线粒体呼吸对生物体的存活至关重要，因此，耗氧速率是衡量线粒体健康状况的理想指标。在本实验方案中，我们描述了如何使用市售的呼吸测定仪，来测量活体、完整且自由运动的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的基础和最大耗氧速率。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
线粒体功能的正常发挥对于细胞的健康活动至关重要，尤其是在神经系统和肌肉等高能量需求的细胞中。与此一致，线粒体功能障碍已被广泛关联于多种神经退行性疾病以及整体衰老过程。 秀丽隐杆线虫 一直是阐明线粒体功能多种复杂机制的有力模型系统。线粒体呼吸是评估线粒体功能的重要指标，而近年来开发的呼吸测定仪为测量细胞呼吸提供了先进的技术平台。在本方案中，我们提供了一种用于分析活的、完整的 秀丽隐杆线虫该方案历时约7天，包括以下步骤：（1）细胞的培养与同步化 秀丽隐杆线虫， (2) 准备 待注射化合物的准备及探针的水化，(3) 药物装载与色谱柱平衡，(4) 线虫检测板的制备与检测运行，以及(5) 实验后数据分析。
引言
三磷酸腺苷（ATP）是细胞能量的主要来源，由位于线粒体内膜上的电子传递链（ETC）中的酶在线粒体内产生。丙酮酸是用于线粒体ATP生成的关键代谢物，被导入线粒体基质后脱羧生成乙酰辅酶A（CoA）。随后，乙酰CoA进入柠檬酸循环，生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），后者是一种关键的电子载体分子。当来自NADH的电子通过ETC传递至氧气时，质子在线粒体膜间隙中积累，从而在线粒体内膜两侧形成电化学梯度。这些质子随后将通过ATP合酶的质子通道，顺着该电化学梯度从膜间隙回流至线粒体基质，驱动ATP合酶旋转并合成ATP1（图1）。
线粒体功能不仅限于能量生成，还在钙稳态、活性氧（ROS）清除以及细胞凋亡中发挥关键作用，因此在机体健康中具有至关重要的地位2。可通过多种检测方法评估线粒体功能，包括但不限于线粒体膜电位、ATP和ROS水平以及线粒体钙离子浓度的测定。然而，这些检测仅能提供线粒体功能的单一时间点信息，因此可能无法全面反映线粒体的健康状况。由于ATP生成过程中的耗氧依赖于一系列连续反应，耗氧量因而成为评估线粒体功能的更优指标。有趣的是，已有研究观察到线粒体功能障碍会导致耗氧速率发生改变3,4,
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
注意：图2 提供了完整实验方案的示意图。
1. 线虫种群的培养与同步化9,10
- 将所需遗传背景的L4期幼虫（例如N2［野生型］和sel-12动物）转移至线虫生长培养基（NGM）平板上（参见 表1 用于配方）新鲜涂布成菌苔的 大肠杆菌 OP5011使用至少两个100 mm或三个60 mm的培养板，每种菌株分别接种。将线虫在适当的生长温度（15–25 °C）下培养3–4天，或直至培养板上出现大量虫卵和成年雌性成虫。
- 用约6 mL M9缓冲液冲洗培养皿上的卵和线虫（参见 表1 每100 mm培养皿的线虫加入适量配方缓冲液，用玻璃巴斯德吸管将线虫转移至对应菌株的15 mL离心管中。以6,180 x g离心3分钟，吸除M9缓冲液，仅保留线虫和虫卵沉淀。
- 加入3–4 mL漂白剂溶液（参见 表1 将配方所需试剂加入各管，间歇性涡旋振荡6分钟。加入M9缓冲液至每管满管，于6,180 × g离心1分钟，吸除上清液。用M9缓冲液重复洗涤三次，将虫卵沉淀转移至一支新的15 mL离心管中，管内预先....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
根据本文所述方案，测定了野生型动物及三种不同 sel-12 突变株的耗氧率（OCR）。sel-12 编码 C. elegans 中早老素的同源蛋白17。人类早老素基因的突变是家族性阿尔茨海默病最常见的遗传异常18。我们的研究显示，与野生型动物相比，sel-12 突变株动物的线粒体钙水平升高3。由于钙稳态失调可能导致线粒体功能异常3,19,20，因此测定 sel-12 突变株与野生型动物的OCR，以评估 sel-12 突变对线粒体功能与健康的影响。野生型动物的基础OCR水平始终低于5 pmol/min/worm，而三种 sel-12<.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
线粒体呼吸是反映线粒体功能的重要指标，因此能够测量生物系统（无论体外或体内）的氧气消耗速率具有很高的研究价值。呼吸测定仪通过基于卟啉的磷光物质感应氧浓度，该磷光物质会被氧气淬灭，或者通过安培法氧传感器检测与氧分压成比例的电流变化来实现检测。克拉克电极（Clark electrode）属于后一种类型，在文献中被广泛使用，尤其是在分析秀丽隐杆线虫（C. elegans）呼吸时。然而，安培法氧传感器需要较大的样本量，并且无法同时检测多个样本，因此效率较低。
本方案提供了一种简单的方法，用于测量活体完整细胞中的耗氧率（OCR） C. elegans 无需分离线粒体，因为该过程可能影响线粒体膜电位，从而影响耗氧率（OCR）。鉴于动物在不同生命阶段表现出不同的OCR，本方案中所使用的动物应进行年龄同步化处理。与成年动物相比，年轻动物的OCR较低，且随着动物进一步衰老，OCR水平可能再次下降3. 秀丽隐杆线虫 也通过使用FUdR进行消毒，以确保后代的存在不会干扰OCR的测定。然而，如果需要检测不.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨感谢 Kevin Bittman 博士在实验室建立 Seahorse XFp 过程中的指导。本研究工作由美国国立卫生研究院资助项目 GM088213 支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100 mm、60 mm 培养皿 | Kord-Valmark Labware Products | 2900, 2901 | |
| 1.5 mL 离心管 | Globe Scientific | 6285 | |
| 15 mL 锥形管 | Corning | 430791 | |
| 22 × 22 mm 盖玻片 | Globe Scientific | 1404-10 | |
| 50 mL 锥形管 | Corning | 430829 | |
| 琼脂 | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| 蛋白胨（Bacto peptone） | BD, Bacto | 211677 | |
| 胰蛋白胨（Bacto tryptone） | BD, Bacto | 211705 | |
| 酵母提取物（Bacto yeast extract） | BD, Bacto | 212705 | |
| 次氯酸钠溶液（漂白剂） | 通用 | ||
| 二水合氯化钙（CaCl2·2H2O） | Fisher Scientific | C79-500 | |
| 羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙（FCCP） | Abcam | ab120081 | |
| 胆固醇 | Fisher Scientific | C314-500 | |
| 去离子水（dH2O） | |||
| 二甲基亚砜（DMSO） | Thomas Scientific | C987Y85 | |
| 玻璃巴斯德吸管 | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
| 七水合硫酸镁（MgSO4·7H2O） | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| 磷酸氢二钾（K2HPO4） | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| 磷酸二氢钾（KH2PO4） | Fisher Scientific | P285-500 | |
| 氯化钠 | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| 氢氧化钠（NaOH） | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| 无水磷酸氢二钠（Na2HPO4） | Fisher Scientific | BP332-1 | |
| Seahorse XFp 分析仪 | Agilent | ||
| Seahorse XFp 试剂包（FluxPak） | Agilent | 103022-100 | |
| 叠氮化钠 | Sigma-Aldrich | S2002 |
参考文献
- Nelson, D. L., Cox, M. M. Ch. 19. Lehninger Principles of Biochemistry. Ahr, K. , W. H. Freeman and Company. 707-772 (2008).
- Marchi, S., et al. Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death. Cell Calcium. 69, 62-72 (2018).
- Sarasija, S., et al.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
