方法文章

半导体测序用于胚胎植入前非整倍体遗传学检测

DOI：

10.3791/59273

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2019年8月25日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics and Metabolism, Maternal and Child Health Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, 2Birth Defects Prevention and Control Institute of Guangxi Zhuang Autonomous Region, 3Shenzhen Research Institute, The Chinese University of Hong Kong, 4Department of Obstetrics and Gynaecology, The Chinese University of Hong Kong, 5State Key Laboratory of Microbial Metabolism, Joint International Research Laboratory of Metabolic and Developmental Sciences, School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, 6Basecare Medical Device Co., Ltd

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种用于胚胎植入前非整倍体遗传学检测（PGT-A）的半导体测序方法，该方法具有周转时间短、成本低和高通量的优点。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

染色体非整倍性是导致胚胎发育停滞、着床失败或妊娠丢失的主要原因之一，在人类胚胎中已有充分记录。针对非整倍性的胚胎植入前遗传学检测（PGT-A）是一种能够通过检测胚胎染色体异常显著改善生殖结局的遗传学检测技术。新一代测序（NGS）为遗传分析提供了高通量且成本效益高的方法，并已在PGT-A中展现出临床适用性。本文介绍一种基于半导体测序的快速、低成本NGS方法，用于胚胎非整倍性筛查。该流程的第一步是对活检所得的胚胎样本进行全基因组扩增（WGA），随后构建测序文库，并在半导体测序系统上进行测序。通常情况下，在PGT-A应用中，每个芯片可加载并测序24个样本，产生6000万至8000万条读长，平均读长为150个碱基对。该方法优化了测序文库模板扩增与富集的实验流程，使PGT-A检测具有可重复性、高通量、成本低且节省时间的优点。该半导体测序仪的运行时间仅为2至4小时，将从接收样本到出具报告的周转时间缩短至5天。上述优势使该检测方法成为检测胚胎染色体非整倍性的理想选择，从而促进其在PGT-A中的广泛应用。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在辅助生殖中，选择染色体拷贝数正常（整倍体）且质量优良、具有活力的胚胎进行移植，有助于改善妊娠结局。传统上，由于形态学评分系统易于获取且具有非侵入性，已被广泛用于胚胎评估。然而研究表明，形态学评估仅能提供有限的胚胎质量1和着床潜力2信息。其根本原因之一在于无法评估胚胎的染色体组成。

染色体非整倍体（染色体数目异常）是导致胚胎发育停滞、着床失败或妊娠丢失的主要原因之一。人类胚胎中非整倍体的发生率已有充分记录，在卵裂期胚胎中占60%−70%3,4，在囊胚中占50%−60%5。这在一定程度上造成了体外受精（IVF）治疗妊娠率提升的瓶颈，目前其妊娠率仍维持在约35%−40%6,7。因此，选择整倍体胚胎进行移植被认为有助于改善妊娠结局。为此，已进一步发展了针对非整倍体的胚胎植入前遗传学检测（PGT-A），以通过遗传学方法评估胚胎的发育潜能。越来越多的随机对照试验和队列研究支持PGT-A的关键作用。已有研究证实，应用PGT-A可降低流产率，并提高临床妊娠率和着床率8，以及持续妊娠率和活产率9。

历史上，植入前遗传学检测非整倍体（PGT-A）曾采用多种不同方法，例如荧光原位杂交（FISH）、比较基因组杂交（CGH）、微阵列-CGH（array-CGH）以及单核苷酸多态性（SNP）微阵列。先前的研究表明，通过FISH对卵裂期胚胎进行PGT-A所得结果，与利用59273array-CGH或SNP微阵列5927310对相应囊胚进行全染色体筛查（CCS）所获得的结果一致性较差。这些差异可能归因于染色体嵌合现象、FISH技术本身产生的假象，或胚胎在发育过程中对染色体分离错误的自我校正能力11。目前普遍认为，采用囊胚滋养外胚层（TE）活检结合基于微阵列的技术（如array-CGH或SNP微阵列）进行PGT-A，能够有效识别胚胎中的染色体不平衡10,12。近年来，单细胞高通量测序（NGS）作为一种高通量且成本效益较高的遗传分析方法，已在PGT-A中展现出临床应用价值13,14,15，使其成为现有检测方法的一种极具前景的替代方案。

本文介绍一种基于半导体测序的快速、稳健且低成本的高通量测序（NGS）方法，用于人类胚胎非整倍体的筛查。该流程的第一步是对活检所得的胚胎样本进行全基因组扩增（WGA），使用单细胞WGA试剂盒完成；随后构建测序文库，并在半导体测序系统上进行测序。

通过检测DNA链合成过程中每个脱氧核糖核苷三磷酸掺入时释放的H+离子，该系统将半导体元件捕获的化学信号（pH变化）直接转换为数字数据，并进一步解读为DNA序列信息。这种简单的测序化学方法无需昂贵的光学检测和复杂的测序反应，从而降低了总体试剂成本，并将测序运行时间缩短至2−4小时16。更重要的是，根据制造商的性能规格，该半导体测序平台每次运行最多可产生15 GB的测序数据（取决于文库质量），显著高于其他一些仅产生约3−4 GB数据（读长为2 × 75 bp）的测序仪17。在PGT-A的临床应用中，该平台可在每张芯片上处理24个样本，产生多达8000万条读段17，每个样本至少获得100万条唯一读段。测序深度可确保每个样本的全基因组覆盖度至少达到0.05x。该平台的上述优势使其成为理想的筛查方法，因而促进了其在PGT-A中的广泛应用18。

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方案

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本研究已获得香港中文大学―新界东医院联网临床研究伦理委员会的伦理批准（参考编号：2010.432）。研究许可已获香港人类生殖科技管理局批准（编号 R3004）。

1. 全基因组扩增

  1. 开始前，检查磁珠（材料表）的体积，确保每个样本至少有135 µL（含20%过量）。将磁珠在室温（RT）下放置至少30分钟。为每个样本准备720 µL（含20%过量）的70%乙醇。将热循环仪（材料表）的加热盖预热至105 °C。
    注意：新配制的70%乙醇（材料表）应在3天内使用完毕。
  2. 样本制备
    注意：在常规操作中，根据操作指南19，对囊胚的5至10个滋养层细胞进行活检。
    1. 将活检样本悬浮于单个0.2 mL聚合酶链式反应（PCR）管中的2 µL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）中。
    2. 在小型离心机上短暂离心3秒，以收集液滴。
  3. 细胞裂解与提取
    1. 将细胞提取缓冲液（材料表）和提取酶稀释缓冲液（材料表）置于冰上解冻，使用前涡旋混匀，并在小型离心机上短暂离心3秒。
    2. 向步骤1.2.2中的每根管中加入3 µL细胞提取缓冲液。
    3. 通过加入4.8 µL提取酶稀释缓冲液和0.2 µL细胞提取酶（材料表），为每个样本配制5 µL细胞裂解主混合液。充分混匀后分装至步骤1.3.2中的各管中。轻轻翻转管子，并在小型离心机上短暂离心3秒。
      注意：添加主混合液时，枪头不应接触含有细胞样本的液体。
    4. 将步骤1.3.3中的管子放入带加热盖的热循环仪中。运行以下程序：75 °C孵育10分钟，95 °C孵育4分钟，4 °C保存。
  4. 预扩增
    1. 将预扩增缓冲液（材料表）置于冰上解冻，使用前涡旋混匀，并在小型离心机上短暂离心3秒。
    2. 通过加入4.8 µL预扩增缓冲液和0.2 µL预扩增酶（材料表），为每个样本配制5 µL预扩增主混合液。充分混匀后分装至步骤1.3.4中的各管中。轻轻翻转管子，并在小型离心机上短暂离心3秒。
      注意：添加主混合液时，枪头不应接触含有DNA样本的液体。
    3. 将管子放入带加热盖的热循环仪中。运行以下程序：95 °C孵育2分钟；进行12个循环，每个循环包括：95 °C 15秒，15 °C 50秒，25 °C 40秒，35 °C 30秒，65 °C 40秒，75 °C 40秒；4 °C保存。
  5. 扩增
    1. 将扩增缓冲液（材料表）置于冰上解冻，使用前涡旋混匀，并在小型离心机上短暂离心3秒。
    2. 通过加入25 µL扩增缓冲液、0.8 µL扩增酶（材料表）和34.2 µL无核酸酶水（用于WGA）（材料表），为每个样本配制60 µL扩增主混合液。充分混匀后分装至步骤1.4.3中的各管中。轻轻翻转管子，并在小型离心机上短暂离心3秒。
    3. 将管子放入带加热盖的热循环仪中。运行以下程序：95 °C孵育2分钟；进行14个循环，每个循环包括：95 °C 15秒，65 °C 1分钟，75 °C 1分钟；4 °C保存。
  6. WGA产物的纯化
    1. 将步骤1.5.3中的每个WGA产物转移至新的1.5 mL离心管中。向每根管中加入112.5 µL磁珠。涡旋混匀后在室温下孵育5分钟。
      注意：使用前应彻底混匀磁珠。
    2. 将管子置于磁力架（材料表）上3分钟，直至上清液澄清。弃去全部上清液，注意不要扰动磁珠。
    3. 向每根管中加入300 µL 70%乙醇。将每根管旋转180°，使磁珠穿过乙醇，再旋转回原位置。待磁珠沉降后，弃去全部上清液，注意不要扰动磁珠。重复此步骤一次。
      注意：旋转管子时应保持管子水平放置在磁力架上。
    4. 在小型离心机上短暂离心每根管子3秒。将管子放回磁力架，直至残留上清液澄清。弃去所有残留上清液，注意不要扰动磁珠。在室温下晾干磁珠约3分钟。
    5. 将管子从磁力架上取下，加入35 µL低浓度Tris-EDTA（TE）缓冲液（材料表），重悬干燥的磁珠。在室温下孵育5分钟。
    6. 将管子置于磁力架上3分钟，直至上清液澄清。将含有洗脱DNA的全部上清液转移至新的1.5 mL离心管中，注意不要扰动磁珠。

2. 全基因组扩增产物的质量控制

  1. 使用1 µL步骤1.6.6中纯化的WGA产物作为起始材料，根据制造商说明书通过荧光计检测法（材料表）对每份纯化的WGA产物进行定量。
    注意：WGA产物的可接受浓度应≥ 10 ng/µL。低于此阈值的任何产物均不建议进入后续步骤。

3. WGA 产物的片段化

  1. 开始前，将干式金属浴预热至 37 °C。为每个样本准备 6 µL（含 20% 过量）的 0.5 M EDTA。根据浓度，从步骤 1.6.6 中纯化的 WGA 产物中取 300 ng DNA 分装至新的 0.2 mL PCR 管中，并用无核酸酶水补至每管总体积为 16 µL。
  2. 片段化
    1. 为每个样本配制 4 µL 双链 DNA（dsDNA）片段化反应体系，加入 2 µL dsDNA 片段化反应缓冲液（材料表）和 2 µL dsDNA 片段化酶（材料表）。充分混匀后分装至步骤 3.1 中的各管中。涡旋振荡混匀，并在小型离心机上短暂离心 3 秒。将各管置于带加热盖的热循环仪中，在 37 °C 下孵育 25 分钟。
    2. 立即向每管中加入 5 µL 0.5 M EDTA。通过涡旋振荡充分混匀，并在小型离心机上短暂离心 3 秒。
  3. 纯化与重悬
    1. 将步骤 3.2.2 中的每个产物转移至新的 1.5 mL 离心管中。向每管加入 37.5 µL 磁珠。涡旋振荡混匀，在室温下孵育 5 分钟。
    2. 按照步骤 1.6.2 至步骤 1.6.4 所述方法纯化产物。
    3. 按照步骤 1.6.5 和 1.6.6 所述方法，加入 32 µL 低 TE 缓冲液重悬每个纯化产物。

4. 文库构建

  1. 平末端修复、片段筛选与纯化
    1. 通过加入 9.5 µL 无核酸酶水和 10 µL 5x 末端修复缓冲液（材料表），为每个样本配制 20 µL 的平末端修复反应体系（来自步骤 3.3.3 的离心管）。涡旋混匀，并在小型离心机上短暂离心 3 秒。
    2. 向步骤 4.1.1 中的每支离心管加入 50 µL 磁珠。涡旋混匀后，室温孵育 5 分钟。
      注意：使用前务必充分混匀磁珠。
    3. 将每支离心管置于磁力架上 3 分钟，直至上清液澄清。将全部上清液转移至新的 1.5 mL 离心管中（每管预先加入 25 µL 磁珠）。涡旋混匀后，室温孵育 5 分钟。
    4. 按照步骤 1.6.2 至步骤 1.6.4 所述方法，对孵育后的管中产物进行纯化。
    5. 按照步骤 1.6.5 和 1.6.6 所述方法，向每个纯化产物中加入 32 µL 低 TE 缓冲液进行洗脱。
      注意：此为安全暂停点；本步骤所得纯化 DNA 在 4 °C 下可稳定保存不超过 24 小时。
  2. 接头连接与纯化
    1. 通过加入 10 µL 无核酸酶水、5 µL 10x 连接酶缓冲液（材料表）、1 µL P1 接头（材料表）和 1 µL DNA 连接酶（材料表），为每个样本配制 17 µL 的接头连接反应体系。涡旋混匀 5 秒，小型离心机离心 15 秒，然后分装至步骤 4.1.5 的各离心管中。
    2. 根据样本记录表（补充文件：接头连接样本记录表），向步骤 4.2.1 中的每支离心管加入 1 µL 对应接头（材料表）。涡旋混匀后，小型离心机短暂离心 3 秒。室温（20−25 °C）孵育 20 分钟。
    3. 向步骤 4.2.2 中的每支离心管加入 75 µL 磁珠。涡旋混匀后，室温孵育 5 分钟。随后，按照步骤 1.6.2 至步骤 1.6.4 所述方法对产物进行纯化。
    4. 按照步骤 1.6.5 和 1.6.6 所述方法，向每个纯化产物中加入 15 µL 低 TE 缓冲液进行洗脱。将含有洗脱 DNA 的全部上清液转移至新的 0.2 mL 8 联管中。
      注意：此为安全暂停点；本步骤所得纯化 DNA 在 4 °C 下可稳定保存不超过 24 小时。
  3. 扩增与纯化
    1. 通过加入 47.5 µL 超级混合液（材料表）和 2.5 µL 引物混合液（材料表），为每个样本配制 50 µL 的扩增主混合液。涡旋混匀后，小型离心机短暂离心，然后分装至步骤 4.2.4 的 0.2 mL 8 联管中。
    2. 涡旋混匀 8 联管 30 秒，小型离心机短暂离心 3 秒。将 8 联管放入带加热盖的 PCR 仪中，运行以下程序：72 °C 孵育 20 分钟；95 °C 预变性 5 分钟；进行 10 个循环（95 °C 变性 15 秒，62 °C 退火 15 秒，70 °C 延伸 1 分钟）；70 °C 最终延伸 5 分钟；4 °C 保存。
    3. 将步骤 4.3.2 中的每份产物转移至新的 1.5 mL 离心管中。每管加入 97.5 µL 磁珠。涡旋混匀后，室温孵育 5 分钟。
    4. 按照步骤 1.6.2 至步骤 1.6.4 所述方法对产物进行纯化。
    5. 按照步骤 1.6.5 和 1.6.6 所述方法，向每个纯化产物中加入 25 µL 低 TE 缓冲液进行洗脱。

5. DNA文库的质量控制与稀释

  1. 使用2 µL DNA文库作为起始材料，根据制造商说明书通过荧光计检测法定量步骤4.3.5中制备的每个DNA文库。
  2. DNA文库的可接受浓度为≥ 0.5 ng/µL，阳性对照（材料表）的浓度应≤ 15 ng/µL。若阳性对照浓度与15 ng/µL偏差过大，需重复测定阳性对照浓度，直至其接近15 ng/µL。若文库浓度低于0.5 ng/µL，则需从片段化步骤（第3节）重新开始。
    注意：在定量DNA文库前，务必确保阳性对照浓度已达到可接受值。
  3. 使用无核酸酶水将每个文库稀释至100 pmol。将1 µL文库加入n µL无核酸酶水中；使用以下公式计算n：
    平衡公式，n = (Q/C × 6×10^7 / 306 ÷ 660) - 1，科学计算方法。
    其中Q为荧光计检测法测得的各文库浓度，C为荧光计检测法测得的阳性对照浓度。

6. 测序

  1. 开始前，为每个样本准备 48 µL（含 20% 过量）的 1 M NaOH 溶液，并准备一个无核酸酶的 1.5 mL 离心管。解冻主混合物 PCR 缓冲液（材料表）（体积为 2000 µL）置于室温。将球形颗粒（材料表）至室温。
  2. 文库合并
    1. 涡旋振荡步骤5.3中每个稀释后的文库，并在小型离心机上短暂离心4次，每次3秒。取每个文库5 µL，混合至无核酸酶的1.5 mL离心管中。涡旋振荡混合后的文库，并在小型离心机上短暂离心3秒。
  3. 使用乳液系统的乳液PCR
    1. 向2个新的回收管中各加入150 µL裂解液材料表安装新的回收管、回收装置和扩增板。
    2. 通过倒置油瓶进行混合（材料表）3 次。确保油相和回收溶液（材料表至少有三分之二满。
    3. 涡旋振荡主混合PCR缓冲液30秒，然后在小型离心机上短暂离心3秒。涡旋振荡微球颗粒及6.2.1步骤中获得的混合文库1分钟，然后在小型离心机上短暂离心3秒。
    4. 通过加入 172 µL 无核酸酶水、8 µL 来自步骤 6.3.3 的混合文库以及 120 µL 酶混合液，配制总体积为 2400 µL 的连接反应体系材料表)，并将100 µL的微球颗粒加入含有2000 µL主混合PCR缓冲液的离心管中。
    5. 将移液器调至 800 µL，吸取 6.3.4 步骤中的连接反应混合物，加入反应滤柱中材料表通过样品口加入。使用1000P移液器向反应滤膜中加入200 µL反应油。
    6. 选择程序 质子：离子PI Hi-Q OT2 200 试剂盒，然后，选择 辅助的 按钮，按照显示器上的说明确认设备已正确设置。然后，单击 下一步 启动程序。
  4. 通过自动富集系统进行富集
    1. 当乳液PCR程序完成后，单击 下一步，然后单击 最终离心 离心10分钟。点击后取出2个回收管。 打开盖子.
    2. 从2个回收管中弃去上清液，每管保留100 µL，并相应标记。充分混匀溶液后，转移至新的1.5 mL离心管中。
    3. 向每个回收管中加入 200 μL 无核酸酶水，通过反复吹打数次进行洗涤，并将全部溶液转移至步骤 6.4.2 中的 1.5 mL 管中。重复洗涤步骤一次。
    4. 向其中一个回收管中加入 200 µL 无核酸酶水，通过上下吹打数次进行洗涤。将全部溶液转移至另一个回收管中，再次上下吹打数次进行洗涤。随后，将全部溶液转移至步骤 6.4.3 中使用的同一支 1.5 mL 离心管中。涡旋振荡 1.5 mL 离心管 30 秒，然后在 15,500 x g 条件下离心 8 分钟 g.
      注意：此步骤中乳液PCR产物的最终总体积应约为1200 µL。
    5. 弃去管中的上清液，保留20 µL乳液PCR产物。加入80 µL重悬溶液（材料表将溶液加入管中，用移液器吹打混匀。
    6. 为每张芯片配制 320 µL 脱膜溶液，加入 280 µL 聚乙二醇单月桂酸山梨醇酯溶液（材料表) 和 40 µL 1 M NaOH。
      注意：1 M NaOH 应储存于 4 °C 或现配现用。使用前涡旋混匀。
    7. 涡旋含有C1磁珠的离心管（材料表）30秒。取100 µL C1磁珠至新的1.5 mL离心管中。将1.5 mL离心管置于磁力架上，室温静置2分钟。待磁珠完全沉降后，小心弃去上清液，避免扰动磁珠。
    8. 加入1 mL 洗涤液C1（材料表) 加入到第 6.4.7 步的试管中。涡旋振荡 30 秒。将试管置于磁力架上，室温静置 2 分钟。待磁珠完全沉降后，弃去全部上清液，注意不要扰动磁珠。通过加入 130 µL 磁珠捕获溶液重悬磁珠（材料表).
    9. 富集系统（ES） 设置
      1. 加入第6.4.5步的样品（100 µL乳液PCR产物）、第6.4.8步的洗涤磁珠（130 µL）以及ES洗涤液（300 µL）材料表），并将第6.4.6步中的洗脱液（300 µL）加入8联管中。加样顺序如下：样本（第1管）、洗涤后的磁珠（第2管）、ES洗涤液（第3、4、5管）和洗脱液（第7管）。第6管和第8管保持空置。
      2. 将6.4.9.1步骤中的8联管条放置到ES上。安装移液器吸头和新的0.2 mL离心管，然后启动程序。
        注意：确保移液操作正常。
    10. 富集完成后，洗涤球形颗粒。
      1. 将6.4.9.2步骤中的0.2 mL离心管在15,500 x g下离心5分钟 g弃去上清液，保留10 µL富集产物。向离心管中加入200 µL无核酸酶水，涡旋混匀。
      2. 将0.2 mL离心管以15,500 x g离心5分钟 g弃去上清液，保留10 µL富集产物。向管中加入90 µL无核酸酶水，涡旋混匀。
  5. 模板制备
    1. 涡旋振荡阳性对照并短暂离心。取5 µL阳性对照加入100 µL模板（步骤6.4.10.2的富集产物）中。涡旋混匀后，在15,500 x g离心5分钟。 g弃去上清液，保留10 µL模板。
    2. 加入20 µL测序引物（材料表）以及 15 µL 退火缓冲液（annealing buffer）材料表) 加入步骤 6.5.1 的模板管中。涡旋混匀，然后在小型离心机上短暂离心 3 秒。
    3. 将6.5.2步骤中的离心管放入带加热盖的PCR仪中孵育。运行以下程序：95 °C 2分钟，37 °C 2分钟，4 °C 保存。
    4. 加入10 µL上样缓冲液（材料表从步骤 6.5.3 中将溶液加入试管中。用移液器上下吹打混匀。
  6. 测序仪初始化
    1. 检查氮气罐压力（总压力 ≥ 500 psi，输出压力 ≥ 10 psi，最佳为 20–30 psi）。向 C1 和 C2 管中各加入 100 mL 去离子水（18.2 MΩ）材料表）并将其安装到测序仪上相应的 C1 和 C2 位置。
    2. 制备W1（32 µL 1 M NaOH）和W3（40−50 mL W3缓冲液[材料表]) 溶液。通过加入 1920 mL 去离子水（18.2 MΩ）和一整瓶 W2 缓冲液来配制 W2 溶液（材料表）以及 8−12 µL 的 1 M NaOH，倒置混匀 4−8 次。
      注意：由于水质因地质差异而异，需根据实际情况调整1 M NaOH的加入体积。W2的起始pH为5.9−6.1，调节后的最佳pH范围为7.4−7.6。更换并安装新的试剂管，使用最近用过的芯片进行清洗。
    3. 从测序补充试剂盒中准备4个新的空管（材料表）。将4个离心管分别标记为dGTP、dCTP、dATP和dTTP，并向各管中分别加入70 µL的dGTP、dCTP、dATP或dTTP（材料表）加入对应的离心管中（例如，70 µL dGTP 加入标记为 dGTP 的管中，以此类推）。使用前充分涡旋振荡混匀。将各离心管安装至测序仪上指定的位置材料表).
  7. 芯片洗涤
    1. 清洗芯片（材料清单通过向芯片的加样孔中注入 100 µL 异丙醇，冲洗一次。从相对的孔中移除排出的液体。
    2. 用移液器向芯片的加样孔中注入 100 µL 无核酸酶水，清洗芯片两次。从对侧孔中移除排出的液体。
    3. 用100 µL的0.1 M NaOH注入芯片加样孔，清洗芯片一次。从相对的孔中移除排出的液体。室温孵育1分钟。
    4. 用100 µL无核酸酶水注入芯片加样孔，冲洗芯片一次。从对侧孔中移除排出的液体。
    5. 用100 µL异丙醇注入芯片加样孔，清洗两次。从对侧孔中移除排出的液体。用氮气吹干芯片。避光保存。
  8. 样品上样与测序
    1. 用移液器反复吹打步骤6.5.4中的55 µL样品使其混匀，然后将样品加入芯片的加样孔中。
      注意：请保留此步骤中使用的移液器吸头和 0.2 mL PCR 管。
    2. 将芯片放入芯片小型离心机中（材料表）当
    3. 准备两个新的1.5 mL离心管，分别用于退火缓冲液和冲洗液。通过将500 µL退火缓冲液与500 µL无核酸酶水混合，制备50%退火缓冲液。通过将500 µL退火缓冲液与500 µL 100%异丙醇混合，制备冲洗液。
    4. 准备两个新的1.5 mL离心管，通过混合49 µL 50%退火缓冲液与1 µL起泡溶液来配制起泡混合液（材料清单）加入两个试管中。
    5. 将移液器调至100 µL。从步骤6.8.4中的两个试管之一取泡沫混合液，通过吸取空气产生气泡。制作泡沫。 > 120 µL 气泡，并持续移液直至无明显可见气泡。将 120 µL 气泡加入上样孔中。
      注意：确保无任何可见气泡残留，否则需重新操作。
    6. 将步骤6.8.5中从出口孔排出的过量液体用移液器转移至加样孔。避免吸入气泡。将芯片置于芯片迷你离心机中离心30秒。
    7. 使用步骤 6.8.4 中含发泡混合物的第二根试管，重复步骤 6.8.5。
    8. 向第6.8.1步中保存的0.2 mL离心管中加入55 µL 50%退火缓冲液。使用第6.8.1步中保留的移液枪头上下吹打混匀。将全部55 µL退火缓冲液加入加样孔中。将芯片置于指定的芯片迷你离心机中离心30 s。
    9. 将100 µL冲洗液加入芯片加样孔中，并弃去出口孔中排出的液体。重复此加样步骤一次。
      注意：如果芯片中有气泡，可通过大气泡排出小气泡，并用冲洗液冲洗。具体操作为：使用移液器吸取100 µL冲洗液，并在冲洗液下方保留5 µL空气。因此，当将105 µL液体注入芯片时，空气会形成一个大气泡，从而将小气泡排出，随后该大气泡可被后续的冲洗液排出。
    10. 将100 µL的50%退火缓冲液加入芯片上样孔中。重复此上样步骤，共进行3次。
    11. 将6 µL测序酶加入60 µL的50%退火缓冲液中，置于新的1.5 mL离心管内。用移液器吹打混匀。将65 µL该混合溶液加入芯片加样孔中。缓慢移液以避免产生气泡。
    12. 将芯片避光，室温孵育5分钟。
    13. 孵育结束后，立即将芯片加载到测序仪上并点击 启动测序运行 在屏幕上点击以开始测序。
      注意：测序原始数据和质量控制文件将自动上传至公司用于数据分析。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

基于此改进后的方案，半导体测序平台首次被应用于胚胎植入前非整倍体遗传学检测（PGT-A）。我们对来自卵裂期卵裂球和囊胚期胚胎的活检样本进行了测试。建议活检细胞应尽快进行全基因组扩增（WGA），以防止DNA降解。先前一项研究比较了不同WGA方法的性能，结果表明，本文所述方法在100 KB的bin大小下具有最佳的扩增均一性20。综合考虑扩增均一性及中位绝对成对差异（MAPD）21的表现，本研究选择该WGA方法用于半导体测序仪的PGT-A检测。通过对186个卵裂期胚胎和1135个囊胚期胚胎进行回顾性统计分析，我们观察到卵裂球样本的WGA成功率为95.4%，囊胚样本的成功率为96.9%（图1）。文库构建前的纯化步骤作为片段大小选择过程，对于测序质量至关重要，因其可有效富集较大的DNA片段。此外，该步骤有助于实现文库构建所需的300 ng输入量。酶法片段化方法可将WGA产物高效剪切至约160 bp。

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

与其他测序化学方法不同，此处描述的测序仪采用半导体技术检测核苷酸。该芯片本身是一种电子器件，可通过聚合酶介导的碱基掺入过程检测氢离子17，从而实现质子测序仪（Proton）2−4小时的测序时间。此外，该芯片为微孔芯片，可实现单个靶分子的定位，这与其他测序仪供应商采用的流动池测序化学方法不同。本方案是为植入前非整倍体遗传学检测（PGT-A）应用而优化的改良方案。优化内容包括：采用酶法而非超声处理对扩增后的DNA进行片段化，以降低污染风险，以及优化片段筛选和PCR体系，以在降低成本的同时获得更佳性能。此外，在临床应用中，我们使用经过验证的内部流程进行变异检测。

在操作过程中需注意若干关键步骤。用于纯化的乙醇必须在实验前新鲜配制，因为乙醇浓度过高会导致污染DNA洗涤不充分，而浓度过低则会引起目标DNA的损失。荧光计必须使用已知浓度的阳性对照进行校准，以确保检测结果的准确性。此外，模板的充分加载对测序至关重要。适当大小的气泡有助于推动模板微珠进入微孔，但气泡过大可能导致加载不充分。用户可根据需要调整每次运行所测序的样本数量（不一定为24个）。...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究得到了中国香港地区的一般研究基金（编号：14162417）、国家自然科学基金委员会（编号：81860272）、广西壮族自治区科学技术基金重大研究计划（编号：AB16380219）以及中国博士后科学基金（编号：2018M630993）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
PCR管，0.2 mLAxygenPCR-02D-C
UltraPure 0.5M EDTA，pH 8.0ThermoFisher15575020
PBS，pH 7.4，不含Ca2+和Mg2+ThermoFisher10010023
1.0 M NaOH (1.0N) 溶液SIGMA-ALDRICHS2567用于熔解溶液。分子级
Eppendorf LoBind 管，1.5 mLFisher Scientific13-698-791
Ion Plus Fragment 文库构建试剂盒ThermoFisher4471252
ELGA PURELAB Flex 3 水纯化系统或
等效的18 MΩ水系统		ThermoFisher4474524
Ion Plus Fragment 文库构建试剂盒ThermoFisher4471252
PicoPLEX WGA 扩增缓冲液Rubicon GenomicsR30050可由SurePlex DNA扩增系统替代，货号：PR-40-415101-03。
PicoPLEX WGA 扩增酶Rubicon GenomicsR30050可由SurePlex DNA扩增系统替代，货号：PR-40-415101-03。
Ion OneTouch 扩增板包含于试剂盒：Ion OneTouch 2 Supplies（部件号 A26367）。扩展试剂盒组件见表5
Ion PI 退火缓冲液
MyOne 磁珠捕获溶液
Agilent 2100 生物分析仪仪器AgilentG2939AA
Ion OneTouch 裂解溶液（黑色盖）包含于试剂盒：Ion PI Hi?Q OT2 Solutions 200（部件号 A26429）。扩展试剂盒组件见表5
Dynabeads MyOne 链霉亲和素C1磁珠ThermoFisher65001
PicoPLEX WGA 细胞裂解缓冲液Rubicon GenomicsR30050可由SurePlex DNA扩增系统替代，货号：PR-40-415101-00。
PicoPLEX WGA 细胞裂解酶Rubicon GenomicsR30050可由SurePlex DNA扩增系统替代，货号：PR-40-415101-03。
Ion PI 芯片试剂盒 v3ThermoFisherA26771
Ion Chip Minifuge，230 VThermoFisher4479673
Ion PI dATPThermoFisherA26772
Ion PI dCTPThermoFisherA26772
Ion PI dGTPThermoFisherA26772
Ion Plus Fragment 文库构建试剂盒ThermoFisher4471252
Ion Plus Fragment 文库构建试剂盒ThermoFisher4471252
ThermoQ–温度干浴器TAMARHB-T2-A
NEBNext 双链DNA片段化酶New England BiolabsM0348L
NEBNext 双链DNA片段化酶New England BiolabsM0348L
Ion PI dTTPThermoFisherA26772
Ion OneTouch 2 仪器ThermoFisherINS1005527ThermoFisher 货号：4474778。
Ion Plus Fragment 文库构建试剂盒ThermoFisher4471252
Ion One Touch ESThermoFisher8441-22ThermoFisher 货号：4469495。扩展试剂盒组件见表5
乙醇SIGMA-ALDRICH51976可由任意品牌的分子级无水乙醇替代。
PicoPLEX WGA 提取酶稀释缓冲液Rubicon GenomicsR30050可由SurePlex DNA扩增系统替代，货号：PR-40-415101-01。
PicoPLEX WGA 提取酶稀释缓冲液Rubicon GenomicsR30050可由SurePlex DNA扩增系统替代，货号：PR-40-415101-02。
Qubit 3.0 荧光计ThermoFisherQ33216该型号已被Qubit 4 荧光计替代，货号：Q33226。
Qubit ds DNA HS 检测试剂盒ThermoFisherM2002-02
Qubit 检测管ThermoFisherQ32856
Ion PI 起泡溶液ThermoFisherA26772
文库加标签用索引BaseCare为实验室自制索引。用户可购买ThermoFisher的Ion Xpress Barcode Adapters试剂盒（货号：4474517）作为商业产品。
Ion PI 上样缓冲液ThermoFisherA26772
Solid(TM) 缓冲液试剂盒-1X 低TE缓冲液ThermoFisher4389764
Agencourt AMPure XP 试剂盒Beckman CoulterA63880
DynaMag-2 磁力架（磁性支架）ThermoFisher12321D
Ion PI Master Mix PCR 缓冲液
Sorvall Legend Micro 17 微型离心机Micro 1775002430
Ion Plus Fragment 文库构建试剂盒ThermoFisher4471252
无核酸酶水ThermoFisherAM9922可由其他品牌替代。
PicoPLEX WGA 无核酸酶水Rubicon GenomicsR30050可由SurePlex DNA扩增系统替代，货号：PR-40-415101-03。
Ion OneTouch 油瓶Ion PI Hi?Q OT2 Solutions 200（部件号 A26429）。扩展试剂盒组件见表5
Ion Plus Fragment 文库构建试剂盒ThermoFisher4471252扩展试剂盒组件见表3
双链DNA标准品为实验室自制的DNA标准品，用于文库定量前Qubit的校准。
PicoPLEX WGA 预扩增缓冲液Rubicon GenomicsR30050可由SurePlex DNA扩增系统替代，货号：PR-40-415101-03。
PicoPLEX WGA 预扩增酶Rubicon GenomicsR30050可由SurePlex DNA扩增系统替代，货号：PR-40-415101-03。
文库扩增引物混合液ThermoFisher4471252扩展试剂盒组件见表3
Ion OneTouch 反应滤器扩展试剂盒组件见表5
回收路由装置扩展试剂盒组件见表5
回收管扩展试剂盒组件见表5
ISP 重悬溶液
Ion ProtonThermoFisherDA8600该型号由中山大学达安基因有限公司从ThermoFisher进口，并已获得中国食品药品监督管理局的临床应用认证。ThermoFisher目录号为4476610。
Ion PI Hi?Q 测序聚合酶ThermoFisherA26772
Ion PI 测序引物
测序仪服务器LenovoT260
Ion PI 球形颗粒
Platinum PCR SuperMix High FidelityThermoFisher4471252
Nalgene 25 mm 注射器滤器ThermoFisher724-2045孔径：0.45μm。专用于水性液体。
Ion PI Hi?Q W2 溶液ThermoFisherA26772
Ion PI 1X W3 溶液ThermoFisherA26772
Ion OneTouch 洗涤溶液 C1
The Ion PGM Hi?Q View 测序试剂盒ThermoFisherA30044扩展试剂盒组件见表2
Ion Plus Fragment 文库构建试剂盒ThermoFisher4471252扩展试剂盒组件见表3
Ion PI Hi-Q 测序200试剂盒（每次初始化支持一次测序运行）ThermoFisherA26772扩展试剂盒组件见表4
Ion PI Hi?Q OT2 200 试剂盒ThermoFisherA26434扩展试剂盒组件见表5

参考文献

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