三维骨细胞外基质骨肉瘤模型

摘要

骨细胞外基质（BEM）骨肉瘤（OS）模型已得到充分建立，如图所示。该模型可作为模拟原发性肿瘤生长的合适支架 体外 为研究骨肉瘤的组织学和细胞遗传学异质性提供了理想模型。

摘要

骨肉瘤（OS）是最常见且高度侵袭性的原发性骨肿瘤，具有解剖学和组织学上的异质性，同时伴随诊断和预后方面的困难。OS包含基因型和表型均呈异质性的癌细胞。研究表明，骨微环境成分在肿瘤异质性和疾病进展中起重要作用。骨细胞外基质（BEM）保留了天然细胞外基质的微结构支架和生化组分。这种组织特异性微环境为OS细胞的接种和增殖提供了有利且持久的支架。本文提供了一种BEM模型的制备方法及其进一步的实验应用方案。OS细胞可在该模型中生长并分化为多种表型，与临床OS标本的组织病理学复杂性一致。该模型还可用于观察不同形态学特征及其与基因改变和潜在调控机制之间的关联。由于与人类骨肉瘤具有同源性，该BEM-OS模型可用于骨肉瘤的病理学及临床研究。

引言

骨肉瘤（OS）通常发生在青少年时期骨骼生长活跃的区域，即长骨的干骺端。超过80%的骨肉瘤病灶好发于胫骨近端、肱骨近端以及股骨远端和近端的干骺端，这些部位与生长板的位置相对应¹。骨肉瘤包含多种具有间充质特性的细胞亚型，在组织学特征和分级上表现出显著的异质性。现有证据支持骨肉瘤起源于间充质干细胞（MSCs）、定向分化的成骨前体细胞以及壁细胞^2,3,4,5。这些细胞可在特定骨微环境信号的影响下，积累 遗传或表观遗传学改变，进而发展为骨肉瘤。内在和外在机制共同导致骨肉瘤基因组的不稳定性与异质性，从而产生多种形态学和临床表型^6,7。为了实现个体化治疗或新药筛选，需要建立新的模型以应对肿瘤异质性或其他临床难题。

骨肉瘤（OS）是一种骨内恶性实体瘤。肿瘤周围微环境成分的复杂性和活性赋予了不同位置的OS细胞不同的表型和功能特征。骨细胞外基质（BEM）为矿物质沉积和骨重塑提供了结构和生化支架。细胞外基质（ECM）的有机部分主要由成骨细胞系细胞分泌的I型胶原构成，而其矿化部分则以羟基磷灰石形式存在的磷酸钙组成⁸。ECM网络的动态作用在于调控细胞黏附、分化、细胞间通讯以及组织功能的维持⁹。

脱矿质BEM和ECM水凝胶已成功应用于细胞培养，并可促进细胞增殖^10,11。合成的类骨ECM可调控间充质干细胞（MSCs）的细胞池大小、命运决定及谱系进展^12,13,14。此外，研究结果证实其具有临床意义，可通过在骨形成和再生过程中刺激细胞活动来提供成骨活性^15,16,17。

本文中，本研究团队建立了一种改良的三维长期培养模型，提供了一种理想的替代方法。相较于传统的塑料二维培养，注射至组织来源的BEM中的骨肉瘤（OS）细胞迅速呈现出异质性的间充质表型。来源于部位特异性同源组织的BEM展现出显著优势，可作为骨肉瘤细胞的天然微环境。 体外 在骨肉瘤的理论与临床研究中具有巨大潜力。该特征明确的BEM平台简便高效，适用于 体外 研究，并可拓展用于多种癌症的建模。

方案

动物饲养和使用均在获得中山大学动物伦理委员会批准后，依照美国国立卫生研究院《实验动物饲养和使用指南》（NIH出版物第80-23号，1996年修订版）进行。

1. 骨组织准备

1. 取4至6周龄的BALB/c小鼠（无性别要求）。通过颈椎脱位法无菌处死小鼠，并用无菌手术剪从后肢剪下新鲜的腓骨、胫骨和股骨。剥离表皮组织，然后使用剪刀和镊子尽可能去除大部分软组织。
2. 在6 cm培养皿中，用无菌的10 mM磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗腿骨两次，以去除血液。将骨骼浸入75%乙醇中3分钟，然后用PBS冲洗两次。清洁后的骨骼可置于无菌的50 mL离心管中，加入无菌PBS，在-80 °C下保存数月，直至使用。
   注意：后续所有步骤中使用的PBS均含有10 mM PO₄³⁻。

2. 骨组织脱矿质与脱细胞化

1. 将冷冻的骨骼在室温下解冻，然后于 -80 °C 再次冷冻 1 小时。对骨骼进行 2–3 次以上的冻融循环，以实现细胞裂解和组织破坏。
2. 将骨骼置于无菌的 50 mL 离心管中，加入 0.5 N HCl，在室温下于摇床或轨道振荡器上轻轻摇动过夜，确保骨骼被完全且均匀地浸润。
   注意：确保在振荡过程中骨骼始终完全浸没在酸液中，不发生沉降。HCl 溶液体积应超过骨骼体积的十倍以上。
3. 脱钙后，彻底倾去 HCl 溶液，并用流动水冲洗 1 小时。随后，在摇床或轨道振荡器上用蒸馏水洗涤两次，每次 15 分钟。
   注意：每次洗涤之间以及最后一次蒸馏水洗涤后，必须彻底去除残留溶液或水。
4. 用甲醇与氯仿按 1:1 比例配制的混合液，在包裹锡箔的 50 mL 离心管中室温处理 1 小时，以提取脱矿骨骼中的脂质¹⁰。
5. 然后将骨骼转移至另一含有甲醇并包裹锡箔的离心管中，室温处理 30 分钟。彻底去除甲醇后，用蒸馏水轻轻振荡洗涤两次，每次 15 分钟。倾去最后一次洗涤的水，并在无菌条件下进行后续操作。
   注意：在提取过程中必须避光，以防止氯仿分解。混合液可储存于避光容器或包裹锡箔的离心管中。所有处理和洗涤步骤均应在轻柔旋转或摇动条件下进行。
6. 将骨骼置于 6 cm 培养皿中，用无菌 PBS 冲洗 3 分钟，然后转移至新的 50 mL 离心管中。 向管中加入 40 mL 无菌 0.05% 胰蛋白酶-EDTA（TE），在 37 °C 的 CO₂ 培养箱中孵育 23 小时¹⁸。
7. 弃去 TE 溶液，用含 90 μg/mL 氨苄青霉素和 90 μg/mL 卡那霉素的无菌 PBS 洗涤两次。彻底倾去最后一次 PBS 洗涤液后，补充 40 mL 无菌 PBS。在室温下轻轻摇动或振荡，充分洗涤 24 小时，使抗生素充分渗透。
   注意：本步骤及后续步骤中使用的所有无菌 PBS 均含有 90 μg/mL 氨苄青霉素和 90 μg/mL 卡那霉素。通过长时间旋转或摇动洗涤，确保抗生素充分浸润孔隙空间，实现有效灭菌。
8. 去除 PBS，将骨骼转移至装有无菌 PBS 的新鲜 50 mL 离心管中。制备完成的脱矿脱细胞骨骼称为骨细胞外基质（BEM），可在 4 °C 下保存 2 个月，直至使用。

3. 细胞接种与培养

1. 从4 °C冰箱中取出BEM，浸入75%乙醇中30秒，然后用PBS冲洗两次。将BEM转移至洁净的6孔细胞培养板中，加入2 mL完全培养基（含5%胎牛血清、90 μg/mL氨苄青霉素和90 μg/mL卡那霉素的Dulbecco改良Eagle培养基/F12（DF12））。在37 °C、CO₂培养箱中孵育过夜。
2. 获取人骨肉瘤细胞系（MNNG/HOS和MG-63）。用含酚红作为指示剂的100 μL PBS重悬约1.0 × 10⁵个骨肉瘤细胞。
   注意：为了更有效地追踪和观察三维BEM模型中的多层细胞，MNNG/HOS和MG-63细胞已感染表达荧光mCherry和绿色荧光蛋白（GFP）的慢病毒载体。
3. 待BEM完全浸润于培养基后，从近端或远端骨骺处将骨肉瘤细胞注入BEM，直至针头到达BEM的髓腔。将骨肉瘤-BEM模型在37 °C、5% CO₂湿化环境中孵育至少2小时，以确保注射的细胞牢固黏附于BEM上。
   注意：所有用于细胞培养的培养基均需预先温育。细胞培养所用培养箱应维持在37 °C、5% CO₂的湿化环境。
4. 向培养板中加入1 mL完全培养基，完全覆盖BEM表面，在37 °C CO₂培养箱中过夜培养。
5. 用无菌镊子将骨肉瘤-BEM模型轻轻转移至新的6孔板孔中，并更换1 mL新鲜培养基。在37 °C CO₂培养箱中继续培养14天，根据骨肉瘤细胞的增殖情况定期更换培养基。
6. 在培养过程中，定期在倒置荧光显微镜下观察培养基颜色及细胞状态。当骨肉瘤细胞扩增至培养板表面时，用无菌镊子将骨肉瘤-BEM模型轻轻转移至另一新孔中。
   注意：培养基在pH 7.4时呈亮红色，这是大多数哺乳动物细胞培养的最适pH值。若培养基变为橙色甚至黄色，应立即更换，以维持骨肉瘤细胞的健康生长环境。
7. 用镊子将骨肉瘤-BEM模型转移至新孔中，用PBS轻轻冲洗以去除残留培养基，随后转移至15 mL离心管中，用10%中性缓冲福尔马林固定，用于组织学鉴定。

结果

脱矿质和脱细胞处理后，BEM 呈现半透明状，与天然小鼠骨相比具有更强的弹性和韧性。可清晰观察到少量肌肉残留物及骨髓腔空间（图 1A, B）。为确认 BEM 的有效脱细胞效果，将固定后的 BEM 包埋于石蜡中，切片为 3–5 μm 厚度，进行苏木精-伊红（H&E）染色。通过明场成像显示细胞核被彻底清除。脱细胞后的 BEM 中天然的多孔结构和胶原网络排列得以良好保持（图 1C, D）。此外，对骨基质主要有机成分（如 I 型胶原和 IV 型胶原）进行免疫组织化学（IHC）染色，结果显示，与天然骨相比，脱细胞 BEM 中的 ECM 成分未受损伤（图 1E）。因此，BEM 提供了一种具有良好生物相容性的理想且有前景的支架，适用于骨肉瘤细胞的接种与增殖。

MNNG/HOS 细胞表现出高度非典型的形态，胞质呈现...

讨论

通常，骨肉瘤（OS）可根据其主要的组织学成分分为成骨型、成软骨型和成纤维型亚型。其预后不仅取决于组织学参数，还与其解剖部位有关。骨肉瘤可发生于骨内（髓内或皮质内）、骨表面以及骨外部位¹⁹。骨肉瘤的发生及其异质性可被解释为致癌事件与适宜的微环境刺激共同作用的结果，随后导致肿瘤不断进展并向远处器官转移^20,21,22,23。通过合适的模型描绘针对骨肉瘤微环境和生态位的临床意义，或可揭示骨肉瘤演化过程中的未解之谜。

在塑料培养皿或培养瓶中培养 体外 难以重现动态且复杂的生物微环境。多种模拟骨肉瘤的临床前模型（如小鼠、斑马鱼和犬）已取得显著进展，并被应用于发病机制研究和药物开发。^4,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 离心管	Greiner	188271
50 mL 离心管	Greiner	227270
6 cm 细胞培养皿	Greiner	628160
6 孔板	Greiner	657160
氨苄青霉素	Sigma-Aldrich	A9393
C57-BL/6J 小鼠	中山大学实验动物中心
CO2 培养箱	SHEL LAB	SCO5A
磷酸氢二钠	广州化学试剂厂	BE14-GR-500G
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D0547
胎牛血清	Hyclone	SH30084.03
血细胞计数板	BLAU	717805
卡那霉素	Sigma-Aldrich	PHR1487
MG-63	中国科学院上海细胞库		人骨肉瘤细胞系
MNNG/HOS	中国科学院上海细胞库		人骨肉瘤细胞系
酚红	Sigma-Aldrich	P4633	酚红溶液用作 pH 指示剂：其颜色在 pH 6.6 至 8.0 范围内由黄色逐渐变为红色。
氯化钾	生工生物	A100395
磷酸二氢钾	生工生物	A501211
氯化钠	生工生物	A501218