线粒体呼吸对生物体的存活至关重要，因此，耗氧速率是衡量线粒体健康状况的理想指标。在本实验方案中，我们描述了如何使用市售的呼吸测定仪，来测量活体、完整且自由运动的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的基础和最大耗氧速率。
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摘要
摘要
线粒体功能的正常发挥对于细胞的健康活动至关重要，尤其是在神经系统和肌肉等高能量需求的细胞中。与此一致，线粒体功能障碍已被广泛关联于多种神经退行性疾病以及整体衰老过程。 秀丽隐杆线虫 一直是阐明线粒体功能多种复杂机制的有力模型系统。线粒体呼吸是评估线粒体功能的重要指标，而近年来开发的呼吸测定仪为测量细胞呼吸提供了先进的技术平台。在本方案中，我们提供了一种用于分析活的、完整的 秀丽隐杆线虫该方案历时约7天，包括以下步骤：（1）细胞的培养与同步化 秀丽隐杆线虫， (2) 准备 待注射化合物的准备及探针的水化，(3) 药物装载与色谱柱平衡，(4) 线虫检测板的制备与检测运行，以及(5) 实验后数据分析。
引言
三磷酸腺苷（ATP）是细胞能量的主要来源，由位于线粒体内膜上的电子传递链（ETC）中的酶在线粒体内产生。丙酮酸是用于线粒体ATP生成的关键代谢物，被导入线粒体基质后脱羧生成乙酰辅酶A（CoA）。随后，乙酰CoA进入柠檬酸循环，生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），后者是一种关键的电子载体分子。当来自NADH的电子通过ETC传递至氧气时，质子在线粒体膜间隙中积累，从而在线粒体内膜两侧形成电化学梯度。这些质子随后将通过ATP合酶的质子通道，顺着该电化学梯度从膜间隙回流至线粒体基质，驱动ATP合酶旋转并合成ATP1（图1）。
线粒体功能不仅限于能量生成，还在钙稳态、活性氧（ROS）清除以及细胞凋亡中发挥关键作用，因此在机体健康中具有至关重要的地位2。可通过多种检测方法评估线粒体功能，包括但不限于线粒体膜电位、ATP和ROS水平以及线粒体钙离子浓度的测定。然而，这些检测仅能提供线粒体功能的单一时间点信息，因此可能无法全面反映线粒体的健康状况。由于ATP生成过程中的耗氧依赖于一系列连续反应，耗氧量因而成为评估线粒体功能的更优指标。有趣的是，已有研究观察到线粒体功能障碍会导致耗氧速率发生改变3,4,5。
活体样品的耗氧率（OCR）可通过多种技术进行测量，这些技术 broadly 可分为两大类：安培法氧气传感器和基于卟啉的磷光探针，后者可被氧气淬灭6。安培法氧气传感器已被广泛用于培养细胞、组织以及模式生物（如 C. elegans）中 OCR 的测定。然而，含有基于卟啉磷光探针的呼吸测量仪具有以下优势：（1）可同时对两个样品进行三复孔平行比较；（2）所需样品量更小（例如每孔仅需约 20 条线虫，而传统腔室法需约 2,000−5,000 条）7；（3）呼吸测量仪可程序化控制，在实验过程中于指定时间点自动完成最多四种化合物的注射，无需手动加样。
本方案描述了使用基于卟啉的氧传感呼吸仪测量活体完整秀丽隐杆线虫（C. elegans）耗氧率（OCR）的步骤。 尽管已有针对大型高通量呼吸仪的书面方案8，但本方案已针对一种成本更低、更易获取且规模更小的仪器进行了优化。该方案特别适用于比较两种品系之间的OCR差异，当无需进行高通量筛选时，使用本方案更为合适，避免了高通量方法的过度使用。
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方案
注意：图2 提供了完整实验方案的示意图。
1. 线虫种群的培养与同步化9,10
- 将所需遗传背景的L4期幼虫（例如N2［野生型］和sel-12动物）转移至线虫生长培养基（NGM）平板上（参见 表1 用于配方）新鲜涂布成菌苔的 大肠杆菌 OP5011使用至少两个100 mm或三个60 mm的培养板，每种菌株分别接种。将线虫在适当的生长温度（15–25 °C）下培养3–4天，或直至培养板上出现大量虫卵和成年雌性成虫。
- 用约6 mL M9缓冲液冲洗培养皿上的卵和线虫（参见 表1 每100 mm培养皿的线虫加入适量配方缓冲液，用玻璃巴斯德吸管将线虫转移至对应菌株的15 mL离心管中。以6,180 x g离心3分钟，吸除M9缓冲液，仅保留线虫和虫卵沉淀。
- 加入3–4 mL漂白剂溶液（参见 表1 将配方所需试剂加入各管，间歇性涡旋振荡6分钟。加入M9缓冲液至每管满管，于6,180 × g离心1分钟，吸除上清液。用M9缓冲液重复洗涤三次，将虫卵沉淀转移至一支新的15 mL离心管中，管内预先加入约9 mL M9缓冲液。
- 将新孵化的线虫在20 °C下旋转孵育16–48 h以实现同步化。在6,180 x g下离心1.5 min，将同步化的L1期动物转移至预先接种了OP50菌苔的新鲜NGM平板上（每块100 mm平板约放置6,000–10,000条动物），每块平板单独放置，并于20 °C培养。
- 这些动物将在约42小时后发育至L4幼虫阶段。此时，使用铂金接种针将L4幼虫转移至接种了OP50并含有0.5 mg/mL 5-氟-2'-脱氧尿苷（FUdR）的NGM平板上，以防止其产生后代。
注意：确保实验中所有品系的同步化时间相同。氟脱氧尿苷（FUdR）处理会使动物不育，阻止产卵和子代产生，这可能影响耗氧率（OCR）。经FUdR处理的不育动物将在次日（成虫第1天，约66小时）用于检测。已有报道指出，FUdR可能影响某些突变型线虫的生理状态和寿命。因此，在使用该药物进行不育处理时，应充分考虑其潜在影响。12,13,14线虫也可通过雌性化突变（如 fem-1(hc17) 或 fem-3(e2006)）实现无菌化。然而，这些突变可能影响线粒体功能。
2. 准备 待注射化合物及探针的水合
注意：在实验过程中，会同时测量线虫的基础呼吸速率和最大呼吸速率。加入解偶联离子载体羰基氰化物-4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP）后，可触发动物的最大呼吸，FCCP 能通过线粒体膜转运质子，破坏线粒体膜电位，从而抑制 ATP 合成，但同时仍允许质子泵送、电子传递和耗氧过程继续进行，且这些过程与 ATP 合成解偶联4,15（图 1）。实验的最后一步是加入叠氮化钠（NaN3），这是一种可抑制电子传递链中复合物 IV 和 V 的药物，用于测定非线粒体呼吸16（图 1）。以下步骤可在正式实验前一天完成。
- 配制1 mL的FCCP储备液（10 mM，溶于二甲基亚砜[DMSO]，为最终检测浓度的1000倍）和NaN3储备液（400 mM，溶于dH2O，为最终检测浓度的10倍），并于-20 °C保存。
注意：应进行浓度梯度实验，以优化每台仪器和实验室条件下诱导最大OCR反应所需的FCCP浓度。 - 通过向微孔板的每个孔（及周围储液区）加入200 µL的dH2O来水合传感器 cartridge，确保传感器探头完全浸没于dH2O中，并在室温下静置过夜。
注意：传感器探头可浸没最多72小时；若水合时间较长，应使用石蜡膜包裹微孔板并置于4 °C保存。若无法过夜水合，则检测前至少需水合4小时。 - 关闭呼吸测定仪接口中的加热元件，并将仪器置于15 °C培养箱中过夜，以降低仪器内部核心温度，防止检测过程中线虫过热。
注意：呼吸测定仪配备有加热元件，但不具备冷却功能。在15 °C培养箱内，仪器温度可稳定维持在18–22 °C之间，此温度范围适合C. elegans的正常维持。
3. 药物装载与柱平衡
- 用移液器吸出并弃去用于水化传感器探针的 dH2O，每孔加入 200 µL 校准液（pH 7.4）。将 FCCP 储存液用 dH2O 稀释至 100 µM FCCP，并向传感器微孔板的加样口 A 中加入 20 µL 稀释后的溶液。向传感器微孔板的加样口 B 中加入 22 µL 400 mM 叠氮化钠。
- 打开呼吸仪，在主界面选择 开始，模板页面将出现。在模板页面中选择 空白 或先前设计好的模板，分组页面将出现。在分组页面中，将 A 和 H 孔设为背景孔，并根据实验计划将剩余的 6 个孔分配到适当的组别中。
- 点击右下角的箭头进入方案页面。在方案页面中，确保已选中 平衡、基础 以及 加样 1 和 2 按钮。在此页面上，调整基础耗氧率（OCR）的读数次数，以及加样 1（FCCP）后的最大 OCR 和加样 2（叠氮化钠）后的非线粒体 OCR。
注意：每次测量前均包含混合与等待步骤，这些参数的时间范围见 表 2。 - 点击右下角的箭头，系统将提示加载传感器微孔板。确保按照提示屏幕上的说明，以正确的方向装入传感器微孔板。呼吸仪将开始对微孔板进行平衡。
注意：此平衡过程提供了充足的时间，可用于将待检测的动物放入细胞板的相应孔中。
4. 蛔虫平板的制备与实验运行
- 向细胞板的8个孔以及孔周围的储液槽中各加入200 µL M9缓冲液。
- 从每种品系中挑取约100条线虫至未接种的NGM平板上，静置2–3分钟。将铂金接种针末端蘸取M9缓冲液，然后将20条年龄同步化的线虫转移至B–G孔中，A孔和H孔作为空白对照，不加线虫。
注意：每加载一个孔后，需等待约2分钟，使线虫沉降至孔底。建议各实验室和仪器应预先进行线虫数量梯度实验，以优化每孔线虫数量。 - 此时，呼吸仪应已完成校准，点击屏幕上的OK后，含有校准缓冲液的板将被弹出，可将其从呼吸仪中取出，而传感器盒仍保留在仪器内部。将校准板替换为含有线虫的检测板，加载新板后点击Continue关闭仪器门，开始检测。
5. 实验后数据分析
- 实验运行完成后，按照屏幕提示操作，取出细胞板和传感器盒，并将U盘插入USB端口，以.war格式保存运行数据。移除传感器盒后，让动物沉降至孔底约2分钟。将细胞板置于体视显微镜下，计数每孔中的动物数量。
- 在计算机上打开分析软件，进入归一化选项卡，将OCR数据按动物数量进行归一化处理。在“修改”选项卡下为各实验组添加适当的标签，并将文件导出为Prism格式文件以供进一步分析。
注意：在加入FCCP之前的前五次测量值的平均值为基础OCR，加入FCCP之后五次测量值的平均值为最大OCR，加入叠氮化钠后最后五次测量值的平均值（至少应进行两次测量）为非线粒体呼吸速率。为确保可重复性，该实验应重复三次。
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结果
根据本文所述方案，测定了野生型动物及三种不同 sel-12 突变株的耗氧率（OCR）。sel-12 编码 C. elegans 中早老素的同源蛋白17。人类早老素基因的突变是家族性阿尔茨海默病最常见的遗传异常18。我们的研究显示，与野生型动物相比，sel-12 突变株动物的线粒体钙水平升高3。由于钙稳态失调可能导致线粒体功能异常3,19,20，因此测定 sel-12 突变株与野生型动物的OCR，以评估 sel-12 突变对线粒体功能与健康的影响。野生型动物的基础OCR水平始终低于5 pmol/min/worm，而三种 sel-12<...
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讨论
线粒体呼吸是反映线粒体功能的重要指标，因此能够测量生物系统（无论体外或体内）的氧气消耗速率具有很高的研究价值。呼吸测定仪通过基于卟啉的磷光物质感应氧浓度，该磷光物质会被氧气淬灭，或者通过安培法氧传感器检测与氧分压成比例的电流变化来实现检测。克拉克电极（Clark electrode）属于后一种类型，在文献中被广泛使用，尤其是在分析秀丽隐杆线虫（C. elegans）呼吸时。然而，安培法氧传感器需要较大的样本量，并且无法同时检测多个样本，因此效率较低。
本方案提供了一种简单的方法，用于测量活体完整细胞中的耗氧率（OCR） C. elegans 无需分离线粒体，因为该过程可能影响线粒体膜电位，从而影响耗氧率（OCR）。鉴于动物在不同生命阶段表现出不同的OCR，本方案中所使用的动物应进行年龄同步化处理。与成年动物相比，年轻动物的OCR较低，且随着动物进一步衰老，OCR水平可能再次下降3. 秀丽隐杆线虫 也通过使用FUdR进行消毒，以确保后代的存在不会干扰OCR的测定。然而，如果需要检测不...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨感谢 Kevin Bittman 博士在实验室建立 Seahorse XFp 过程中的指导。本研究工作由美国国立卫生研究院资助项目 GM088213 支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100 mm、60 mm 培养皿 | Kord-Valmark Labware Products | 2900, 2901 | |
| 1.5 mL 离心管 | Globe Scientific | 6285 | |
| 15 mL 锥形管 | Corning | 430791 | |
| 22 × 22 mm 盖玻片 | Globe Scientific | 1404-10 | |
| 50 mL 锥形管 | Corning | 430829 | |
| 琼脂 | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| 蛋白胨（Bacto peptone） | BD, Bacto | 211677 | |
| 胰蛋白胨（Bacto tryptone） | BD, Bacto | 211705 | |
| 酵母提取物（Bacto yeast extract） | BD, Bacto | 212705 | |
| 次氯酸钠溶液（漂白剂） | 通用 | ||
| 二水合氯化钙（CaCl2·2H2O） | Fisher Scientific | C79-500 | |
| 羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙（FCCP） | Abcam | ab120081 | |
| 胆固醇 | Fisher Scientific | C314-500 | |
| 去离子水（dH2O） | |||
| 二甲基亚砜（DMSO） | Thomas Scientific | C987Y85 | |
| 玻璃巴斯德吸管 | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
| 七水合硫酸镁（MgSO4·7H2O） | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| 磷酸氢二钾（K2HPO4） | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| 磷酸二氢钾（KH2PO4） | Fisher Scientific | P285-500 | |
| 氯化钠 | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| 氢氧化钠（NaOH） | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| 无水磷酸氢二钠（Na2HPO4） | Fisher Scientific | BP332-1 | |
| Seahorse XFp 分析仪 | Agilent | ||
| Seahorse XFp 试剂包（FluxPak） | Agilent | 103022-100 | |
| 叠氮化钠 | Sigma-Aldrich | S2002 |
参考文献
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