Method Article

一种研究食细胞诱导免疫应答的 mellonella 口服液模型

DOI:

10.3791/59270

⸱

March 21st, 2019

 ,  , 
1Department for Medical Microbiology, Hygiene, Interfacultary Institute for Microbiology, Infection Medicine, University of Tübingen

In This Article

Summary

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在这里, 我们提供了一个详细的协议, 口服给药模型使用大肠杆菌 mellonella幼虫和如何表征诱导的先天免疫反应。使用该协议, 没有实际经验的研究人员将能够使用g. mellonella强制喂养方法。

Abstract

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研究同源细菌对宿主免疫系统的免疫原学潜能是研究肠道宿主-微生物相互作用的重要组成部分。众所周知, 不同的配菜表现出不同的刺激宿主肠道免疫系统的潜力。这类调查涉及脊椎动物, 特别是啮齿类动物。由于越来越多的伦理问题与涉及脊椎动物的实验有关, 因此对无脊椎动物替代模型的需求很大。

在这里, 我们提供了一个利用共生菌的大肠杆菌口服给药模型, 并可能评估对g. mellonella免疫系统的免疫原学潜力。我们证明, g. mellonella是一个有用的替代无脊椎动物替代模型, 允许分析具有不同免疫原性潜力的相关物质, 如细菌硫化细菌和大肠杆菌。有趣的是, 这种细菌对幼虫没有杀灭作用, 而幼虫与哺乳动物相似。g. mellonella 的免疫反应与脊椎动物的先天免疫反应相当, 涉及细菌的识别和抗菌分子的产生。我们建议 g . mellonella 能够恢复以前的微生物群平衡, 这是众所周知的健康哺乳动物个人。虽然在g. mellonella和脊椎动物中都提供了类似的先天免疫反应,但 g. mellonella 并不具有适应性免疫系统。由于所研究的先天免疫系统的成分是进化保存的, 该模型允许预先创造和首次分析细菌免疫原性。

Introduction

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肠道微生物群是维持体内平衡的重要组成部分, 涉及先天和适应性免疫反应1,2。共生组织的特征是不同的主要共生体成分: 通过重要的免疫调节功能产生有益作用的共生体, 以及对遗传倾向有有害影响的病理体主持、促进和引发肠道炎症3,4。许多关于共生体和病理及其对宿主免疫系统影响的研究已经发表, 主要研究适应性免疫反应。

由于这些研究涉及许多动物进行调查, 保护和更换用于实验的动物越来越引起公众的兴趣, 我们寻求找到一种替代模式, 以便对不同的细菌免疫原性进行筛查性能。昆虫, 特别是大肠杆菌, 是感染研究中广泛使用的替代模型。g. mellonella结合了不同的优势, 如低成本和高吞吐量;它允许口服细菌, 这是自然接触途径, 它允许全身感染5,6。在37°c 条件下进一步促进了培养, 而13°c 是哺乳动物的生理体温, 也是细菌毒力因子表达的最佳选择.g. mellonella 的主要优点是保守的先天免疫系统, 它能够区....

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Protocol

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1. g. mellonella 的饲养和幼虫的制备

注: 从卵到最后一次幼虫的周期大约需要5-6。

  1. 将成年飞蛾产下的卵转移到含有蜡蛾底物的2升箱 (22% 玉米磨碎、22% 小麦粉、17.5% 蜂蜡、11% 脱脂奶粉、11% 蜂蜜、11% 甘油、5.5% 干酵母)。在黑暗中在30°c 下进行整个繁殖。
  2. 在大约1-2周后, 当小幼虫可见时, 将含有幼虫的25克底物转移到新鲜的底物中。根据幼虫的大小在2周后同步幼虫, 并将30-40 个幼虫组保存在蜡蛾基板上的2升容器中, 再延长2周。
  3. 按重量选择幼虫进行实验。只使用质量为 180-200 毫克的苍白和快速移动的幼虫。

2.口服硫化细菌和大肠杆菌的培养和制备

  1. 在37°c 厌氧生长有义务的厌氧细菌-普氏菌, 使用罐子和小袋创造厌氧环境 (见材料表)15,16。培养抽搐2天, 并在脑心输液 (bhi) 肉汤中生长一夜亚培养。
  2. 在37°c 的 Luria-Bertani (LB) 肉汤中, 在有氧条件下生长活性厌氧菌大肠杆菌.

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Results

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g. mellonella血淋巴感染模型在广泛应用中分析了多种病原菌的毒力因素。大多数测量包括对幼虫死亡率的分析, 这是一个相当容易的方法。然而, 这种方法不允许有关免疫反应的一般结论, 并将g. mellonella免疫反应的结果与脊椎动物免疫机制联系起来。另一方面,由于难以获得确切的感染剂量 9, 仅用于口腔感染或幼虫的定植.此外, 人们对g. mellonella对非致病性细菌, 尤其是哺乳动物的肠道共生菌的先天免疫反应了解甚少。

与病原体不同的是, 共生体对宿主和触发免疫反应的挑战, 但宿主免疫系统能够维持免疫稳态。g. mellonella能够清除最初的强制喂养细菌负荷, 直到最后再也没有细菌被检测到 (图 2).......

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Discussion

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g. mellonella模型是一种常用的模型, 用于评估全身感染方法21中的细菌毒力因素。由于许多病原体和细菌通过口腔定植或感染途径进入宿主, 需要找到新的见解来评估g. mellonella 作为口腔定植和感染的模型。

在15-37°c 之间饲养g. mellonella 的可能性是一个很大的优势, 因为大多数哺乳动物模型的体温保持在 37°c 5。g. mellonella幼虫可以从不同的供应商购买, 但建立自己的繁殖种群提供了许多好处, 例如没有抗生素干扰检测, 在什么时候开始实验的时候更好地估计由于供应商并不总是在随时可用的阶段提供幼虫, 并且由于运输或温度变化而避免了应力响应。由于g. mellonella 的耐温性, 可以进行育种的温度范围很高。较高的温度导致幼虫的快速发育, 根据繁殖温度, 我们可以估计从卵到最后一次幼虫的生命周期。当选择幼虫进行实验时, 只选择苍白和快速移动的个体,.......

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Disclosures

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作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

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这项工作由 DFG (SPP1656)、DFG 研究培训小组1708、Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) 和德国感染研究中心 (DZIF) 资助。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL 试管Eppendorf0030120086
100 bp DNA 分子量标准 Thermo Fisher Scientific15628019
1-溴-3-氯丙烷 （BCP）Sigma-AldrichB9673
2 mL 试管Eppendorf0030120094
2x MangomixBiolineBIO-25033菌落 PCR
50 mL 试管Greiner Bio-One210 261
琼脂糖生物酶840004
蜂蜡Mixed-Store.de -
脑心输液汤Thermo Fisher ScientificCM1135
CloneJET PCR克隆试剂盒Thermo Fisher ScientificK123216S片段克隆载体
糁Ostermühle Naturkost GmbH306有机培养
Difco LB 琼脂，Miller （Luria-Bertani）Becton DickinsonBD
Difoco LB 肉汤，Miller （Luria-Bertani）Becton Dickinson244610
无 DNA DNA 去除试剂盒 Thermo Fisher Scientific244510 Dnase 消化
干酵母Rapunzel -有机培养
Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS）Thermo Fisher Scientific14040
乙醇VWR20821.330
甘油Sigma-AldrichW252506
蜂蜜Ostermühle Naturkost GmbH487
异丙醇 VWR20842.330
Lightcycler 480 仪器 II罗氏分子系统5015278001
LightCycler 480 多孔板 96，白色罗氏分子系统4729692001
带数字显示的手动微量注射器泵World Precision InstrumentsDMP
Micro-Fine+ U-100 胰岛素注射器 0.3 x 8 毫米Becton Dickinson324826口服
砂浆，无釉VWR410-9327 
NanodropThermo Fisher Scientific13-400-518
无核酸酶水 Thermo Fisher Scientific10977035
Oxoid AnaeroGen 小袋 Thermo Fisher ScientificAN0025A的质量和数量
Biozym710970
研杵，无釉研磨表面VWR410-9324 
Phusion 校对酶Thermo Fisher ScientificF553S
引物生物聚合物 -
PureYield 质粒小量制备系统PromegaA1222
QuantiFast SYBR Green PCR 试剂盒 细菌拷贝数测量的Qiagen204056
QuantiFast SYBR Green RT-PCR 试剂盒 Qiagen204156qRT-PCR
QuantiTect 逆转录试剂盒 Qiagen205311cDNA 合成
Qubit 检测管Thermo Fisher ScientificQ32856
Qubit dsHS DNA 试剂盒 Thermo Fisher ScientificQ32851质粒和 cDNA 样品的定量
Qubit 荧光计Thermo Fisher ScientificQ33226质粒和 cDNA 样品的定量
RNase-ExitusPlusAppliChemA7153
Rnasin 核糖核酸酶抑制剂PromegaN2511
脱脂奶粉Sucofin -
SYBR 安全 DNA 凝胶染料Thermo Fisher ScientificS33102
TRI 试剂 Sigma-AldrichT9424
称重船VWR10803-148
小麦粉Ostermühle Naturkost GmbH6462有机栽培
玉米 RNA PCR 条纹用于 qPCR用于基因表达测量的

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8 (8), 564-577 (2010).
  2. Muniz, L. R., Knosp, C., Yeretssian, G.

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