scientific Tools	14067-11
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	11330-032
无水 DMSO	Thermo Fisher Scientific	D12345
DPBS (10X)，不含钙，不含镁	Thermo Fisher Scientific	14025092
Femtojet 4i	Eppendorf	5252000021
胎牛血清	Thermo Fisher Scientific	10437-028
孵化用鸡蛋	Pilgrim's Hatchery	--
HBSS，含钙、镁，不含酚红	Thermo Fisher Scientific	14025-092
Injectman 4	Eppendorf	5192000027D
显微操作仪	Leica Microsystems	--
Parafilm 封口膜	SIGMA	P6543-1EA
32% 甲醛水溶液，电镜级	VWR	100496-496
青霉素/链霉素	Thermo Fisher Scientific	15140-022
培养皿	Genesee Scientific	32-107
移液管研磨器	Narishige	EG-44
移液管拉制仪	HEKA	PIP 6
Scotch 透明胶带	Staples	487909
Sigmacote 表面处理剂	SIGMA	SL2-25ML
体视显微镜	Leica	--
ThermoMixer C 恒温混匀仪	Eppendorf	5382000023
薄壁玻璃毛细管	World Precision Instruments	TW100F-4
移液管	Thermo Fisher Scientific	273
胰蛋白酶-EDTA (0.05%)，含酚红	Thermo Fisher Scientific	25300-054