骨细胞外基质（BEM）骨肉瘤（OS）模型已得到充分建立，如图所示。该模型可作为模拟原发性肿瘤生长的合适支架 体外 为研究骨肉瘤的组织学和细胞遗传学异质性提供了理想模型。
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摘要
摘要
骨肉瘤（OS）是最常见且高度侵袭性的原发性骨肿瘤，具有解剖学和组织学上的异质性，同时伴随诊断和预后方面的困难。OS包含基因型和表型均呈异质性的癌细胞。研究表明，骨微环境成分在肿瘤异质性和疾病进展中起重要作用。骨细胞外基质（BEM）保留了天然细胞外基质的微结构支架和生化组分。这种组织特异性微环境为OS细胞的接种和增殖提供了有利且持久的支架。本文提供了一种BEM模型的制备方法及其进一步的实验应用方案。OS细胞可在该模型中生长并分化为多种表型，与临床OS标本的组织病理学复杂性一致。该模型还可用于观察不同形态学特征及其与基因改变和潜在调控机制之间的关联。由于与人类骨肉瘤具有同源性，该BEM-OS模型可用于骨肉瘤的病理学及临床研究。
引言
骨肉瘤（OS）通常发生在青少年时期骨骼生长活跃的区域，即长骨的干骺端。超过80%的骨肉瘤病灶好发于胫骨近端、肱骨近端以及股骨远端和近端的干骺端，这些部位与生长板的位置相对应1。骨肉瘤包含多种具有间充质特性的细胞亚型，在组织学特征和分级上表现出显著的异质性。现有证据支持骨肉瘤起源于间充质干细胞（MSCs）、定向分化的成骨前体细胞以及壁细胞2,3,4,5。这些细胞可在特定骨微环境信号的影响下，积累 遗传或表观遗传学改变，进而发展为骨肉瘤。内在和外在机制共同导致骨肉瘤基因组的不稳定性与异质性，从而产生多种形态学和临床表型6,7。为了实现个体化治疗或新药筛选，需要建立新的模型以应对肿瘤异质性或其他临床难题。
骨肉瘤（OS）是一种骨内恶性实体瘤。肿瘤周围微环境成分的复杂性和活性赋予了不同位置的OS细胞不同的表型和功能特征。骨细胞外基质（BEM）为矿物质沉积和骨重塑提供了结构和生化支架。细胞外基质（ECM）的有机部分主要由成骨细胞系细胞分泌的I型胶原构成，而其矿....
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方案
动物饲养和使用均在获得中山大学动物伦理委员会批准后，依照美国国立卫生研究院《实验动物饲养和使用指南》（NIH出版物第80-23号，1996年修订版）进行。
1. 骨组织准备
- 取4至6周龄的BALB/c小鼠（无性别要求）。通过颈椎脱位法无菌处死小鼠，并用无菌手术剪从后肢剪下新鲜的腓骨、胫骨和股骨。剥离表皮组织，然后使用剪刀和镊子尽可能去除大部分软组织。
- 在6 cm培养皿中，用无菌的10 mM磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗腿骨两次，以去除血液。将骨骼浸入75%乙醇中3分钟，然后用PBS冲洗两次。清洁后的骨骼可置于无菌的50 mL离心管中，加入无菌PBS，在-80 °C下保存数月，直至使用。
注意：后续所有步骤中使用的PBS均含有10 mM PO43−。
2. 骨组织脱矿质与脱细胞化
- 将冷冻的骨骼在室温下解冻，然后于 -80 °C 再次冷冻 1 小时。对骨骼进行 2–3 次以上的冻融循环，以实现细胞裂解和组织破坏。
- 将骨骼置于无菌的 50 mL 离心管中，加入 0.5 N HCl，在室温下于摇床或轨道振荡器上轻轻摇动过夜，确保骨骼被完全且均匀地浸润。
注意：确保在振荡过程中骨骼始终完全浸没在酸液中，不发生沉降。HCl 溶液体积应超过骨骼体积的十倍以上。
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结果
脱矿质和脱细胞处理后，BEM 呈现半透明状，与天然小鼠骨相比具有更强的弹性和韧性。可清晰观察到少量肌肉残留物及骨髓腔空间（图 1A, B）。为确认 BEM 的有效脱细胞效果，将固定后的 BEM 包埋于石蜡中，切片为 3–5 μm 厚度，进行苏木精-伊红（H&E）染色。通过明场成像显示细胞核被彻底清除。脱细胞后的 BEM 中天然的多孔结构和胶原网络排列得以良好保持（图 1C, D）。此外，对骨基质主要有机成分（如 I 型胶原和 IV 型胶原）进行免疫组织化学（IHC）染色，结果显示，与天然骨相比，脱细胞 BEM 中的 ECM 成分未受损伤（图 1E）。因此，BEM 提供了一种具有良好生物相容性的理想且有前景的支架，适用于骨肉瘤细胞的接种与增殖。
MNNG/HOS 细胞表现出高度非典型的形态，胞质呈现.......
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讨论
通常，骨肉瘤（OS）可根据其主要的组织学成分分为成骨型、成软骨型和成纤维型亚型。其预后不仅取决于组织学参数，还与其解剖部位有关。骨肉瘤可发生于骨内（髓内或皮质内）、骨表面以及骨外部位19。骨肉瘤的发生及其异质性可被解释为致癌事件与适宜的微环境刺激共同作用的结果，随后导致肿瘤不断进展并向远处器官转移20,21,22,23。通过合适的模型描绘针对骨肉瘤微环境和生态位的临床意义，或可揭示骨肉瘤演化过程中的未解之谜。
在塑料培养皿或培养瓶中培养 体外 难以重现动态且复杂的生物微环境。多种模拟骨肉瘤的临床前模型（如小鼠、斑马鱼和犬）已取得显著进展，并被应用于发病机制研究和药物开发。4,
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者感谢刘莹陈在骨细胞外基质支架构建过程中提供的行政支持，以及长赵提供的出色技术支持。本研究由国家自然科学基金（31871413）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 15 mL 离心管 | Greiner | 188271 | |
| 50 mL 离心管 | Greiner | 227270 | |
| 6 cm 细胞培养皿 | Greiner | 628160 | |
| 6 孔板 | Greiner | 657160 | |
| 氨苄青霉素 | Sigma-Aldrich | A9393 | |
| C57-BL/6J 小鼠 | 中山大学实验动物中心 | ||
| CO2 培养箱 | SHEL LAB | SCO5A | |
| 磷酸氢二钠 | 广州化学试剂厂 | BE14-GR-500G | |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D0547 | |
| 胎牛血清 | Hyclone | SH30084.03 | |
| 血细胞计数板 | BLAU | 717805 | |
| 卡那霉素 | Sigma-Aldrich | PHR1487 | |
| MG-63 | 中国科学院上海细胞库 | 人骨肉瘤细胞系 | |
| MNNG/HOS | 中国科学院上海细胞库 | 人骨肉瘤细胞系 | |
| 酚红 | Sigma-Aldrich | P4633 | 酚红溶液用作 pH 指示剂：其颜色在 pH 6.6 至 8.0 范围内由黄色逐渐变为红色。 |
| 氯化钾 | 生工生物 | A100395 | |
| 磷酸二氢钾 | 生工生物 | A501211 | |
| 氯化钠 | 生工生物 | A501218 |
参考文献
- Longhi, A., Errani, C., De Paolis, M., Mercuri, M., Bacci, G. Primary bone osteosarcoma in the pediatric age: State of the art. Cancer Treatment Reviews. 32, 423-436 (2006).
- Mohseny, A. B., et al. Osteosarcoma ....
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