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方法文章

电泳递送γ-氨基丁酸（GABA）至癫痫灶可预防小鼠癫痫发作

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DOI：

10.3791/59268

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2019年5月16日

 ,  ,  ,  , 
1Aix Marseille Université, Institut de Neurosciences des Systèmes (INS), 2Electrical Engineering Division, University of Cambridge, 3Department of Bioelectronics, Centre Microélectronique de Provence - Ecole Nationale Supérieure des Mines de Saint-Étienne (CMP-EMSE), 4Institut de Neurosciences de la Timone, Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) UMR 7289 & Aix- Marseille Université, 5Neuroengineering Research Group, Interdisciplinary Excellence Center, Department of Medical Microbiology and Immunobiology, University of Szeged

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

癫痫研究的挑战在于为经典疗法效果不佳的患者开发新型治疗方法。通过采用一种新方案——借助可植入式药物递送系统——我们能够通过电渗法将GABA递送至癫痫灶，从而在麻醉小鼠中控制癫痫发作。

摘要

癫痫是一组影响全球数百万人的神经系统疾病。尽管药物治疗对70%的患者有效，但严重的副作用会影响患者的生活质量。此外，有相当高比例的癫痫患者对药物耐受，在这些患者中，需要采用神经外科手术或神经刺激疗法。因此，癫痫研究的主要目标是发现新的治疗方法，这些方法要么能够无副作用地治愈癫痫，要么能够预防药物耐受患者的反复发作。神经工程学通过采用新颖的策略和技术，为治疗高风险癫痫患者提供了新的途径。

为了展示一种在急性癫痫小鼠模型中的新型实验方案，采用了一种直接的原位电泳药物递送系统。具体而言，植入一种集成了微流控离子泵（µFIP）的神经探针，可按需递送药物并同时记录局部神经活动，证明该系统能够调控由4-氨基吡啶（4AP）诱导的类癫痫发作（SLE）活动。通过精确控制γ-氨基丁酸（GABA）的递送，使其浓度维持在生理范围内，从而在癫痫灶内实现抗癫痫效应，同时避免因过度抑制引发的反跳性爆发。该方法既可检测病理性的神经活动，又能通过在空间和时间上精确控制，将抑制性神经递质直接递送至癫痫灶，以干预并终止癫痫发作。

由于实验方法的发展，SLE 可以以高度局部化的方式诱导，从而通过在癫痫发作起始时精确调节 GABA 的递送来控制癫痫发作。

引言

癫痫是第四大常见的神经系统疾病：约有1%的人口患有癫痫，其中约三分之一的患者会反复发作。大多数情况下，癫痫发作可通过药物控制。然而，药物治疗需要为每位患者单独制定方案，找到合适的剂量可能需要数年时间1,2。此外，大多数药物具有严重的副作用，会降低患者的生活质量3,4,5,6,7。最后，在30%的病例中，患者对药物治疗具有耐药性，而对于存在持续单一癫痫灶的患者，唯有通过切除性神经外科手术才能减少癫痫发作的频率8。因此，现代癫痫研究的一项重要目标是探索新的策略，以预防高危患者的反复发作，同时减少对强效药物治疗和侵入性切除手术的依赖。

癫痫发作是由于大脑广泛区域（全面性癫痫）或局部区域（局灶性癫痫）的兴奋性与抑制性神经回路之间出现失衡，导致神经元异常放电所致9,10,11。抗癫痫药物可通过两种不同机制预防癫痫发作：降低兴奋性或增强抑制性12。具体而言，这些药物可通过影响细胞膜上的离子通道来调节神经元细胞的电活动13，或通过作用于突触中的抑制性神经递质GABA或兴奋性神经递质谷氨酸，影响神经元之间的化学传递14,15。对于某些药物，其作用机制尚不明确18。此外，药物治疗对患者具有持续性作用，无法适应癫痫发作频率的动态变化。理想情况下，具有特异性作用机制的药物应针对癫痫发生的根本病理过程。最佳治疗方式应在发作间期不对大脑产生影响，仅在癫痫发作启动时立即发挥作用。然而目前在所有类型的癫痫治疗中，药物治疗均为系统性干预，影响患者的整个大脑及全身9。

在初始损伤（如脑外伤）发生多年后，可能会出现癫痫发作。从初始损伤到首次自发性癫痫发作出现之间的时期，伴随着显著的分子和细胞水平重组过程，包括神经元死亡导致神经网络连接消失，以及轴突 sprouting/新生突触形成（neosynaptogenesis）带来新连接的出现19,20,21。一旦癫痫发作变为反复发作，其频率和严重程度往往逐渐增加，并累及更多的脑区。区分癫痫发作起始部位（致痫区）与发作传播网络至关重要，因为发作的产生机制和传播机制可能遵循不同的规律。针对人类脑组织及癫痫实验模型的研究，已为神经环路重组及其产生癫痫发作的能力提供了重要数据20,21,22,23。然而，目前仍难以确定这些重组过程是适应性反应，还是与癫痫发生或癫痫发作的产生及传播具有因果关系12。

因此，定位癫痫灶并进行局部抗癫痫药物治疗是当前癫痫研究中的主要挑战之一。已有多个利用癫痫动物模型的实验及一些临床研究，旨在发现癫痫发作的起始位置，并阐明大脑中潜在的发病机制24,25,26,27。为此，我们开发了一种新的实验方案，采用4AP诱导的癫痫模型28,29,30,31，在急性小鼠脑片制备中实现将三种装置精确插入海马特定区域，从而以高度局部化的方式调控体内的神经网络活动。通过玻璃微移液管进行局部4AP注射，可在海马特定部位诱导产生癫痫样放电（SLEs）；同时，借助新型聚合物基µFIP探针，利用其记录位点同步监测神经元电活动，实现对癫痫发作活动的控制。此外，还使用多通道硅探针以层特异性方式，同步监测皮层和海马中的局部场电位活动。

最新发明的 µFIP 探针通过施加电场，将储存在微流控通道中带电的药物推过离子交换膜（IEM），从而释放到周围组织中（图1）。IEM 仅选择性地传输一种类型的离子（阳离子或阴离子），因此可在“关闭”状态下限制被动扩散，同时防止周围组织中带相反电荷的物质进入装置内部。 电场通过在微流控通道内的源电极与装置外部的目标电极之间施加一个小电压（<1 V）按需产生（在本实验中，目标电极为动物模型上的颅骨螺钉）。药物递送速率与所施加的电压以及源电极与目标电极之间测得的电流成正比。药物递送的精确可调性是 µFIP 的主要优势之一。与基于流体或压力的药物递送系统相比，另一个关键优势在于：在 µFIP 中，药物通过 IEM 递送时无需携带溶液，因此在药物递送出口处的压力增加几乎可以忽略不计。

当µFIP处于“关闭”状态时，会有少量GABA被动泄漏，但研究发现这不会影响SLEs。µFIP采用我们先前报道过的常规微加工方法定制制备31。

由于预防癫痫复发的一种方法是在网络放电的起始阶段甚至首次发作之前就阻断其发生，因此本文所介绍的将抑制性神经递质GABA递送至癫痫灶的方法，在局灶性癫痫患者的发作控制方面具有重要的治疗潜力。由于GABA是一种内源性物质，在生理浓度下不会改变神经元的固有特性。局部应用低浓度GABA仅会影响那些天然对抑制有反应的细胞，所产生的效应与生理性抑制相似；相比之下，深部脑刺激（DBS）会非特异性地激活其周围神经网络中的所有细胞，引发兴奋与抑制混合的复杂反应。综上所述，该方法在癫痫控制方面比DBS更具特异性。

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方案

所有实验操作均按照系统神经科学研究所的伦理准则进行，并经当地伦理委员会和兽医办公室批准。

注意：实验使用了17只成年雄性OF1小鼠。小鼠在12小时光照/12小时黑暗循环条件下适应饲养，可自由摄食和饮水。

1. 麻醉

  1. 腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪混合物（剂量分别为 100 mg/kg 体重和 10 mg/kg 体重）以麻醉动物。
  2. 通过观察呼吸频率、胡须抖动以及检测小鼠对疼痛的反应来评估麻醉深度。
    注意：    当小鼠呼吸变得规律、无胡须抖动，且对尾部夹捏无反应时，表明麻醉深度已足够，可继续操作。
    1. 将动物置于可编程电加热垫上。将直肠温度探头用凡士林类产品（参见材料表）涂抹后，轻柔插入小鼠直肠内（深度 1–2 cm），以监测其体温。在手术过程和实验记录期间，维持体温在 36.5 至 37.5 °C 之间。
    2. 通过检测小鼠的反射、胡须运动及呼吸频率来持续监测麻醉水平。根据至少每 30 分钟记录一次的麻醉深度，必要时经肌肉注射少量氯胺酮-赛拉嗪混合液（20–50 µL，浓度与之前相同）。

2. 手术/开颅术

  1. 将小鼠头部固定于立体定位仪中。使用30 G针头注射局部镇痛剂罗哌卡因（5 µL，7.5 mg/mL，参见 材料表在预定切口部位皮下注射，等待5分钟以发挥药效。
  2. 用手术刀在颅骨上方的皮肤正中线处做一个直线切口。用精细镊子轻轻将皮肤向两侧拉开，并用鳄嘴式止血钳夹住固定，使颅骨暴露，以便后续操作。
  3. 用手术刀或类似工具清除颅骨上的筋膜。若出现表层出血，使用棉签或小块纸巾吸除血液。
  4. 取一个涂有聚(3,4-乙烯二氧噻吩)聚苯乙烯磺酸盐（PEDOT:PSS）的接地螺钉（规格：#00，直径：0.047 in，长度：1/8 in，参见 材料表用焊好的导线将其与放大器前置放大头的连接器相连。
  5. 在预定钻孔位置湿润颅骨，使用直径为0.4 mm的细圆钻头，在小脑上方的颅骨处高速钻孔，直至露出硬脑膜。将接地螺钉插入孔中，用精密螺丝刀将其旋入，直至到达小脑顶部.
    注意： 头部螺钉经浸涂处理，使用含1%（质量分数）3-缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷（GOPS）的PEDOT:PSS溶液，随后在140 °C下烘烤90分钟。PEDOT:PSS是一种共轭聚合物，具有体积比电容，已知具有生物相容性。GOPS是一种交联剂，与PEDOT:PSS混合以提高其在水性介质中的稳定性。图2).
  6. 借助立体定位仪，测量目标脑区的立体定位坐标。例如，根据小鼠脑图谱，目标区域为海马，从前囟点（Bregma）起，前后向（AP）-1.8 mm，内外向（ML）1.8 mm32.
    注意： 这些是右半球的坐标（图2).
  7. 将厚度减至约1至2毫米 使用可靠的牙科钻在目标区域上方颅骨的直径范围内进行操作（参见 材料表以高速打磨，直至形成一层薄而光滑透明的骨膜。
  8. 然后，如果骨膜的厚度足够薄（<200 µm），用细镊子打一个小孔，并轻轻去除骨组织的薄层33使用自制的钩状针尖去除硬脑膜。尽量减小颅骨开窗和硬脑膜切开的尺寸，以防止水肿形成，并减少脑组织的心源性或呼吸性搏动。
    注意： 开颅部位必须用一滴生理盐水填充以防止干燥，并在实验过程中定期补充（图2).

3. 多通道硅探针的插入

  1. 将硅探针以轻微的前后（AP）角度（20°）固定在立体定位臂上，以便为另外两个植入物的放置留出充足空间，并使电极、离子泵和微移液管的记录位点与注射位点尽可能接近。
    注意：电极、注射器和离子泵均用一滴DiI染料溶液（高氯酸1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青[DiI]）覆盖，用于术后可视化观察植入路径（DiI浓度为0.5 mg/ml，溶剂为二甲基亚砜）。
  2. 将硅探针安装在连接于磁性支架的立体定位臂上，并将其置于立体定位架旁。设定前后角度（20°），然后将探针连接至前置放大器并接地至固定螺钉。
  3. 借助微米级精度的立体定位臂或电动显微操作器，缓慢将硅探针插入海马体，避免横向移动（图2 和 图3）。
    1. 启动记录软件，通过前置放大器、连接的放大器和计算机，在将多通道硅探针从皮层顶部逐步推进至目标背腹向（DV）位置（距皮层表面-1,800 µm）的过程中，持续记录神经元电活动信号。在计算机屏幕上实时记录并观察局部场电位信号（LFP）。
      注意：控制探针下降过程，使其在记录过程中缓慢且连续地下降，以便更清晰地监控穿刺过程并准确到达目标区域。
    2. 利用记录的LFP中海马结构锥体层的尖波涟漪活动作为目标区域的标志。
      注意：尖波涟漪活动可见于多通道硅（Si）探针中一个或两个相邻记录通道上，这些通道之间的记录位点间距为100 µm（图4）。
    3. 通过多通道放大器软件（见材料表），利用多通道Si探针同时记录皮层和海马各层的LFP信号（图4）。

4. 插入 µFIP

  1. 将管路（参见材料表）连接至µFIP的入口，并用0.05 M GABA溶液填充探针。取下管路，并用石蜡膜包裹封闭入口。将电极引线连接至源测量单元。
  2. 借助立体定位臂，以20°的内外侧（MP）角度插入µFIP。硅探针在整个过程中保持插入状态。
    注意： µFIP非常柔韧，可在插入前借助干净的小号画笔提供支撑，以保持其笔直，直至到达脑表面。完成此步骤后，可通过轴向移动轻柔地下降µFIP。
  3. 通过轴向移动缓慢下降µFIP，在到达背腹向（DV）坐标（皮层表面下-1,200 µm）之前，切勿使其在行进路径中发生弯曲。
    注意： 考虑到µFIP尖端出口与尖端之间300 μm的距离，应尽量使两个装置（µFIP和硅探针）彼此靠近。
    警告：插入过程中应避免装置及其连接部件之间发生任何机械干扰（图2B 和 图3B）。

5. 癫痫发作诱导装置的准备

  1. 更换注射器（10 µL）的金属针头（参见材料表）。取下针头固定用的金属部件，安装并固定玻璃微电极（外径 [OD]：1.2 mm，内径 [ID]：0.75 mm，尖端直径：20–50 µm，柄部锥形部分长度约 ± 0.5 cm），然后重新装回针头固定部件。
  2. 将注射器及其连接的硼硅酸盐玻璃微电极以 20° 的侧向-内侧（LM）角度定位，用于注射 4AP（50 mM，溶于人工脑脊液 [ACSF] 中）。
    注意：切勿使用注射器的金属针头，或尖端直径大于 50 µm 的玻璃微电极。
  3. 借助自动微量注射泵吸取 500 nL–1 µL 的 50 mM 4AP 溶液。

6. 插入连接注射器用于4AP注射的玻璃移液管

  1. 将连接至注射器的玻璃微电极移至目标 DV 位置（-1,500 µm），然后注入 250 nL 的 4AP 溶液（图 2 和 图 3）。启动记录软件开始记录，观察屏幕并等待首次痫样放电尖峰出现。
  2. 一旦首次痫样放电尖峰出现，立即通过 µFIP 开始递送 GABA。通过在源极与靶点之间施加 1 V 电压，持续 100 秒，随后关闭 1 秒，重复 30 个循环。借助记录软件，至少持续记录 2 小时。
    注意：递送的 GABA 总量约为 1 nmol（图 5）。
  3. 实验结束后，轻柔取出插入的探针和接地螺钉，将动物从立体定位仪中移出。 使用过量药物（腹腔注射 100 mg/kg 戊巴比妥钠）对动物实施安乐死。通过呼吸和循环停止确认死亡。

7. 种植体位置的评估

  1. 动物安乐死后，经心脏灌注，先用 50 mL 生理盐水，再用 150 mL 冰冷的固定液（含 4% 多聚甲醛（PFA）的 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PB））进行灌注34。
    注意：PFA 具有危害性，必须小心操作。
  2. 将动物断头，去除颅骨顶部和侧面的皮肤和肌肉。从枕骨大孔开始，向耳部方向做两侧切口，并沿矢状中线做切口，注意不要损伤脑组织。使用骨剪小心去除颅骨。取出脑组织，然后借助脑切片模具（见材料表），从目标区域（从前囟点开始，前后方向 -1 至 -3 mm）切取组织块。
  3. 将组织块粘附于振动切片机的样品夹持器上，将支架插入切片机中，并在 PB 浴液中将切片厚度设为 40 µm，制备 40 µm 厚的冠状切片。
  4. 用 0.1 M PB 充分洗涤。按照胶质纤维酸性蛋白（GFAP）染色的组织学实验方案进行操作31。
  5. 将切片贴附于载玻片上，并用含 2-(4-脒基苯基)-1H-吲哚-6-甲酰胺（DAPI）的封片剂封片（见材料表）。

8. 共聚焦显微镜

  1. 将染色的冠状切片置于共聚焦显微镜的20倍物镜下，选择目标区域。
  2. 为染料选择最佳的激发和发射（exc/ems）滤光片组合，如下所示：DAPI = 358/461 nm，DiI = 551/569 nm，荧光素（见材料表）= 490/525 nm。
    注意：由于每张切片的染色程度不同，需为每张切片确定合适的最小和最大激发与检测范围，以确保低密度区域和高密度区域均能显示发射信号。
  3. 选择染色最稀疏的区域，将激光强度和检测值设为较高水平，然后在染色最密集的区域验证这些参数是否导致检测信号过饱和。如果出现过饱和，则降低参数值，并重新在最稀疏区域进行检查。重复此过程，直至在低染色区域获得尽可能高的检测信号，同时在高染色区域保持适当且不过饱和的信号水平。对所有染料重复此优化过程。
  4. 使用显微镜的拼图扫描功能，每块图像设置为512 × 512像素，以获得足够分辨率的大范围视野图像，便于后续处理分析探针插入位点。

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结果

通过本文所述方法，在麻醉小鼠的4AP癫痫模型中，可实现对癫痫灶内癫痫发作的有效控制。精确的植入定位（图2）有助于记录海马局部场电位（LFPs，图4），诱导小范围的海马癫痫发作，并在发作起始时递送GABA。每次实验结束后，均通过离体组织学方法验证植入位置（图3）。

当SLEs仅出现在海马体时，癫痫样活动可被完全控制。图5展示了一个代表性实例，即通过集成µFIP的新型神经探针递送GABA可成功终止SLEs。当4AP被注射到更大区域或皮层表面时，癫痫发作会泛化，此时递送的GABA无法改变癫痫发作的范围（图6）。递送钠离子对4AP诱导的活动未产生明显影响（

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讨论

通过在癫痫急性小鼠模型中开发一种新的实验方案，成功利用植入癫痫灶的µFIP控制了SLE。由于µFIP能够以时间和空间上的精确性递送GABA，因此可在癫痫发作初期即控制由4AP诱导的SLE。理论上，若能在癫痫发作起始部位实现对神经网络放电的有效调控，则有望治疗癫痫。本研究展示的方案证明，只要抑制性神经递质GABA的注射定位足够精确，能够及时到达癫痫灶，即可实现这种控制。然而，在癫痫发作波及大脑较大区域的情况下，通过精确定位递送GABA无法实现 seizure 的有效控制。µFIP探针的影响范围估计为其出口周围半径约550 μm的区域。已有研究证实，只有当4AP注射被局限在该区域内时，才能对SLE产生影响31。

因此，当癫痫发作局限于特定区域时，该方法具有应用价值；但当发作变为多灶性或全面性时，无法有效控制或终止癫痫。此外，该方法已在麻醉的啮齿类动物中得到验证；而在自由活动的动物中，仍需进行慢性长期应用研究，以评估该方案的有效性。

尽管癫痫有多种类型，且由不同的潜在机制引起，但已证实...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

C.M.P. 感谢由国际教育协会管理的惠特克国际学者奖助金提供的资助。A.K. 由玛丽·居里国际经验交流奖学金（编号：625372）资助。A.W. 感谢欧洲研究理事会（ERC）在欧盟“地平线2020”研究与创新计划下提供的资助（资助协议编号：716867）。A.W. 还感谢艾克斯-马赛大学卓越计划——A*MIDEX，该计划为法国“未来投资”项目的一部分。作者感谢 Ilke Uguz 博士、Sahika Inal 博士、Vincenzo Curto 博士、Mary Donahue 博士、Marc Ferro 博士以及 Zsófia Maglóczky 参与富有成效的讨论。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4APSigma275875
Alexa Fluor 488Abcamab15007
放大器Neuralynx，蒙大拿州，美国Digital Lynx 4SX
放大器AmpliplexKJE-1001
立体定位图谱 Allen 图谱978-0470054086
硼硅酸盐玻璃移液管SutterBF120-69-15
脑组织切片模具WPI RBMA-200C
骨剪FST16109-14
共聚焦显微镜ZeissLSM 510
连接器INSTECHSC20/15
棉签MonoprixEMD 6107OD
盖玻片Menzel-Glass15747592
DiI 染料 Thermo FisherD282
DMSOSigma11412-11
钻机FOREDOMK1070
镊子F.S.T.11412-11
GABASigmaA2129
GFAP 单克隆抗体Thermofisher53-9892-80
GOPSSigma440167-100M
Hamilton 注射器 Hamilton 80330
颅骨螺钉Component SupplyTX00-2FH
加热垫 Harvard 仪器341446
注射泵WPI UMP3-3
KeithleyTektoronix216A
氯胺酮Renaudin5787419
磁性固定架Supertech InstrumentsMH-1
小鼠Charles River612
机械操纵器Scientifica，英国IVM
Na2HPO4Sigma255793
NaH2PO4Sigma7558807
NeuroTrace DiI ThermofisherN22880
纸巾KIMBERLY CLARK7552000
PBSigmaP4417
PEDOT:PSSCLEVIOS81076212
PFAAcros Organic30525-89-4
直肠温度探头Harvard 仪器521591
罗哌卡因 KABI1260216
生理盐水Sigma7982
手术刀F.S.TAUST R195806
注射器 BD Medical324826
动脉夹F.S.T18050-28建议使用 4 个
硅探针NeuroNexus，密歇根州，美国A2x16-10mm-50-500-177 或 A1x16-5mm-150-703
立体定位仪Stoelting51733U
Superfrost 载玻片ThermoScientificJ38000AMNZ
导管INSTECHLS20
凡士林 Laboratoire Gilbert3518646126611
Vectashield DAPIVector Laboratories，加利福尼亚州，美国H-1200-10
振动切片机，Leica VT1200SLeica Microsystems1491200S001
赛拉嗪 Bayer4007221032311
硅探针Neuromicrosystems LtdA1x32_dbl_5.0_50_0_176_50

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